Abstrato
As catepsinas de cisteína são um grupo de enzimas normalmente encontradas nos endolisossomas onde estão primariamente envolvidos na rotação intracelular das proteínas, mas também têm um papel crítico no processamento e apresentação mediados pelo MHC II. No entanto, em várias patologias, verificou-se que as catepsinas de cisteína eram fortemente desreguladas e segregadas para o meio extracelular, onde se descobriu que degradavam uma série de proteínas extracelulares. Um papel importante na modulação de catepsina atividades jogar glicosaminoglicanos, que foram encontrados não só para facilitar a sua autocatalytic de ativação, incluindo em pH neutro, mas também de forma crítica modulam suas atividades, como no caso do collagenolytic atividade da catepsina K. A interação entre cathepsins e glicosaminoglicanos será discutido em mais detalhe.
1. Introdução
as catepsinas de cisteína são membros da família da cisteína peptidase semelhante à papaína . Apesar do fato de que o onze de cisteína cathepsins encontrado no homem, representam apenas uma pequena fração dos humanos proteolíticas repertório, estas enzimas têm vindo a atrair muita atenção para suas diversas funções fisiológicas e patológicas processos que vão desde inespecíficos de proteína de volume de negócios no endolysosomal caminho para a altamente especializados funções no tecido homeostase. Uma série de excelentes revisões foram publicadas recentemente, resumindo as características estruturais e funcionais das catepsinas de cisteína na saúde e doença .
Todas as catepsinas compartilham o mesmo andaime estrutural, também chamado de dobra Tipo papaína. A estrutura consiste em dois subdomínios que foram denominados domínios L E R referindo-se à sua posição quando a molécula é mostrada na orientação padrão (Figura 1). A fenda do local ativo está no topo da molécula entre os domínios L E R e contém o diad catalítico conservado Cys-His (marcado por esferas amarelas e azuis na Figura 1, resp.). Em geral, as peptidases semelhantes a papaína podem actuar como endo – ou exopeptidases. Numa endopeptidase típica, o determinante primário da especificidade é o local S2 e locais bem determinados da enzima interagem com resíduos P3 a P2′ do substrato . Cinco dos onze membros humanos da família (cathepsins F, K, L, S e V) são exclusivamente endopeptidases, catepsina B é também uma peptidyl dipeptidase, catepsina X é um carboxypeptidase, catepsina H é uma aminopeptidase, e catepsina C é um dipeptidyl peptidase. A atividade proteolítica dos dois membros restantes, catepsinas o E W, permanece por determinar . A maioria das catepsinas de cisteína são ubiquitosamente expressas no corpo humano, enquanto algumas (catepsinas K, S, V e W) são expressas em padrões mais restritos . A catepsina K é abundantemente expressa em osteoclastos e fibroblastos sinoviais, mas também é encontrada em outras células das linhagens hematopoiéticas, epiteliais e fibroblastas . Os níveis de expressão mais elevados da catepsina s são encontrados em células que apresentam antigénios , a catepsina V é expressa predominantemente em timo e testis , e a expressão da catepsina W é restrita aos linfócitos CD8+ e às células assassinas naturais .
2. A regulação da actividade das Catepsinas de cisteína
a activação do Zimogénio é um dos principais meios de regulação da actividade da catepsina. Todas as catepsinas são sintetizadas como zimogénios inactivos e activadas no meio ácido das vesículas endolisossómicas. O mecanismo molecular da sua activação foi intrigante durante muito tempo. A informação crítica veio da combinação de estudos estruturais de procathepsins B, K, e L, que mostrou que o propeptide atravessa o sítio ativo da cathepsins na direção oposta do substrato, excluindo assim a clivagem da propeptide na molécula sem enormes e energeticamente desfavorável estruturais movimentos do propeptide , eliminando assim a unimolecular mecanismo inicialmente sugerida, e detalhados estudos de cinética, que claramente demonstrado que a ativação de catepsina B é um processo bimolecular . O modelo atual, que é baseado principalmente nos estudos de catepsina B, sugere que o propeptídeo no zimogênio de catepsina muda entre duas conformações, o chamado “fechado” e “aberto”. Na conformação “fechada”, favorecida em pH neutro a um pH ligeiramente ácido, o propeptídeo bloqueia o local ativo e previne a hidrólise do substrato, enquanto que, na forma” aberta”, favorecido em pH ácido abaixo de pH 5.0, o propeptídeo é removido da fenda lateral ativa, resultando em uma baixa atividade catalítica do zimogênio. Esta actividade é suficiente para activar outro zimogénio catepsina em uma ou várias etapas, iniciando assim a reacção em cadeia, onde a catepsina B madura totalmente activa processa a maioria das moléculas de zimogénio .
