discussão
o presente estudo revelou um papel para a SR proteína de ligação AC luminal, CSQ2 na regulação do acoplamento excitação-contração e CICR no coração. Especificamente, nós mostramos que a sobreexpressão mediada por Ad do CSQ2 aumentou dramaticamente a magnitude de ambos os transientes induzidos por ICa com Média celular e faíscas espontâneas de Ca em células cardíacas isoladas. A análise do aumento da fase e da taxa de alteração destes Ca sinais indicaram que a sua aumentada de tamanho, foi devido à retardado rescisão do subjacentes Ca-lançamento fluxos do SR. Além de prolongar o active Ca de lançamento, a dinâmica funcional de carregamento do SR Ca lojas foram também diminuiu em células com elevada CSQ2 níveis de proteína, como indicado pela diminuiu o tempo de recuperação para repetitivo Ca faíscas. Obtivemos essencialmente os resultados opostos nos miócitos, nos quais os níveis CSQ2 foram reduzidos por transdução anti-incenso mediada por Ad. Estes miócitos apresentaram uma libertação de Ca mais curta, mas a restituição acelerada de locais de Libertação de Ca. Além disso, em miócitos periodicamente estimulados com níveis de CSQ2 diminuídos, a aplicação de isoproterenol causou oscilações arrítmicas intracelulares . Estes resultados mostram que CSQ2 é um determinante chave da função SR Ca liberando que atua governando a duração da Ca-release e a refratoridade do local de lançamento. À luz das perturbações observadas dependentes de isoproterenol no ciclismo rítmico da Ca nos miócitos subexpressores da CSQ2, os nossos resultados são relevantes para a compreensão dos mecanismos celulares das arritmias induzidas pela catecolamina ligadas às mutações do gene CSQ2.mecanismos moleculares da acção CSQ2. Atribuímos os efeitos observados do CSQ2 na libertação SR Ca à capacidade desta proteína funcionar como um tampão molecular que controla o livre no espaço SR luminal (ver esquema proposto na Fig. 5). É conhecido a partir de estudos de camadas lipídicas que a ligação de Ca ao aspecto luminal do complexo RyR (isto é, sensor de AC luminal) aumenta a atividade do canal, enquanto que a baixa do luminal , a atividade do canal é reduzida (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Uma vez que muitos RyRs estariam em um estado ativado em níveis normais de Ca luminal (≈1 mM), a diminuição do lúminal durante o processo de liberação diminuiria a atividade global do canal (um processo chamado de desativação dependente da Ca luminal; ref. 3). Nossos resultados sugerem que, ao estabilizar o local livre luminal nas imediações de RyRs durante o processo de lançamento, CSQ2 retarda o luminal Ca dependente de encerramento do RyR canal, aumentando assim a quantidade de Ca liberado do SR para o citosol. A CSQ2 também controla a dinâmica de recuperação da intra-SR livre durante a recaptação da Ca, servindo de pia para a Ca no lúmen da SR. Assim, a CSQ2 não só potencia o efluxo da SR Ca, como também estabiliza a CICR, modulando a restituição funcional, ou prontidão, dos locais de lançamento da CA após cada lançamento. Recentemente, invocamos um mecanismo semelhante para explicar os efeitos dos quelantes Ca de baixa afinidade (sais orgânicos) carregados na SR na libertação de Ca (3). A importância das nossas descobertas actuais é que elas mostram como o processo de libertação é controlado por uma proteína endógena, resida em SR-Ca, CSQ2. Eles também revelam as consequências patológicas de quantidades reduzidas de CSQ2 na SR de células cardíacas.Fig. 5.
Ilustração dos efeitos de níveis CSQ2 aumentados e reduzidos nas propriedades funcionais da loja SR Ca. O tamanho funcional das reservas SR Ca é determinado pelo nível de CSQ2. O canal SR Ca-release é positivamente controlado pelo luminal livre através do sensor luminal Ca. O aumento dos níveis CSQ2 aumenta a quantidade de Ca libertada da SR, atrasando o encerramento dos canais RyR em função do luminal. Reduzir o CSQ2 produz um efeito oposto. Após a sua descarga, O armazém SR Ca é reabastecido pela SERCA. A loja é recarregada funcionalmente quando luminal Ca é reassociada com o sensor luminal Ca. Níveis crescentes de CSQ2 prolongam o tempo necessário para recarga funcional da loja, enquanto níveis reduzidos de CSQ2 reduzem a recuperação. Nas células CSQ2-subexpressoras, os Rcyrs são propensos a ativação prematura. O aumento da actividade da SERCA por estimulação adrenérgica acelera ainda mais a recarga da loja da AC, fornecendo uma explicação para o papel das catecolaminas no desencadeamento de episódios de CPVT. JSR, JUNCTIONAL SR.
