Compostos

ALDH1A1 inibidores têm sido recentemente described30. Os inibidores da LDHA foram descritos anteriormente em Rai et al.29. Os inibidores do IDH1 foram descritos anteriormente em Urban et al. e Davis et al.24,36. Outros compostos utilizados no estudo foram o Metotrexato (MedChem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomine (Toronto Investigação de produtos Químicos #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857), e LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Para o qHTS, os compostos na placa de interrogação do mecanismo (MIPE) foram testados em 11 pontos (intraplate, factor de diluição 1:3). A colecção de inibidores da cinase contendo 977 inibidores da cinase foi testada em doses de 7 pontos (interplato, factor de diluição de 1:5). Em todos os casos, DMSO foi usado como veículo.

Clonagem

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Os quadros de leitura aberta( ORFs) dos genes de interesse foram clonados nos backbones do aceitador utilizando locais BamHI/EcoRI (N-terminal) ou NheI/BamHI (C-terminal) por PCR amplificando a região de codificação com oligonucleótidos compatíveis com perfusão, definidos em pormenor no quadro suplementar S1. As construções IDH1, LDHA, DHFR, GC e ALDH1A1 foram preparadas pela GeneArt Gene synthesis (ThermoFisher) em pcDNA3.1 (+). Para a clonagem Gateway( idh2 constructs only), um vetor de destino contendo a tag 86b foi criado substituindo a tag V5 no pcDNA3.2-V5/Dost. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes “LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

de cultura de Células

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22RV1, MDA-MB-468, e HT-29 de células foram obtidos a partir ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132, e HTB-38, respectivamente). HuCC-T1 e CC-LP – 1 foram uma espécie de presente do Dr. N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). As células HEK293T foram cultivadas em DMEM (glucose 4, 5 g/L) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 6 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 50 U/mL de penicilina e 50 µg/mL de estreptomicina. As células LN18, HT-29, CC-LP-1 e HeLa foram cultivadas no meio acima, sem piruvato de sódio. As células OV-90 foram cultivadas numa mistura 1: 1 de MCDB 105 (Cell Applications Inc.) e m199 meio (Hiclone, GE), complementados com 15% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina (tecnologias de vida), e uma concentração final de 1,85 g/L de bicarbonato de sódio (Hiclone, GE). As células 22RV1, HuCC-T1 e MDA-MB-468 foram cultivadas em RPMI 1640 complementadas com 10% de FBS, 6 mM L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada mantida a 5% de CO2 e testadas com resultados negativos para o mycoplasma utilizando um kit de detecção de MycoAlert (Lonza).a produção e purificação de proteínas recombinantes e peptídicas recombinantes foram produzidas por GenScript. Para o fragmento de 11S recombinante, a sequência de ADN codificante foi fundida a um 6x da sua marca para facilitar a purificação a jusante e a sequência foi subclonada para um vector de expressão de E. coli. As células BL21 Star (DE3) foram transformadas com plasmídeos recombinantes e uma única colónia foi inoculada em meio LB contendo IPTG para indução da expressão proteica. SDS-PAGE and Western blot analysis were used to monitor the expression and select optimal harvest timing. As células foram colhidas por centrifugação e os pellets foram lisados por sonificação. Após a sua purificação, as fracções foram esterilizadas através de um filtro de 0,22 µm. As proteínas foram analisadas por SDS-PAGE e Western blot usando protocolos padrão e um mAb anti-rato (GenScript, Cat.no.A00186). a concentração de proteína purificada foi determinada utilizando um teste de proteína Bradford com BSA como padrão. A proteína foi armazenada em 1X PBS, 10% glicerol, pH 7.4, e a pureza foi de aproximadamente 90%, de acordo com as estimativas da análise densitométrica do gel de páginas SDS coradas de cor Azul Coomassie em condições de redução. O peptídeo 86b do aminoácido foi armazenado em ultrapure dH2O e tinha uma pureza de 99,9% por HPLC.