os outros principais reguladores das catepsinas de cisteína são inibidores macromoleculares que se ligam ao local activo e, assim, impedem a associação da peptidase com o seu substrato. Eles pertencem a várias famílias distintas, incluindo as cistatinas, as tiropinas, e as serpinas que, além das proteases serinas, também inibem várias catepsinas .
3. Glicosaminoglicanos como principais reguladores da atividade de catepsina de cisteína
glicosaminoglicanos (GAGs) são heteropolissacáridos compostos por unidades de dissacáridos repetitivas com uma carga negativa elevada. Isto é resultado da presença de múltiplos grupos carboxilo e substituições de sulfato. A maioria dos GAGs são sulfatados, incluindo sulfato de condroitina (CS), sulfato de keratan (KS), sulfato de dermatan (DS), sulfato de heparan (HS), e heparina, enquanto o hialuronano (HA) é o único GAG não-sulfatado. Nos últimos anos, GAGs têm vindo a emergir como importantes reguladores de catepsinas de cisteína com diversos efeitos sobre os seus alvos. Tradicionalmente, as catepsinas de cisteína tinham sido vistas como proteases lisossómicas e, como outras enzimas lisossómicas, eram conhecidas por serem inibidas por GAGs intralisossomais no lisossoma em repouso . Hoje, no entanto, as catepsinas de cisteína são estabelecidas como os principais jogadores na proteólise extracelular . Sua ação no ambiente extracelular rico em glicosaminoglicanos levantou questões sobre a interação entre as catepsinas de cisteína e GAGs fora do lisossomo. Os dois grupos de catepsinas endógenas humanas mais frequentemente associadas à proteólise extracelular são as proteases tipo L da catepsina (catepsinas K, L, S E V no ser humano) e a catepsina B. Os dados acumulados ao longo das últimas duas décadas mostram que a interação entre estas peptidases e GAGs vai em ambos os sentidos; as catepsinas de cisteína são capazes de clivagem de proteínas do núcleo proteoglicano e, assim, libertar GAGs de seu suporte, enquanto Gag por sua vez afetam tanto a atividade e estabilidade das catepsinas de cisteína no espaço extracelular.
a regulação das cisteínases cisteínicas semelhantes à papaína por GAGs foi descrita pela primeira vez para catepsina L. Nestes primeiros trabalhos descobriu-se que GAGs e várias superfícies carregadas negativamente aceleraram substancialmente a ativação do zimogênio catepsin L na forma madura, incluindo em pH próximo ao neutro, como também encontrado no meio extracelular em várias condições da doença. Isto foi confirmado para várias outras catepsinas, sendo as mais importantes catepsinas B E S, e até mesmo para um T. congolense parasite homologue congopain, sugerindo que GAGs e outras superfícies carregadas negativamente podem desempenhar um papel importante na ativação da catepsina extracelular na doença. No entanto, descobertas recentes com catepsina s em alta concentração GAG sugerem que esta enzima pode se comportar de forma um pouco diferente em tais condições com condroitina-4-sulfato (C4S), mesmo exibindo um efeito desacelerador . No entanto, facilitar a ativação autocatalítica das catepsinas pelo sulfato de polissacárido de carga negativa tornou-se também um método de rotina na preparação de catepsinas recombinantes .
