Estudo

VX-765 estudo: Cinco meses de idade do veículo-injetado em PESO (WT + veículo; n = 18) e J20 ratos (J20 + veículo: n = 14), e o VX-765-injetado J20 ratos (J20 + VX-765: n = 13) os ratos foram avaliados longitudinalmente em cinco diferentes pontos de tempo: linha de base antes do tratamento (linha de base não tratada J20 foram agrupados; n = 19), após três injecções de IP por semana de VX-765 ou veículo (tratamento 1), após seis injecções adicionais durante 2 semanas (tratamento 2), após um período de washout de 4 semanas (WO) e após três injecções adicionais em 1 semana (Tratamento 3) (Fig. 1a). Todos os animais testados foram incluídos nas análises, a menos que a) o animal tenha morrido durante a experiência ou b) o animal não tenha reagido de forma comportamental. Um total de 25 ninhadas, espalhadas por quatro coortes diferentes e testadas em momentos diferentes, foram usadas. Três dessas coortes foram submetidas a testes NOR e open field, enquanto coorte 4 foi usado para Barnes maze. Após os animais terem sido testados no início do estudo para confirmar que os animais J20 apresentavam um défice comportamental, os animais J20 foram distribuídos aleatoriamente quer ao veículo quer ao tratamento VX-765, independentemente do desempenho comportamental. De todos os animais utilizados, quatro ratos J20 não apresentaram défices comportamentais no início da experiência e não foram utilizados. Dois ratos de veículos J20 + não se moveram durante a experiência e os seus dados comportamentais excluídos; no entanto, estes animais foram mantidos e ainda foram utilizados para análise post mortem.estudo de validação

Casp1: para validar os efeitos específicos do Casp1 do VX-765, os ratinhos J20 foram gerados num fundo Casp1/ Casp1. Foram utilizados setenta e três ratos (n = 12-13 por genótipo, seis genótipos diferentes), todos eles criados através de fertilização in vitro (FIV) a partir de 35 fêmeas dadoras. Os pormenores relativos à reprodução são descritos na secção “estudos em animais” a seguir. Todos os ratinhos foram avaliados comportamentalmente entre os 7 e os 8 meses de idade e nenhum animal foi excluído deste estudo.todos os ratinhos foram sacrificados e processados aos 8 meses de idade. A pontuação Comportamental foi cegada para o genótipo e o tratamento no ratinho, tendo todos os animais sido distribuídos aleatoriamente para análise bioquímica ou histológica e analisados cegamente.

VX-765, VRT-043198 IC50 ensaios em caspases recombinantes estudos em animais

todos os procedimentos em animais seguiram as orientações do Conselho canadiano em matéria de cuidados de animais e foram aprovados pelo Comité de cuidados de animais da Universidade McGill. The J20 transgenic mouse line (JAX Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) expressa o sueco (670/671KM→NL) e Indiana (717V→F) mutações de aplicações humanas sob o PDGF-ßpromoter. Ratos J20 machos foram usados como Reprodutores e seu esperma foi usado para a expansão da colônia de FIV.os genotipos

foram determinados pela biópsia da cauda e RT-PCR. Os ratos eram alojados em grupo (2-4 animais por gaiola) em gaiolas-padrão de macrólon, num ciclo reverso de 12 h de luz/escuridão e em condições ambientais controladas. Comida e água estavam disponíveis ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) foi dissolvido em 20% de cremofor em dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadá) e administrado intraperitonealmente. Os ratos J20 e WT tratados com veículos receberam apenas cremofor.