de Baixa taxa de transferência (96-well placas de PCR ou tiras) CETSA complementação composição

as Células foram transfected em 6-bem pratos usando um reverso para transfeccao de procedimento, onde 1,25 ml de complexos (6.25 µL Lipofectamine 2000 e 3 µg de DNA por bem) foi combinado com 1,25 ml da suspensão de células HEK293T (1 x 106/mL, 1.25 × 106 células total). Para CDK9, foram utilizados 2 µg de ADN por Poço. Após 24 h, 48 h para CDK9), as células foram colhidas trypsinization e suspensão em 1 × 106 células/mL (a menos que indicado de outra forma) em CETSA tampão com DPBS (com CaCl2 e MgCl2), além de 1 g/L de glicose, 1X Parar inibidor da protease do cocktail (ThermoFisher), e 0,5% de DMSO (DMSO não foi adicionado para experiências que recebeu subsequentes composto do veículo e tratamento). Para os ensaios de gama de temperaturas (sem composto ou dose única), as amostras foram aliquotadas para tiras de PCR a 30 µL por tubo. O composto foi adicionado e as células foram incubadas a 37 °C durante 1 h. As amostras foram então aquecidas durante 3 horas. 5 min utilizando um ciclador térmico pré-aquecido, que permita equilibrar a temperatura ambiente, e 6 µL de 6% de NP40 foi adicionado a cada poço. Para experimentos de degelo, tubos foram colocados em um bloco de PCR de alumínio em um banho de gelo seco / etanol por 3 minutos, seguido de incubação a 37 ° C por 3 minutos, vórtice por 3 segundos, e repetindo estes passos três vezes adicionais. Foram adicionados 11S (GenScript) e substrato de furimazina (do sistema de doseamento da Nano-Glo Luciferase, Promega), em concentrações finais de 100 nM e 0.5X, respectivamente, e amostras foram analisadas para a intensidade de luminescência usando um visor CCD de alta potência (Perkin Elmer) equipado com filtros claros.

384-bem CETSA composição

as Células foram transfected em T75 frascos usando um reverso para transfeccao de procedimento, onde 9 mL de complexos (45 µL Lipofectamine 2000 e 22,5 µg de DNA) foi combinada com 10 mL de suspensão de células HEK293T (1 × 106 células/mL, 10 milhões de células total). Após 24 h, as células foram colhidas trypsinization, em suspensão em 1 × 106 células/ml, conforme descrito acima e dispensado (15 µL de células/poço) em 384 poços placas de PCR (Roche) usando um Multidrop Combi (ThermoFisher). Compostos (63 nL) ou DMSO controle do veículo (63 nL) foram posteriormente fixados usando uma ferramenta de pino (GNF) e incubadas por 1 h a 37 °C. as Placas foram seladas e aquecido na temperatura indicada para 3,5 min e arrefecidos a uma temperatura de 25 °C, utilizando AB de acordo com pcr máquina (Roche), utilizando a rampa de velocidade de 1,5 °C/s para a fase de aquecimento e max taxa de rampa para a fase de resfriamento. Foram adicionados três µL de 6% de NP40 por alvéolo e incubados durante 30 minutos para permitir a lise celular, seguidos da adição de substrato de 11S e furimazina (em concentrações finais de 100 nM e 0,5 X, respectivamente). As amostras foram analisadas para a intensidade de luminescência usando um leitor de visor.

1. 536-teste de cetsa para poço

as células foram transfectadas e colhidas como acima indicado (protocolo 384-well). As células foram distribuídas (5 µL de célula/poço) em 1536 placas brancas de poço (Aurora, polímero de olefinas cíclicas, cat# EWB041000A) usando um Combi Multidrop. Compostos (23 nL) foram posteriormente fixados usando uma ferramenta de pino (Wako Automação) e incubadas por 1 h a 37 °C. as Placas foram aquecidas na temperatura indicada e a hora utilizando um bloco de aquecimento (ver abaixo) e arrefecido a uma temperatura de 25 °C. Uma µL de 6% NP40 foi adicionado por poço e as placas foram incubadas por 30 min para permitir a lise celular, seguido pela adição de 3 µL de 11S (concentração final de 100 nM) e furimazine substrato. As placas foram centrifugadas e analisadas para a intensidade de luminescência usando um leitor de visor. Para os ecrãs LDHA e CDK9, uma concentração final de 0,5 X e 0.Foi utilizada 25x furimazina, respectivamente. Os controlos de normalização incluem amostras tratadas com DMSO e GSK2837808A ou amostras não aquecidas para LDHA e CDK9, respectivamente. O CDK9 counterscreen foi realizada como descrito acima com as seguintes diferenças: 5 µL de untransfected HEK293T células (1 x 106/mL em CETSA buffer) foram dispensados em ter 1.536-placas seguido de compostos de adição, 37 °C, de incubação, de aquecimento e de lise etapas acima. Posteriormente, 500 pM (final) de 86b foram adicionadas aos poços, seguido pela adição de 100 nM 11S e 0,25 x substrato de furimazina (final).