a maioria das informações sobre o mecanismo molecular da activação da catepsina assistida por GAG provêm de um estudo realizado por Caglič et al. usando a catepsina B humana como modelo . Como mostrado, GAGs parecem contribuir para o processamento de duas maneiras. Em primeiro lugar, ao ligarem-se, parecem converter o zimogénio de catepsina num substrato melhor. Em segundo lugar, a ligação de GAGs aparentemente favorece a conformação aberta do zymogen, promovendo assim a ativação não só em pH ácido, mas também em valores de pH mais próximos do neutro. Este parece ser o caso para a maioria das GAGs e não depende criticamente da densidade de carga das GAGs, como também HA foi capaz de acelerar a ativação, embora em uma menor extensão, o que é incomum para uma interação proteína-GAG. Além disso, já um tetrasacárido era suficiente para uma aceleração proeminente da autoativação da catepsina B, que é substancialmente menor do que encontrado para uma série de outras reações mediadas pela GAG . A interacção é mediada por interacções iónicas.; no entanto, parece não haver nenhuma superfície conservada de ligação GAG sobre os zymogens como resíduos completamente não relacionados em procathepsins L E B, que foram em grande parte localizados nos prodomains, foram encontrados para governar a interação .
O outro papel importante das GAGs na regulação da atividade catepsina veio dos estudos sobre papaína, o arquetípico representante da família . Este modo de regulação rapidamente recebeu mais atenção com a descoberta de que-sulfato de condroitina a partir de cartilagem de forma destacada aumentou o collagenolytic atividade da catepsina K . Esta peptidase em particular tinha sido descoberta alguns anos antes como a única protease responsável pela degradação do colagénio na remodelação óssea e imediatamente reconhecida como uma potencial candidata ao tratamento de doenças ósseas metabólicas, tais como a osteoporose . A interacção da catepsina K com o sulfato de condroitina e outros glicosaminoglicanos foi mais tarde examinada em pormenor a partir das perspectivas estruturais e funcionais e os glicosaminoglicanos foram reconhecidos como os primeiros reguladores alostéricos conhecidos de uma peptidase de catepsina cisteína , tal como descrito em pormenor nas secções seguintes. Em paralelo, interacções funcionalmente relevantes com glicosaminoglicanos também foram documentadas para outros membros da família da cisteína catepsina. Em conjunto, verificou-se que os glicosaminoglicanos afectam tanto a actividade como a estabilidade das catepsinas de cisteína. Os perfis cinéticos são geralmente consistentes com mecanismos hiperbólicos, indicando interacções com enzimas fora do local activo, possivelmente através de mecanismos alostéricos. O efeito estabilizador é importante especialmente por causa da instabilidade relativa das catepsinas de cisteína em pH neutro encontrado na matriz extracelular.4. Regulação da actividade e estabilidade da catepsina K
de todas as peptidases tipo papaína, a catepsina K foi estabelecida como a catepsina mais estreitamente ligada aos glicosaminoglicanos. Foi originalmente identificada como uma protease expressa predominantemente em osteoclastos e a sua actividade diminuída demonstrou resultar em perturbações ósseas graves . A catepsina K é uma colagenase com actividade única entre as peptidases dos mamíferos, que é especificamente modulada pelos glicosaminoglicanos através de mecanismos alostéricos . Devido ao seu papel central na remodelação óssea, a catepsina K é actualmente considerada um dos alvos mais promissores para o tratamento da osteoporose . Para além da remodelação óssea, a catepsina K está envolvida em diversos processos fisiológicos e patológicos (para uma revisão recente Ver ). Pode clivar vários substratos extracelulares, incluindo proteoglicanos , para libertar glicosaminoglicanos activos, que por sua vez modulam a sua actividade. Na cartilagem, cathepsin K degrada ambos os colágenos tipo I e tipo II e, assim, contribui para o desenvolvimento de várias doenças articulares inflamatórias . Além disso, a catepsina K tem sido associada a doenças cardiovasculares, obesidade, esquizofrenia e câncer .a interacção da catepsina K com diferentes glicosaminoglicanos foi objecto de uma investigação aprofundada. Embora vários aspectos dessas interações permaneçam evasivos, dados acumulados sugerem que as interações são heterogêneas e diversas e provavelmente envolvem múltiplos locais de ligação à enzima. Condroitina-4-sulfato (C4S) foi inicialmente identificado como o GAG com o efeito