Análise de permeabilidade da barreira hemato–encefálica

J20 de cinco meses de idade e ratinhos WT foram anestesiados com Isoflurano e a artéria carótida direita foi separada. Uma pequena incisão foi feita ao longo da parede da carótida e um micro-cateter foi inserido na entrada da artéria carótida interna. O cateter foi fixado no lugar usando fio de sutura. A perfusão de VX-765 (50 mg kg−1) foi de 50 µl min−1 (volume total de 90-120 µl). O micro-cateter foi deixado um adicional de 5 minutos para permitir a difusão, após o que o sangue foi coletado por punção intra-cardíaca. O rato foi perfurado transcardiamente com soro gelado e o hipocampo e o córtex foram dissecados. Amostras foram enviadas para a plataforma biofarmacêutica (Université de Montreal) para cromatografia líquida e análise de espectrometria de massa em tandem.análise comportamental: a atividade locomotora foi medida usando um sistema de rastreamento automatizado HVS2100 (HVS Image, Hamptom, Reino Unido). Ratos foram colocados na câmara de campo aberto (caixa de Plexiglas de 40 × 40 cm, sem teto e chão branco) e autorizados a explorar por 5 minutos.

novo reconhecimento de objectos (NOR): ratos foram pré-expostos a dois objectos idênticos na câmara de campo aberto durante 5 minutos. Duas horas após a pré-exposição, os ratos foram colocados de volta na câmara e expostos a um objecto familiar e a um objecto novo durante 5 minutos. Mice were exposed to a specific object only once across different test sessions, and novel object placement was counterbalanced within each treatment group. Os toques percentuais do novo objeto durante a fase de teste e índice de discriminação (#toques novos − # toques familiares)/toques totais) foram avaliados.

Barnes maze: A Plataforma Barnes maze (91 cm de diâmetro, elevada 90 cm do chão) consiste em 20 buracos (cada 5 cm de diâmetro). Todos os buracos foram bloqueados, exceto um buraco de alvo que levou a uma caixa de escape recessada. Sinais espaciais, luz brilhante e ruído branco foram usados para motivar os ratos a encontrar a fuga durante cada sessão. Para a fase de adaptação, cada rato explorou a plataforma para 60 s. Qualquer rato que não conseguiu escapar caixa foi guiada para ele e lá permaneceu por 90 s. Para a fase de aquisição, cada ensaio seguiu o mesmo protocolo, com o objetivo de treinar cada mouse para encontrar o alvo e introduza o escape caixa dentro do prazo de 180 s. Os ratos permaneceram na caixa para um adicional de 60 s. Quatro ensaios por dia, cerca de 15 min para além, foram realizados por 4 dias consecutivos. No ensaio da sonda (dia 5), cada rato realizou um ensaio de 90 s. O alvo ainda estava na mesma posição, mas a caixa de fuga estava bloqueada. A latência e os erros para alcançar o alvo, mais o número de mouse pokes para cada um dos buracos (preferência de alvo) foram medidos. O labirinto Y era composto por um labirinto simétrico em forma de Y com três braços a 120° um do outro, designado A, B E C. animais foram colocados na extremidade distal do braço a e autorizados a explorar o labirinto por 5 minutos. Foram registadas entradas totais dos braços e alternância espontânea, definidas como entradas consecutivas em três braços diferentes. Foi determinada a alternância percentual.

processamento de tecidos

para imunohistoquímica, os ratinhos (n = 4-6 por grupo) foram anestesiados com isofluorano e transcardiamente perfundidos com solução salina gelada seguida de 4% de paraformaldeído gelado (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) em solução salina tampão de fosfato de 0,1 M. Os cérebros foram post-fixed em 10% de formalina neutra-buffer (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canadá) por 16 h E transferidos para 70% de etanol. Os cérebros estavam embebidos em parafina e seccionados a 4 µm.