foi proposto que o CSQ2 pode afectar a função do canal de libertação de Ca através de interacções directas com proteínas que compreendem o complexo do canal de libertação de Ca (isto é, RyR, junctin e / ou triadin) (ref. 13; para revisão, ver ref. 9). Os nossos estudos não revelaram diferenças consideráveis nos parâmetros de libertação de SR Ca entre as células que contêm aproximadamente 3 vezes níveis elevados de proteína CSQ2 e as células nas quais foram carregados tampões orgânicos na SR (3). Assim, a explicação mais simples para as nossas conclusões é que os efeitos predominantes de CSQ2 no SR Ca de lançamento, devido ao buffer de ações desta proteína dentro do SR. Elucidação detalhada do mecanismo pelo qual CSQ2 e proteínas associadas, tais como junctin e triadin regular liberar deve aguardar estudos que envolvam a manipulação de níveis e expressão de formas mutantes destas proteínas com a alteração habilidades para interagir entre si e com o RyR.
a taxa máxima de Libertação de Ca dos miócitos estimulados foi semelhante independentemente das quantidades de CSQ2 expressas na SR (figos. 2B e 3D). Estes resultados suportam a noção de que CSQ2 controles término do processo de lançamento, mas os resultados não são o que seria, necessariamente, prever com base na expectativa de buffer efeitos desta proteína no SR. De fato, a taxa máxima de lançamento seria esperado para ser maior em células com maior luminal Ca-buffer de pontos fortes causados por retardou o declínio do livre intra-SR , porque, nestas células, o atraso na diminuição do Ca do gradiente de todo o SR membrana seria esperado para renderizar maior Ca fluxo de intensidades. Várias razões possíveis explicam por que isso não foi observado. Uma possibilidade é que a intra-SR livre inicial pode ser menor na CSQ2-sobreexpressing do que nas células CSQ2-subexpressing. Embora em constante estado de graça em um compartimento fechado, como o SR não deve ser influenciada pelo número de Ca-sítios de ligação (isso só deve influenciar a cinética em que estado estacionário intra-SR é atingido), é possível que um verdadeiro estado estacionário não foi alcançado em nossos experimentos (por exemplo, miócitos submetidos a baixa taxa de estimulação). Outra possibilidade é que a presença de níveis elevados de proteína CSQ2 retarda a difusão de Ca no espaço luminal, retardando assim o êxodo de Ca através dos canais abertos. É evidente que é necessário mais investigação, tanto experimental como teórica, para resolver esta questão.terminação da CICR. How CICR, a process with an inherent propensity to self-regeneration, is terminated has been a subject of intense research, first by using measurements of global Ca transitents and, more recently, by examining Ca sparks (3, 27-30). Uma possibilidade que tem sido considerada é que os canais RyR passam por inactivação ou adaptação Ca-dependente como resultado do aumento do lado citosólico do canal (27-29). Outra possibilidade é que o declínio no intra-SR fornece um sinal ativo para o fechamento dos Rcyrs após a abertura (3, 30-32). Recentemente, temos encontrado evidências experimentais diretas para um papel das alterações induzidas pela AC do luminal na atividade do RyR (isto é, desativação dependente da AC do luminal) no término da liberação da AC do SR, prendendo os níveis de CA intra-SR com buffers de baixa afinidade carregados na cisterna SR (3). Usando estes tampões, prolongámos dramaticamente a duração da libertação de AC activa subjacente tanto aos transientes de AC focais como globais nos miócitos. Consistente com essas descobertas, os nossos resultados atuais mostram que o aumento dos níveis do buffer CSQ2 de alta capacidade SR luminal Ca prolonga a duração de libertação Ca, ao passo que a redução das quantidades deste buffer endógeno encurtou a duração de libertação, aparentemente retardando ou acelerando o encerramento de RyRs dependente do luminal, respectivamente. Em conjunto, estes resultados fornecem provas convincentes para o papel da desactivação Ca-dependente do luminal de Rcyrs no término da CICR. Apesar de demonstrarmos a importância de alterações na AC luminal no término da libertação de AC SR, os nossos resultados não excluem necessariamente a possibilidade de que mecanismos adicionais, como a inactivação da RyR ou a adaptação em sites de regulação da AC citosólica também possam influenciar a terminação da AC-release.apesar de existirem provas claras de um papel nas alterações na AC do luminal na terminação das faíscas cardíacas (ref. 3; estudos anteriores indicaram que a CA sparks no músculo esquelético pode não ser acompanhada por uma depleção substancial da SR . Lacampagne et al. (33) used kinetic analysis of high temporal resolution Ca spark recordings to suggest that the Ca-release flux under the Ca spark is constant in amphibian muscle fibers. Como o fluxo de SR Ca deve diminuir sempre que a SR cai, este resultado pode significar que os níveis de luminal Ca permanecem estáveis durante a Ca sparks. Assim, existe a possibilidade de que os mecanismos básicos responsáveis pela terminação de faíscas sejam diferentes no músculo cardíaco e esquelético. A realização de Estudos Complementares nestes dois tipos de células (ou seja, modulação dos níveis de proteína CSQ em fibras musculares esqueléticas e medições rápidas da cinética Ca spark em miócitos cardíacos) deve ajudar a esclarecer esta questão.
relevância para CPVT. Um dos aspectos mais importantes dos nossos resultados é que eles mostram como os níveis reduzidos de CSQ2 podem causar arritmias cardíacas no nível celular. CPVT é uma doença arritmogénica caracterizada por síncope e morte súbita indutível por exercício e perfusão de catecolaminas (34). Até agora, quatro mutações foram ligadas ao CPVT. Três destas mutações parecem resultar em uma expressão reduzida de CSQ2 (17), e uma mutação foi proposta para levar a uma ligação interrompida de Ca (16). Os nossos resultados sugerem que a causa subjacente do CPVT pode estar relacionada com a restituição anormal do mecanismo de Libertação de Ca causada pela redução dos níveis de CSQ2 (Fig. 5). Devido à menor concentração de locais de ligação Ca Na SR de células SUBEXPRESSORAS CSQ2, o reabastecimento da Ca pela bomba de SERCA ocorre mais rápido do que nas células normais. A recarga de armazenamento torna-se ainda mais rápida quando a atividade de SERCA é estimulada pela proteína cinase a, potencialmente responsável pela dependência de episódios clínicos de CPVT de catecolaminas. Nos miócitos com níveis de CSQ2 diminuídos, a recuperação prematura dos canais de Libertação de Ca a partir de um estado refractário dependente de AC luminal levou a descargas espontâneas e extrassistólicas de reservas de SR Ca. Sabe-se que a libertação espontânea de Ca pode induzir correntes internas e oscilações no potencial da membrana, resultando em arritmia despoletada (4-7). Por conseguinte, as perturbações observadas na manipulação da AC podem explicar, pelo menos em parte, a patogénese da CPVT associada a defeitos genéticos que resultam em actividade reduzida de ligação da AC (16) ou níveis reduzidos de expressão da CSQ2 (17).comparação com estudos anteriores em ratinhos transgénicos. Nossas descobertas diferem dos resultados anteriores obtidos em ratos transgênicos sobreexpressing CSQ2 (14, 15). Nestes estudos, uma sobreexpressão 10 a 20 vezes superior da CSQ2 aumentou a capacidade de armazenamento SR Ca dos miócitos cardíacos isolados; no entanto, a AC luminal não estava disponível para libertação, levando a sinais de depressão global e local de AC-release. Estas alterações no tratamento da Ca foram acompanhadas por várias alterações estruturais, funcionais e bioquímicas nos níveis celular e subcelular e desenvolvimento de hipertrofia cardíaca e falência. Por outro lado, o presente estudo mantém os níveis de proteínas CSQ2 mais próximos dos níveis fisiológicos em condições agudas do que crónicas.; assim, é provável que estes dados reflictam com mais precisão as consequências fisiológicas directas das alterações nos níveis de proteínas CSQ2 no manuseamento intracelular da AC. Estes resultados destacam os potenciais problemas na interpretação dos efeitos da expressão constitutiva de alto nível de proteínas em modelos animais transgênicos e o valor de estudos complementares em contextos mais agudos.conclusão Em conclusão, descobrimos que o CSQ2 é um determinante essencial da capacidade da SR para armazenar e libertar Ca no músculo cardíaco. CSQ2 parece servir como um reservatório para Ca que é facilmente acessível para a CICR e também como um buffer AC ativo que modula o fechamento local do luminal Ca-dependente de RyRs. Ao mesmo tempo, o CSQ2 estabiliza o mecanismo CICR, retardando a recarga funcional das reservas SR Ca. Comportamento anormal de repriminação dos canais de Libertação de Ca pode explicar, ou contribuir para, arritmias ventriculares associadas a mutações no gene CSQ2.