mais dramático sobre catepsina K, enquanto os efeitos de condroitina-6-sulfato (C6S), sulfato dermatano (DS), e hialuronano (HA) eram mais fracos. Todas as GAGs testadas aumentaram a estabilidade do cathepsin K em uma ampla gama de pH. Os C4S tiveram o efeito mais proeminente na degradação dos colágenos dos tipos I e II pela cathepsin K , enquanto o seu efeito na hidrólise de um substrato sintético foi virtualmente idêntico ao dos C6S e DS e resultou num aumento duplo dos valores da constante de especificidade . Em um estudo posterior, keratan sulfato (KS) e C6S foram encontrados para ter um efeito estimulante sobre catepsina K semelhante ao de C4S, considerando que a heparina e HS teve um efeito limitado sobre o collagenolytic atividade da catepsina K . Os primeiros experimentos também sugeriram que a formação complexa com CS é necessária para a atividade colagenolítica de cathepsin K ; entretanto, descobertas recentes mostraram que o colágeno tipo I também pode ser degradado eficientemente na ausência de glicosaminoglicanos . No entanto, foi demonstrado que as GAGs residentes no osso potenciam a actividade colagenolítica da catepsina K e que as concentrações endógenas de GAG no osso foram suficientes para um efeito máximo na actividade da catepsina K.
o mecanismo cinético do efeito da CS, DS e heparina (HP) na catepsina K foi também investigado em pormenor no pH plasmático fisiológico de 7, 4. Nestas condições, CS e DS foram caracterizados como activadores não essenciais com um efeito predominante na afinidade para o substrato . A DS era mais eficaz do que a CS, o que foi atribuído à sua maior flexibilidade devido a menos ligações intramoleculares de hidrogénio . A fluorescência intrínseca indicou que a ligação de Gag afecta a conformação da catepsina K. em contraste com experiências realizadas a pH 5.5, CS e DS actuaram como inibidores da degradação do colagénio a pH plasmático fisiológico. em contraste, o mecanismo cinético da heparina era bifásico, indicando interacção com dois locais distintos da enzima. Ao todo, a heparina era um forte activador da catepsina K no pH plasmático fisiológico, aumentando tanto as suas actividades colagenolíticas como as de elastinolíticos. Além disso, a heparina teve um forte efeito estabilizador sobre a catepsina K nestas condições, resultando num aumento de mais de 5 vezes na semi-vida da enzima .
5. Base estrutural para a Interação entre Catepsina K e GAGs
A estrutura cristalina de catepsina K e C4S revelou a base estrutural para a interação . O sítio de ligação está localizado na parte de trás de catepsina K e interage com três dissacarídeo unidades de CS na estrutura cristalina (Figura 2(a)). Como de costume, a interacção glicosaminoglicano/proteína é mediada principalmente por interacções electrostáticas entre a cadeia gag negativamente carregada e resíduos positivamente carregados na enzima. A ligação do sulfato de condroitina não causa alterações conformacionais significativas na catepsina K em comparação com a catepsina K. inversamente, a cadeia CS é dobrada sobre a ligação à catepsina K (Figura 2(b)). A maior parte da mudança conformacional pode ser atribuída à interação com uma pequena região helicoidal Arg8-Lys9-Lys10 que interage com quatro grupos negativamente carregados em CS (Figura 2(c)). Outros contatos próximos incluem Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191, e Leu195 e alguns contatos adicionais mediados pela água .
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o comportamento cinético de DS foi análogo ao de CS: foi, portanto, proposto que interage com cathepsin K da mesma forma que CS . A heparina, por outro lado, foi proposta para se ligar a dois locais em cathepsin K de acordo com o seu perfil cinético. Enquanto o primeiro local de ligação foi proposto para ser idêntico ao para CS / DS, o segundo local de ligação foi previsto na parte inferior da molécula por experimentos de cruzamento químico e modelagem computacional . De uma perspectiva estrutural, o local de ligação previsto é uma continuação do local de ligação CD/DS e consiste de vários resíduos básicos (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127, e Lys214) organizados em uma estrutura em forma de anel (Figura 2(d)). Experiências cinéticas confirmaram que a heparina pode estar ligada a ambos os locais ao mesmo tempo . No entanto, resta determinar se isto requer uma cadeia de HP que interage com ambos os locais ao mesmo tempo ou duas cadeias de HP separadas. Isto não é claro para a interação de outras GAGs com o segundo site de ligação HP.