para a Mancha ocidental e ELISA (n = 4-8 por grupo), os ratinhos anestesiados foram deslocados cervicamente, o hipocampo e o córtex dissecados e imediatamente congelados em gelo seco. As proteínas foram extraídas de 5× volume/peso com radioimmunoprecipitation ensaio (RIPA) tampão (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, De 0,25% Na-deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM de PMSF, 10 µl ml−1 de Proteases, Inibidores de Cocktail (Sigma-Aldrich)) sobre o gelo com um homogeneizador de tecidos (OMNI Internacional, Kennesaw, GA, EUA). As amostras foram centrifugadas (20 000 × g, 4 ° C) durante 20 minutos, o sobrenadante recuperado e as proteínas quantificadas pelo método BCA. O sedimento insolúvel em RIPA foi extraído em ácido fórmico a 70% em dH2O, evaporado e resolvido em Tris-HCl de 200 mM, pH 7.5.os Epitópios Imunohistológicos foram desmascarados em citrato (Citrato de Tris-Na de 10 mM, pH 6.0) ou EDTA (Base de Tris de 10 mM, EDTA de 1 mM, 0,05% Tween-20, pH 9.0) tampão de recuperação de antigénios, e imunostained using the Dako Autostainer Plus automated slide processor and EnVision Flex system (Dako, Burlington, ON, Canada). A seguir deparaffinization e reidratação, as seções foram peroxidase tratados, bloqueado no soro livre de proteína bloco, e immunostained com os seguintes anticorpos diluído em Imaginar Flex Diluente de Anticorpo: 1:2000 de coelho anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, EUA), 1:8000 coelho anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 de coelho anti-Aß1-40 (F25276, laboratório desenvolvido), e 1:1000 mouse antisynaptophysin (Sigma-Aldrich S5768). As secções foram tratadas com o anticorpo secundário conjugado com HRP adequado fornecido com o kit e visualizado com a DAB. As seções eram contestadas com hematoxilina, desidratadas e cobertas com permuta (Fisher Scientific). As seções foram digitalizadas com o MIRAX SCAN para análise (Zeiss, Don Mills, ON, Canadá). Após a desparafinização e rehidratação, as lâminas foram manchadas com Tioflavina-S filtrada a 1% (Sigma-Aldrich).

A análise imunohistológica quantitativa

Iba1-células positivas no córtex e parte anterior da região CA1 do hipocampo foram quantificadas usando uma versão modificada do quadro de contagem areal48. Resumidamente, cada quinto slide foi quantificado (resultando em quatro seções por cérebro). Múltiplas × 80 imagens foram tiradas com a varredura de MIRAX dentro da área de interesse e o número de células Iba1-positivas foram contadas manualmente. A densidade numérica (número de células mm−3) na região anterior da CA1 e córtex foi estimada. Um número mínimo de 150 acessos por área foram necessários para fazer uma estimativa confiável. Foram contadas secções adicionais se não conseguíssemos chegar ao nosso número mínimo. A quantificação foi efectuada em ocultação para o tratamento e genótipo. ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA) foi usado para medir a acumulação de Aß, GFAP e synaptophysin coloração imunopositiva na região CA1 e córtex. Quatro seções por cérebro foram analisadas, e várias imagens foram tiradas dentro de cada seção para cobrir a região CA1 e córtex. O limiar foi igualmente ajustado em todos os cérebros para destacar a área manchada, e as partículas foram analisadas para determinar a área total de coloração. Os resultados são expressos em superfície total manchada por área total analisada (µm2 mm−2). As imagens representativas só foram cortadas de acordo com as restrições de tamanho e não foram submetidas a qualquer pós-processamento.foram preparadas amostras de proteínas de Ratinho (25-100 µg) em Laemmli (5% 2-β-mercaptoetanol, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 de Cocktail de inibidores das Proteases (Sigma-Aldrich), cozidas durante 5 minutos e separadas por electroforese em gel de poliacrilamida (página). As amostras foram analisadas com os seguintes anticorpos primários diluídos em 5% leite em pó desnatado em solução tampão salina Tris e 0,1% de Tween-20 ou PBS (tampão de bloqueio (Thermoscientific): 1:1000 mouse anti-human Aß1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, EUA), 1:2000 coelho anti-APLICATIVO C-terminal (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 de coelho anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 coelho anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 de coelho anti-Caspase-3 (Sinalização Celular 9665), 1:1000 mouse antiactive Caspase-8 (Sinalização Celular 8592), 1:1000 de coelho anti-Caspase-9 (Sinalização Celular 9504), e 1:5000 mouse anti-β-actina (Sigma-Aldrich A5441). Foram detectados Blots com anticorpos anti-rato ligados a 1:5000 HRP (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) ou anticorpo secundário anti-coelho 1:5000 (Dako P0217) seguido de ECL (GE Amersham). As bandas imunoreativas foram visualizadas utilizando o ImageQuant LAS 4000 imaging system (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), e as análises densitométricas foram realizadas com o Image Gauge analysis software (Fujifilm USA). Brilho / contraste de blots raw foram igualmente ajustados em toda a imagem com o Software Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) para gerar imagens representativas. Não foi feita qualquer alteração adicional. CanvasTM X software (Acd system, Plantation, FL, USA) foi usado para criar figuras finais. As bolhas em bruto para blots ocidentais estão disponíveis na figura complementar 11.os níveis de Aß no cérebro do rato foram determinados utilizando kits de teste imunológico de electrochemiluminescência da Meso Scale Discovery (Rockville, MD, EUA). As normas e amostras foram preparadas de acordo com os protocolos do fabricante e executadas em duplicado. O painel pró-inflamatório do rato com dez plexos foi utilizado para o hipocampo e cortical do rato e para amostras. Foi utilizado um único kit Il-1β para medir o plasma do rato. O painel humano de quatro plexos foi utilizado para amostras HPN (ver abaixo). O kit humano de quatro painéis Aß 6E10 foi usado para o hipocampo do rato e córtex, e amostras da HPN.a extracção de ARN e a síntese de cDNA