O bloco de alumínio para aquecimento de uma placa de poços de 1.536 foi projetado medindo uma placa para determinar as dimensões da área delimitada por Placas de reforço moldadas em X e Y, e a face inferior do poço e face inferior da flange em Z. Em seguida, um bloco a ser maquinado a partir de placa de alumínio 6061 T6 foi moldado, que seria um ajuste livre com aproximadamente 0,5 mm de folga para a placa em todos os eixos. O bloco foi maquinado usando uma fresadora vertical manual, moinhos e um moinho facial. Para experiências de aquecimento de fornos, as placas foram colocadas no suporte médio do forno de laboratório de convecção (Termofisher) e cobertas com tampas metálicas para minimizar a evaporação.

CETSA em lisados celulares

as Células foram coletadas em CETSA buffer de 1,0 × 106 células/mL (conforme descrito acima) e NP40 foi adicionado a uma concentração final de 0,4%. Após a rotação das amostras de ponta durante 30 minutos (temperatura ambiente), os lisados foram clarificados por centrifugação a 20.000 × g durante 10 minutos (4 oC). O Cofactor (por exemplo, NAD+) foi adicionado ao lisato clarificado. Para experimentos de resposta à temperatura, 25 µL de lisato foi transferido para tubos PCR e aquecido por 3,5 minutos para várias temperaturas. Para experimentos de resposta à dose isotérmica, 5 µL de lisato clarificado foi dispensada para 1536 placas de alvéolo usando uma estação de trabalho de FRD BioRAPTR e amostras foram aquecidas em um bloco de alumínio. Permitiu-se que as amostras se equilibrassem à temperatura ambiente e que o substrato fosse adicionado (concentração final: 100 nM 11S, 0, 5 X furimazina). A luminescência foi capturada usando um visualizador como descrito acima.

as amostras de blots ocidentais

foram processadas conforme descrito na secção do ensaio de complementação de baixa produção, utilizando ciclos de degelo para a lise. Os lisados foram centrifugados a 15,200 × g durante 20 minutos a 4 ° C. As amostras foram colhidas num gel Bis-Tris NuPAGE de 4-12% (Termofisor) utilizando tampões de esfregaços e transferidas para uma membrana PVDF utilizando um sistema de transferência iBlot 2 a 25 V durante 7 minutos. As membranas foram bloqueadas com uma solução láctea de 5% (Tris HCl de 50 mM, pH6; NaCl de 150 mM; 0, 1% Tween-20) e os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 °C na solução de bloqueio. Os anticorpos foram: anti-IDH1 (, Sinalização Celular #8137, 1:500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-da hdla (, Sinalização Celular #3582, 1:1000). Anti-rabbit/mouse-HRP (rabbit = Cell Signaling 7074; mouse = Cell Signaling # 7076) foi adicionado às 1:2500 e incubado durante 1 h à temperatura ambiente. Um sinal quimioluminescente foi gerado com a Supersignal west dura solution (ThermoFisher) e capturado usando um sistema Biorad Chemidoc. A análise densitométrica foi realizada usando o software Photoshop (Adobe).