6. As interacções das GAGs com as Catepsinas s e B
para além da catepsina K, duas outras peptidases tipo papaína humana, as catepsinas s e B, demonstraram ser reguladas pelos glicosaminoglicanos nas suas formas maduras . Catepsina s, o parente mais próximo de catepsina K, é incomum entre as catepsinas de cisteína por ser estável em pH neutro . A catepsina S tem importantes papéis fisiológicos nas células que apresentam antigénios como a protease mais importante no processamento de antigénios e foi recentemente encontrada a ser regulada por C4S . Em contraste com o efeito de activação observado com a catepsina K, a C4S actuou como um inibidor da degradação do colagénio tipo IV pela catepsina S. A Inibição foi também observada com o HS, enquanto que o HP, DS, C6S e HA aumentaram ligeiramente a actividade proteolítica da catepsina s utilizando o colagénio tipo IV como substrato. C4S, C6S e HS também inibiram a hidrólise de Z-Phe-Arg-AMC através de um mecanismo parcial e misto. Semelhante à catepsina K, observaram-se alterações conformacionais subtis na catepsina s após a ligação C4S por espectroscopia de fluorescência intrínseca. Foram previstos três locais de ligação para C4S em catepsina s por acoplagem molecular [Figura 3 (a)]. Um dos locais propostos é o local activo, que, no entanto, não está de acordo com o perfil de inibição mista observado de C4S.; o segundo está localizado no lado inferior direito da molécula e corresponde ao identificou recentemente alostéricos site em catepsina K , enquanto o terceiro está localizado na parte inferior da molécula e corresponde, grosso modo, para o secundário heparina-sítio de ligação identificados no catepsina K .
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a catepsina B é única entre as catepsinas de cisteína por ser tanto uma endopeptidase como uma dipeptidase peptidil, dependendo da conformação do ciclo de ocultação, uma estrutura específica de catepsina B que fornece um interruptor específico de pH entre ambas as atividades . No lisossoma, o baixo pH restringe a protease a uma conformação fechada, exopeptidase, enquanto que o pH quase neutro do ambiente extracelular promove a atividade endopeptidase da catepsina B. A catepsina B extracelular é mais comumente associada com câncer e vários tipos de artrite . A protease localizada na superfície celular em vários estudos e foi encontrada envolvida na migração celular sob condições fisiológicas e patológicas . A nível molecular, demonstrou-se clivar vários substratos extracelulares, incluindo laminina, colagénio tipo IV e fibronectina . Recentemente, a catepsina B também tem sido sugerida para ser uma β-secretase que produz peptídeos β amilóides em vesículas secretoras de células cromafinas neuronais . No entanto, também se demonstrou degradar os depósitos amilóides num modelo animal e o resultado global foi sugerido para ser determinado pelo equilíbrio entre a catepsina B e o seu inibidor endógeno cistatina C.demonstrou-se que a ligação da HP ou HS à enzima alcalina aumenta a estabilidade da enzima de outro modo instável (8, 0), reduzindo ligeiramente a actividade da enzima ao longo de todo o perfil de pH da enzima . Simulações computacionais previram que a heparina estabiliza a conformação da molécula sob estas condições e previu dois locais putativos de ligação GAG (Figura 3(b)), Um em cada lado da enzima . O sítio de ligação putativa no domínio L consiste em cinco resíduos básicos (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 e Lys144), enquanto o do domínio R contém apenas dois (Lys158 e Arg235). Os autores sugeriram que o site de ligação no domínio R tem maior afinidade para fragmentos GAG mais curtos, como o dissacarídeo heparina usado em suas simulações de acoplagem, enquanto o no domínio L é provavelmente mais relevante para a ligação de fragmentos GAG mais longos .