o ARN total foi extraído do hipocampo e córtex de ratinhos (n = 3 por grupo) com Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, EUA) seguido de homogeneização com uma agulha de 20 gauge. O mini-kit miRNeasy, incluindo a fase de tratamento da DNase na coluna, foi utilizado para purificar o RNA total (Qiagen). A qualidade e a quantidade do ARN foram determinadas utilizando um espectrofotómetro (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, EUA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Os produtos foram visualizados no RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canadá) manchado 2% agarose gels. Experiências PCR em tempo Real foram realizadas com SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, EUA) em um sistema de PCR aplicado 7500 rápido em tempo Real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A amplificação do Gene foi realizada com os seguintes iniciadores: (18s) 5′ – GTAACCGTTGAACCCAT-3′ e 5 ‘- CCATCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5’ – ACTAACCTGGTGAAG-3 ‘e 5′ – GGTCTGGTATGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5’ – TCTTGTAAGCCCTCAGCC-3 ‘and 5’ – CTCCCCACAGCATTCCTCCAT-3″. Os resultados são expressos como valores de indução dobrada normalizados para HPRT médio e genes de referência 18S utilizando o método Pfaffl.

Mouse plasticidade sináptica RT2-Profiler PCR array

O mouse plasticidade sináptica RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) perfis de expressão de 84 genes envolvidos no synaptic alterações durante a aprendizagem e memória e cinco housekeeping genes (β-actina; β-2-microglobulina; glyceraldehyde 3-fosfato desidrogenase, GAPDH; β-glucuronidase, Gusb; Proteína de choque térmico 90 Alfa (citosólica), Hsp90ab1) com PCR em tempo real. O RNA Total (465 ng para cada amostra) foi transcrito reverso (que incluiu uma etapa de eliminação do DNA genômico) seguindo o protocolo do fabricante (First Strand cDNA Synthesis Kit, Qiagen). A reação PCR em tempo real foi realizada em um cycler em tempo real ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) usando a RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen). As condições de ciclismo foram as seguintes: 2 minutos a 50 ° C, 10 minutos a 95 ° C, 40 ciclos, 15 s Cada a 95 °C e 1 minuto a 60 ° C. O limiar e a linha de base foram definidos manualmente de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram normalizados à média geométrica dos cinco genes de limpeza e analisados pelo método CT comparativo (2-ΔCT).a cultura de células neuronais e o ensaio de degeneração axonal foram obtidos do Birth Defects Research Laboratory (Universidade de Washington, Seattle, EUA), em conformidade com um protocolo aprovado pelo McGill institutional review board. A HPN foi cultivada a partir de cérebros que foram dissociados com tripsina, tratados com desoxirribonuclease I, e filtrados através de 130, 70 e 30 µm de nylon mesh21. Diferenciadas, as células foram centrifugadas por 10 min a 300 × g e em suspensão em meio essencial mínimo (MEM) com sais de Earle, e suplementado com 5% de decomplemented BCS, 1× Penicilina-Estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio, e 