2-HG doseamento

hek293t células reversas transfectadas em 24 pratos de sondagem, adicionando 2.5 × 105 células em complexos de transfecção (0,75 µg de ADN plasmídeo, 1,5 µL de Lipofectamina 2000 por Poço). O meio de cultura de células foi recolhido após a transferência de 72 h e 15 µL para uma placa opaca de 384 alvéolos. Adicionaram-se a cada alvéolo 1,5 µL de HCl de 660 mM e incubaram-se as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicionou-se a cada alvéolo 1,5 µL de base Tris-HCl de 720 mM. Em seguida, 52 µL de 2-HG solução de detecção (100 mM de HEPES (pH 8,0), 100 µM de NAD + , 1 µg/mL active recombinante D-2-Hydroxyglutarate desidrogenase (D2HGDH; Biovision, Gato: P1001), 5 µM resazurin, de 0,03 mg/mL diaphorase (Sigma, Gato: D5540) foi adicionada e a placa foi incubada à temperatura ambiente. Foi preparada uma curva padrão de 2 HG em HEPES de 100 mM (pH 8, 0). A fluorescência foi medida num leitor de visor utilizando filtros Ex: 525 Em: 598/25.o ensaio bioquímico da LDHA foi realizado como descrito anteriormente. Resumidamente, 3 µL de lactato desidrogenase humana 5 (final de 2 nM) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) em tampão de ensaio LDH (200 mM Tris HCl, pH 7, 100 µM EDTA, e 0,01% Tween-20) foi adicionado a uma placa de ensaio de fundo sólido negro de 1536 alvéolos (Greiner Bio-One). Após a transferência de pinos compostos (23 nL), foi dispensada 1 µL de solução substrato contendo NADH (0, 06 mM final) e piruvato de sódio (0, 2 mM final) (Sigma-Aldrich) em tampão de doseamento LDH para iniciar a reacção. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicionaram-se a cada poço 1 µL de reagente de detecção. As placas foram imediatamente transferidas para um leitor de visores e a fluorescência da resorufina resultante foi medida (ex 540 nm, em 590 nm) a 0 e 10 minutos. A fluorescência foi normalizada utilizando alvéolos de controlo isentos de enzimas e tratados com DMSO em cada placa.o ensaio bioquímico ALDH1A1 utilizando proteínas não marcadas foi realizado como descrito anteriormente. Brevemente, 3 µL de 20 nM humano purificado ALDH1A1 em tampão de ensaio (100 mM de HEPES pH 7.5 com 0,01% de Tween 20) foram dispensados em ter 1.536-bem sólida com fundo de chapa preta (Greiner Bio One). Vinte e três nL de compostos ou Baía de controle 11-7085 foram transferidos através de pin tool (Wako Automation). Incubaram-se amostras (à temperatura ambiente, protegidas da luz) durante 15 minutos, seguidas de uma adição de substrato de 1 µL de NAD + e propionaldeído (concentrações finais de 1 mM e 80 µM, respectivamente). As placas foram centrifugadas e lidas em modo cinético em um visor equipado com uma excitação de 340 nm, filtros de emissão de 450 nm durante 5 minutos. A alteração da intensidade de fluorescência durante os 5 minutos foi normalizada utilizando alvéolos de controlo isentos de enzimas e tratados com DMSO em cada placa.o ensaio TR-FRET Lanthascreen Eu Kinase Binding assay para CDK9 / cyclin K foi comprado ao ThermoFisher e realizado de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, 4 µL de uma mistura principal, contendo 4 nM CDK9/Cyclin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM Biotina Anti-Sua Ab, 2 nM Ue-Estreptavidina, e 10 nM Quinase Tracer 236 Solução em 1X Quinase Buffer foram dispensados em Greiner ter 1.536-bem branco médio de enlace de placas usando um BioRAPTR FRD estação de trabalho. Vinte e três nL de compostos e controlos (DMSO e LY2857785 a uma concentração final de 6 µM) foram imediatamente entregues às placas de ensaio por transferência de ferramentas pin. As placas foram autorizadas a incubar durante 1 h à temperatura ambiente, e a fluorescência TR-FRET foi subsequentemente medida com um leitor de placas Multicabeladas PerkinElmer (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; tempo de latência 100 µs; tempo de integração 200 µs).as células HEK293T foram cultivadas como acima descrito. As células foram enxaguadas com PBS, tripsinizadas e ressuspendidas em DMEM sem Vermelho de fenol (tecnologias de vida) sem suplementos. As células foram imediatamente revestidas a placas de fundo (Corning) com 1536 alvéolos negros, a 250 células por alvéolo, em 4 µL de volume. Composto ou controle do veículo foi adicionada aos poços através do pino da ferramenta de transferência e as células foram incubadas a 37 °C por 1 h. Dois µL de lactato mistura de reação (Biovision K607-100) foi adicionado a cada poço e as placas foram cobertas e incubadas à temperatura ambiente por 30 min. A fluorescência foi medida utilizando um visualizador microplate imager equipado com filtros Ex/Em 528/598 nm.

Aldefluor composição

inicial Para a determinação da 86b-tagged ALDH1A1 atividade, as células foram transfected usando um reverso para transfeccao de procedimento, onde 1 mL de complexos (6 µL Lipofectamine 2000 e 3 µg de DNA) foi combinada com 1 mL de LN18 suspensão de células (5 x 105/mL) e 100 µL/poço de mistura foi dispensada no preto, claro-inferior 96 placas de poços (Corning). Após 24 h, os meios foram removidos e substituídos por 100 µL/poço de tampão Aldefluor (tecnologias STEMCELL) contendo substrato BAAA e Hoechst 33342 (Termofisador, concentrações finais de 500 nM e 0,5 nM, respectivamente). O veículo DMSO ou DEAB (final de 1 µM) foi posteriormente adicionado e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 37 °C para permitir a conversão de BAAA em BAA. As células foram lavadas e foram administrados 100 µL/poço de tampão Aldefluor antes de se obter uma imagem na célula in 2200 (GE Healthcare). Para os ensaios de alto débito, as células LN18 foram transfectadas em frascos T75 utilizando um procedimento de transferência reversa, como descrito acima, para os ensaios HEK293T CETSA de alto débito. Após 16 h, as células foram colhidas e banhados (de 1.000 células/poço/5 µL) em preto, qualidade óptica clara inferior, TC tratados ter 1.536-bem, placas de Aurora Microplacas) usando um Multidrop Combi distribuidor e incubadas overnight a 37 °C. O alto conteúdo Aldefluor ensaio foi realizado posteriormente em transfected LN18 células ou untransfected OV-90 como anteriormente described31. As imagens foram analisadas usando o algoritmo de análise multi-alvo enlatado do software de análise em células v1.6.2 (GE Healthcare), conforme descrito.foram preparadas 30 µL de tampão CETSA contendo 1X cocktail de inibidor da protease (ThermoFisher) suplementado com 0, 5% DMSO (1, 5% Total DMSO). Para o experimento de tolerância DMSO, o DMSO foi adicionado aos DPBS em 0, 1, 2 ou 3%. As suspensões celulares foram aquecidas por 3,5 minutos a 42 a 74 ° C, usando intervalos de 4 graus, e depois removidas para um bloco de alumínio em gelo úmido. As suspensões celulares foram misturadas com partes iguais Trypan Blue (LONZA) (=0,2% trypan blue) e contadas imediatamente usando um hemocitómetro de C-chip (iNCyto, Coreia). Trypan positivo (permeabilizado) e negativo (intacto) foram contados, com n = 2 a cada temperatura. Para linhas celulares adicionais, um milhão de células foram preparadas em 100 µL de DMEM sem Vermelho de fenol contendo 1% de DMSO. As células foram aquecidas durante 3 minutos entre 42 e 90 ° C em intervalos de 4 graus, depois removidas para um bloco de alumínio em gelo molhado. A integridade da membrana foi avaliada como descrito acima.

PAMPA

o método de Pampa de lavagem dupla patenteado pela pION Inc. (Billerica, MA) foi usado para medir a permeabilidade do composto como descrito anteriormente38. Os compostos foram diluídos em soluções de dadores e de aceitação tamponados para pH7.4 e a concentração de DMSO foi de 0,5%. Foram efectuados cálculos de permeabilidade utilizando a Pion Inc. software.os dados de cada ensaio foram normalizados em termos de placa para os controlos correspondentes, tal como descrito anteriormente 39. Foram igualmente utilizados os mesmos controlos para o cálculo do factor Z’ para cada ensaio. A atividade percentual foi derivada usando software interno (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Todas as curvas de concentração–resposta foram ajustadas e o AC50 foi calculado com o software de Prism GraphPad; as curvas foram classificadas como descrito anteriormente: 27. A área sob a curva (AUC) foi calculada utilizando a regra trapezoidal para aproximar a área entre a curva de resposta e o eixo dos x ao longo da Gama de concentrações. Foram utilizadas gamas de concentração equivalentes para todos os compostos de uma experiência. O corte de eficácia de 3 σ da média (do controle do veículo) foi usado para classificar compostos ativos.