7. Interactions of GAGs with Other Papain-Like Peptidases
curiosamente, papain has also been shown to interact with GAGs. Apesar de não terem relevância fisiológica, essas interações apontam para mecanismos evolutivamente conservados de regulação dentro da família. HP inibiu a papaína por um mecanismo hiperbólico misto e afetou sua conformação . Uma sequência de consenso clássica de heparina foi identificada em papaína, na forma da sequência 187-Ile-Arg-Ile-Lys-Arg-Gly-192. Estruturalmente, esta sequência está localizado no lado direito da molécula (Figura 3(c)), em uma região que fica entre os dois sítios alostéricos conhecido em catepsina K.
além disso, alguns exemplos de proteases de protozoários parasitas tem sido descrito que interagem com GAGs, sugerindo a possibilidade de sua influência na interação parasita-hospedeiro. A catepsina l homolog brucipain, um fator crucial de virulência do parasita protozoário Trypanosoma brucei, foi encontrada para ser allostericamente modulada pelo HS. O efeito do HS neste estudo foi subtil e teve a capacidade de reverter a inibição do substrato por um pequeno substrato dipeptídeo (Z-Phe-Arg-AMC) . Um efeito mais forte do HS foi observado para cruzipain do parasita relacionado Trypanosoma cruzi. Neste caso, o SH foi um activador da peptidase que causou um aumento significativo (até 6 vezes) da actividade da peptidase medida com um substrato sintético. Além disso, o HS aumentou a libertação da cinina do cininogénio de alto peso molecular por cruzipain in vitro, bem como por tripomastigotos vivos e reduziu as propriedades inibitórias do cininogénio para cruzipain . Similarmente, HP foi recentemente mostrado para modular a atividade da cathepsina l-like peptidase rCPB2. 8 de Leishmania mexicana . Neste caso, HP e HS, mas não CS ou DS, inibiram a hidrólise de Z-Phe-Arg-AMC por um mecanismo misto hiperbólico e afetaram a conformação da proteína . Ao todo, estes exemplos mostram que as interações com GAGs não estão restritas às catepsinas de cisteína endógena, mas também podem desempenhar papéis diversos nas interações hospedeiro-patógeno e podem atuar tanto como parte da Defesa do corpo contra patógenos invasores ou como fatores que contribuem para os mecanismos invasivos do patógeno.
8. O alvo farmacológico
catepsina K representa actualmente o alvo farmacológico mais atractivo entre as catepsinas, embora a catepsina S seja também um alvo relevante em doenças associadas a uma resposta imunitária elevada, tais como asma brônquica e psoríase . Vários inibidores da catepsina K estão actualmente em desenvolvimento, que visam o local activo da enzima (recolhida ). Neste momento, o inibidor mais promissor é o odanacatib (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station ,NJ, USA), a nitrile warhead-containing inhibitor, highly selective for cathepsin K. Os ensaios clínicos de fase III para odanacatib foram concluídos com sucesso e espera-se que os pedidos de aprovação sejam apresentados em breve. Se aprovado, o medicamento posicionar-se-á no mercado contra outros medicamentos de nova geração, tais como o anticorpo anti-rank-ligand denosumab (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, USA) e a teriparatida, uma forma recombinante da hormona paratiroideia (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA), bem como os bifosfonatos bem estabelecidos . Atingir a interacção catepsina K / condroitina-sulfato representaria uma alternativa a estes tratamentos. O sulfato de condroitina endógena é suficiente para exibir um efeito de activação máximo sobre a catepsina K e a sua digestão reduz a actividade da catepsina K em 40% . Uma redução da remodelação óssea desta magnitude seria provavelmente suficiente para o tratamento de doentes com uma redução da densidade óssea menos grave. Um benefício adicional seria o facto de a actividade da catepsina K per se, bem como a viabilidade e a contagem celular dos osteoclastos e osteoblastos permanecerem intocadas.
conflito de interesses
os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.o trabalho foi apoiado por subvenções da agência de investigação eslovena (P1-0140 e J1-3602) a Boris Turk.