2 mM de l-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram semeadas com uma densidade de 3×106 células ml – 1 em 5 µg mL−1 placas de cultura de seis tecidos revestidas de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich). O meio MEM foi alterado a cada 2 dias e a proliferação de astrocitos foi limitada com o tratamento antimitótico Fluorodeoxiuridince (FdU) (1 mM, Sigma) durante os primeiros 4 dias. Culturas neuronais foram cultivadas 7-10 dias antes de realizar experimentos. Quatro preparações diferentes de neurônios em diferentes momentos foram testadas. Uma das preparações de neurônios não era estável e a cultura, incluindo o Controle do soro + que não recebeu nenhuma droga, morreu no meio da experiência. Por conseguinte, foram utilizadas três preparações neuronais diferentes de três dadores geneticamente diferentes.a toxicidade por VX-765 foi avaliada com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Os neurônios foram tratados com 25-200 µM VX-765 ou 0,1% DMSO (maior concentração de DMSO usada) para 72 H. os neurônios foram então incubados com 0,5 µg ml−1 MTT (Sigma-Aldrich) para 4 h a 37 °C (5% CO2). Os cristais de formazano foram dissolvidos em 100 µl de DMSO durante 30 minutos. A absorvância foi medida a 560 e 670 nm usando o leitor de placas Synergy H4.a degeneração Axonal foi induzida quer por transfecção de APPWT quer por stress de privação sérica. O VX-765 foi administrado quer como uma estratégia de pré-tratamento (1 h antes do factor de stress) quer como uma estratégia de tratamento pós-tratamento (48 h após o factor de stress). Neurônios foram transferidos por Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canadá) com contas de ouro revestidas com pBudCE41-eGFP para visualização de fluorescência. Neurônios que estavam stressados com APPWT foram transfectados com pBudCE41-eGFP/APPWT. Brevemente, os neurónios foram tratados com meio suplementado com 25 ou 50 µM VX-765, inibidor do casp1 de 5 µM Z-YVAD-fmk, ou DMSO. Imagens fluorescentes foram tomadas a cada 24 h (até 72 h após o tratamento) com um microscópio Ti Nikon Eclipse (Nikon, Mississauga, ON, CA) e fotometrics coolSNAP HQ2 câmara CCD (Photometrics, Tucson, AZ, USA) usando elementos NIS ar 3.10 software (Nikon). O percentual de castração neuronal foi medido pela contagem do número de neurônios EGFP-positivos em contas ao número total de neurônios eGFP-positivos em cada ponto de tempo. Um mínimo de 150 neurônios eGFP positivos foi contado para cada condição. O meio condicionado foi amostrado (suplementado com 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 de Cocktail de inibidores das Proteases (Sigma-Aldrich)), e os neurónios foram colhidos em tampão de lise celular (50 mM HEPES, 0,1% Caps, 0,1 mM EDTA) para análise.

análises estatísticas

o número de animais ou experiências independentes, e análises estatísticas utilizadas (ANOVA e comparações pós-hoc) são todas indicadas nas legendas das figuras. Todos os valores são expressos como a média ± S. E. M., com os valores F E p indicados nas legendas das figuras. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA).