célula Humana superfície marcador de triagem

hESC e hPSC-equipamento de proteção RESPIRATÓRIA células foram dissociadas em células individuais usando TrypLE por 5-10 min. As vesículas ópticas foram dissociadas em células únicas utilizando Trípulas Select (Gibco, Invitrogen) durante 10 minutos, seguidas de dissociação física através de uma agulha de 20 g. Para permitir a análise simultânea destas diferentes populações na mesma amostra, as células de hESC, hPSC-RPE e as células da vesícula óptica foram rotuladas com CellTrace™ CFSE (0,25 µM) por 7 minutos a 37 °C ou CellTrace™ Violet (5 µM) por 20 minutos a 37 °C, seguindo o protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific). Em seguida, os três tipos de células foram manchados usando os painéis de triagem BD Lyoplate™ (Biociências BD) seguindo o protocolo do fabricante. A codificação de células permitiu distinguir facilmente os três grupos de células e minimizar a variabilidade da amostra durante o rastreio. Amostras foram analisadas em placas de 96 poços em uma LSRFortessa equipada com lasers 405, 640, 488, 355 e 561 nm (Biociências BD) ou um CytoFLEX equipado com lasers 405, 638, 488 e 561 nm (Beckman Coulter). As células não viáveis foram excluídas da análise utilizando um corante de ácido nucleico (Biociências BD) de 7-AAD (7-aminoactinomicina d). A análise dos dados foi realizada utilizando o software FlowJo v. 10 (Tree Star). A tela de marcação da superfície celular foi realizada uma vez para vesículas ópticas 3D, e uma vez para hPSC-RPE dia 60.

cultura celular

linhas hESC HS980 e HS983 foram previamente derivadas e cultivadas sob condições livres de xeno e definidas 30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745: 31/3). Os dadores deram o seu consentimento informado para a derivação e subsequente utilização das linhas de hESC. A linha de HESC WA09/H9 foi obtida a partir de Wicell e foi adaptada para a cultura sem alimentador em hrLN-521 (10 µg/mL, Biolamina). As células foram mantidas por propagação clonal em placas revestidas de hrLN-521 em meio nutristem hPSC XF (indústrias biológicas), em uma incubadora de 5% de CO2/5% de O2, e passaram enzimaticamente a uma razão de 1:10 a cada 5-6 dias.

hiPSC as linhas CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I e CTRL-14-II foram gentilmente fornecidas pelo Instituto Karolinska IPSC Core facility (Swedish Ethical Review Authority: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Os dadores deram o seu consentimento informado para a derivação e subsequente utilização das linhas hiPSC. As células foram mantidas por propagação clonal em placas revestidas de hrLN-521 (Biolamina) em meio NutriStem hPSC XF (indústrias biológicas), em uma incubadora de 5% de CO2/5% de O2 e passaram enzimaticamente a 1:10 cada 5-6 dias.

para a passagem, as culturas confluentes foram lavadas duas vezes com solução salina tampão de fosfato (PBS) sem Ca2+ e Mg2+ e incubadas durante 5 minutos a 37 °C, 5% de CO2/5% de O2 com selecção Tríplice. A enzima foi então cuidadosamente removida e as células foram recolhidas em meio NutriStem fresco pré-aquecido hPSC XF através de uma pipeta suave para obter uma suspensão unicelular. Centrifugaram-se as células a 300 × g durante 4 minutos, o sedimento ressuspendeu-se em meio hPSC XF NutriStem fresco e pré-aquecido, e células revestidas com um prato recentemente revestido hrLN-521. Dois dias após a passagem, o meio foi substituído por um novo meio NutriStem hPSC XF pré-aquecido e alterado diariamente.

diferenciação da monocamada hPSC-RPE

um protocolo passo-a-passo que descreve o protocolo de diferenciação pode ser encontrado no protocolo Exchange 36. a hESC ou hiPSC foram banhadas a uma densidade celular de 2,4 × 104 células / cm2 em pratos revestidos com laminina (20 µg/mL) utilizando meio NutriStem hPSC XF. O inibidor Rho-cinase (Y-27632, Millipore) a uma concentração de 10 µM foi adicionado durante os primeiros 24 h, enquanto as células foram mantidas a 37 °C, 5% CO2/5% O2. Após 24 h, o meio hPSC foi substituído pelo meio de diferenciação NutriStem hPSC XF sem fator básico de crescimento fibroblástico (bFGF) e fator de crescimento transformador-β (TGFß) (indústrias Biológicas) e as células foram colocadas a 37 °C, 5% CO2/21% O2. A partir do dia 6 após o revestimento, 100 ng/mL de Activin a (R&d Systems) foi adicionado à mídia. As células eram alimentadas três vezes por semana e mantidas durante 30 dias. As monocamadas foram então tripsinizadas utilizando Tryple Select (Gibco, Invitrogen) durante 10 minutos a 37 °C, 5% de CO2. A enzima foi cuidadosamente removida e as células foram recolhidas em meio NutriStem HPSC XF fresco pré-aquecido, sem bFGF e TGFß, através de uma pipeta suave para obter uma suspensão unicelular. As células foram centrifugadas a 300 × g por 4 minutos, o pellet foi em suspensão, passada através de uma célula de filtro (ø 40 µm, BD Biosciences), e as células foram semeadas em laminina-revestido pratos (hrLN-111 e hrLN-521 às 20 mg/mL) em células diferentes densidades variando de 1,4 × 106 1,4 × 104 células/cm2. As células replacadas foram alimentadas três vezes por semana durante os 30 dias seguintes com meio NutriStem hPSC XF sem bFGF e TGFß. Para a diferenciação hPSC-RPE in vitro em suspensão 3D EBs, seguimos o nosso protocol10 previamente publicado. Brevemente, as células estaminais pluripotentes foram cultivadas para confluência em rhLN-521 e raspadas manualmente para produzir EBs utilizando uma ponta de pipeta de 1000 µL. O EBs foi então cultivado em suspensão em placas de fixação baixas (Corning) a uma densidade de 5-7 × 104 células/cm2. Differentiation was performed in custom-made NutriStem hESC XF medium in which bFGF and TGFß have been eliminated with media change twice a week. Dez micromoles de inibidor Rho-cinase (Y-27632, Millipore) foram adicionados às culturas de suspensão apenas durante as primeiras 24 horas. após 5 semanas de diferenciação, as áreas pigmentadas foram mecanicamente cortadas da EBs usando um bisturi. As células foram então dissociadas utilizando TrypLE Select, seguido de rubor através de uma agulha e seringa de 20 G. As células foram semeadas através de um filtro de células (ø 40 µm, Biociências BD) em placas revestidas com LN com uma densidade celular de 0.6-1. 2 × 104 células / cm2 e alimentados duas vezes por semana com o mesmo meio de diferenciação acima referido. Imagens de campo brilhantes foram adquiridas com um microscópio TE2000-S Nikon Eclipse e uma câmera SX170 Canon foi usada para capturar a pigmentação do topo dos poços.

PCR quantitativo em tempo real

RNA total foi isolado utilizando o RNeasy Mais Mini Kit e tratado com DNase isento de RNase (ambos de Qiagen). O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando 1 µg de RNA total em 20 µL mistura de reação, contendo hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa superscript III (Gibco, Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.após 21 ou 30 dias de diferenciação, procedeu-se à triagem das células em culturas hPSC-RPE. As células foram incubadas com os anticorpos conjugados mencionados no gelo durante 30 minutos. Os controlos da FMO foram incluídos para cada condição para identificar e para as células gate-negativo e-positivo. As células manchadas foram então ordenadas utilizando um classificador BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (BD Biosciences) usando o FACSDiva Sofware v8.0.1.

logo após a triagem, 70 000 células diluídas em 100 µL de 2% de FBS e 1 mM de EDTA (Sigma) foram citopinizadas durante 5 minutos a 400 m. p.m.em lâminas de vidro. As lâminas foram deixadas secar durante a noite à temperatura ambiente, seguindo-se a fixação de formaldeído isento de metanol a 4% à temperatura ambiente durante 10 minutos e coloração imunofluorescente.

imunofluorescência

Histologia e imunossupressão tecidular

imediatamente após a eutanásia por injecção intravenosa de 100 mg / kg de pentobarbital (Vet Alfatal. 100 mg / mL, Omnidea), os olhos foram enucleados e a área de injecção de bleb marcada com corante de marcação de tecidos verdes (DTM) (produtos Histolab). Uma injecção intravítrea de 100 µL de solução de fixação (FS), constituída por formaldeído tamponado a 4% (Solvenco AB), foi realizada antes da fixação em FS durante 24-48 h e com incorporação em parafina. Quatro seções seriais de micrômetro foram produzidas através da área marcada com TMD e cada quatro seções foram manchadas com hematoxilina-eosina.

para a imunoformação, as lâminas foram desparafinizadas em xileno, desidratadas em álcoois graduados e enxaguadas com ddH2O e solução salina com tampão Tris (TBS, pH 7.6). A extracção do antigénio foi obtida em tampão citrato de 10 mM (citrato trissódico di-hidratado, Sigma-Aldrich, pH 6.0) com 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) a 96 °C durante 30 minutos, seguido de um arrefecimento de 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas com TBS e bloqueadas durante 30 minutos com 10% de soro normal de burro (Abcam) diluído em TBS contendo 5% (w/v) de IgG e albumina sérica bovina sem protease (Jackson Immunoresearch) numa câmara humidificada. Primária de anticorpos diluído em tampão de bloqueio foram incubadas overnight a 4 °C: humanos nuclear mitotic aparelhos de proteína (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), o BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432), e CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone ) (Complementar Dados de 2). Anticorpos secundários (burro anti-rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 e burro anti-mouse IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, ambos da Thermo Fisher Scientific) (Dados Suplementares 2) diluído 1:200 em tampão de bloqueio foram incubadas 1 h à temperatura ambiente. As seções foram montadas com Vectashield vetorial com DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) suporte de montagem (laboratórios vetoriais) sob um revestimento de 24 × 50 mm2.

Para imunohistoquímica, slides foram deparaffinized seguido por antigen recuperação (ER2 solução, pH 9, 20 min, a Leica Biosystems) e coloração (IHC Protocolo F) para CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) e CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone ) anticorpos (Dados Suplementares 2) na Bond RXm instrumento (Leica Biosystems).imagens foram tiradas com o microscópio confocal Olympus IX81 de fluorescência invertida ou com o microscópio de varrimento confocal de Zeiss LSM710-NLO point. A análise pós-aquisição das imagens foi realizada usando o software ImageJ.os pos de bovinos marcados com fluoresceína foram isolados e gentilmente administrados pelo Dr. E. F. Nandrot do Institut de la Vision, Paris37. as células hPSC-RPE foram cultivadas na membrana transwell (0, 33 cm2, Corning) revestidas com hrLN-521 20 µg/mL durante 1 mês após a sementeira. As células foram incubadas a 37 ° C ou 4 ° C durante 16 h, com uma postura descongelada/Transwell diluída em DMEM (meio de Águia modificada de Dulbecco) ou em meio independente do CO2 (ambos da Thermo Fisher Scientific), respectivamente. Após a incubação, as células foram extintas com a solução Azul de Trypan 0.2% (Gibco, Invitrogen) durante 10 minutos à temperatura ambiente, fixado a 4% de formaldeído livre de metanol (Polissciências) à temperatura ambiente durante 10 minutos, e permeabilizado a 0,3% de Triton X-100 em D-PBS durante 15 minutos. A coloração da rodamina faloidina (1: 1000, 20 min à temperatura ambiente, Biotinum 00027) (dados suplementares 2) foi usada para visualizar os limites das células. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33342 (1:1000, 20 min à temperatura ambiente, Invitrogen).imagens foram adquiridas com o microscópio confocal de varredura de ponto Zeiss LSM710-NLO. A análise pós-aquisição das imagens foi realizada usando Imaris (Bitplane) e quantificações POS foram feitas com o software CellProfiler 2.1.1. Módulos utilizados: imagens de carga, ColorToGrey, Identificaçãodeobjectosmarceiros, Medidaobjectosazesape, SaveImages e ExportToSpreadsheet. Objetos foram identificados por um diâmetro típico de 10-40 unidades de pixels usando duas Classes, Global, Otsu, método de determinação do limite de variância ponderada com 0.01 e 1.0 limites inferior e superior, e 2.1 fator de correção, com objetos agrupados distinguidos pela intensidade.as células hPSC-RPE foram cultivadas em membranas Transwell (0, 33 cm2, Millipore) revestidas com substratos diferentes. Recolheram-se sobrenadantes dos lados apical e basal do hPSC-RPE (ou seja, compartimentos superior e inferior do transwell, respectivamente) 60 h após a alteração do meio. Os níveis de secreção de PEDF foram medidos em triplicados para cada condição com Kits ELISA para PEDF humanos disponíveis comercialmente (BioVendor RD19114200R) foram utilizados, de acordo com as instruções do fabricante, após 60 dias de cultura. A densidade óptica foi medida usando o leitor de Microplacas SpectraMax 250 (dispositivos moleculares). Os resultados são apresentados como média ± SEM.as medições do TEER foram efectuadas utilizando o medidor de resistência eléctrica volt-ohm do Millicell (Millicellers-2, Millipore), de acordo com as instruções do fabricante. Culturas de sessenta dias foram equilibradas fora da incubadora à temperatura ambiente durante 15-20 minutos antes da experiência. Medições foram realizadas em meios de cultura inalterados em triplicado para cada condição, em três posições diferentes de cada poço. Foram utilizadas médias para uma análise mais aprofundada. A resistência de fundo foi determinada a partir de uma inserção de cultura em branco no mesmo meio revestido com o substrato correspondente, mas sem células, e subtraída da respectiva condição experimental. As medições são relatadas como resistência em ohms vezes a área em centímetros quadrados (Ω × cm2). Os resultados são apresentados como média ± SEM.as células hPSC-RPE do varrimento por microscopia electrónica foram cultivadas em palmilhas transwell revestidas com LN521 (20 µg/mL) durante 60 dias. Eles foram fixados por imersão em 2,5% de glutaraldeído em 0,1 M tampão fosfato, pH 7.4. A membrana transwell foi cortada e lavada em Miliq de água antes da desidratação gradual de etanol e secagem de ponto crítico utilizando dióxido de carbono (Leica EM CPD 030). As pastilhas foram montadas em cubos de amostras usando placas adesivas de carbono e sputter revestidos com uma fina camada de platina (Quorum Q150T ES). Imagens de microscopia eletrônica de varredura foram adquiridas usando um microscópio eletrônico de varredura de campo Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) a 3 kV e o detector SE2.as células hPSC-RPE de transmissão foram cultivadas em palmilhas transwell revestidas com LN521 (20 µg/mL) durante 60 dias. Eles foram fixados por imersão em 2,5% de glutaraldeído em 0,1 M tampão fosfato, pH 7.4. A membrana transwell foi cortada e em tiras finas, enxaguada em tampão fosfato de 0, 1 M, seguida de fixação em 2% de tetroxida de ósmio em tampão fosfato de 0, 1 M, pH 7, 4, a 4 °C durante 2 h. As tiras de membrana foram submetidas a desidratação gradual de etanol e, finalmente, planas incorporadas em LX-112. As seções ultratinas (~50-60 nm) foram preparadas usando uma Leica em UC7 e contrastadas com acetato de uranilo, seguido de citrato de chumbo. A imagem por microscopia eletrônica de transmissão foi feita em um microscópio eletrônico de transmissão Hitachi HT7700 (alta tecnologia Hitachi) operado a 80 kV e imagens digitais foram adquiridas usando uma câmera Veleta CCD (Olympus Soft Imaging Solutions).

A análise Bioinformática de ARN-sequenciação de células monocelulares

as células hPSC-RPE de sessenta dias foram dissociadas usando a seleção de Trípulos e passaram através de um filtro de células (ø 40 µm, Biociências BD). Foram ressuspendidos a uma concentração de 1000 células/µL em 0, 04% de ASC em PBS. As células foram transportadas a 4 ° C para a instalação eucariótica de Genómica de células únicas (ESCG, SciLifeLab, Estocolmo, Suécia), onde uma biblioteca cDNA de 3′ foi preparada para a sequenciação de ARN de células únicas com a plataforma Genómica 10x (10x Genómica) usando o software NovaSeq 6000. Ranger De Telemóvel 2.1.1 (10x Genomics) pipeline was used to convert Illumina base call files to fastq format, align sequencing reads to the hg19 transcriptome using the STAR aligner38, and generate feature-barcode matrices. Célula Ranger de controle de qualidade filtrado células (718, 810, 931, e 1129 célula contendo gotículas foram capturados para CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, novamente plaqueadas 1:20 e hESC amostras, respectivamente) foram analisados em R versão 3.5.1 (R Core Team)39, usando Seurat suite versão 2.3.440,41. Como medida adicional de controlo de qualidade, foram seleccionadas células RPE com genes expressos de forma única (≥2000 a ≤5000), UMIs (≥10 000 a ≤30 000) e Percentagem de mapeamento UMI com genes MT (≥0, 025 a ≤0, 10). Da mesma forma, hESC com genes expressos de forma única (≥2000 a ≤8000), UMIs (≥10 000 a ≤80 000) e Percentagem de mapeamento UMI para os genes MT (≥0, 025 a ≤0, 10). Esta etapa de filtração resultou em conjuntos de dados finais de 616, 725, 779 e 905 células para CD140b+GD2 -, CD140b+CD184 -, replated 1:20 e hESC, respectivamente. Antes da redução da dimensionalidade pela análise principal do componente (PC), a variação célula–célula na expressão do gene impulsionada pelo UMIs, a expressão do gene mitocondrial e os estágios do ciclo celular foram regredidos durante o processo de escala de dados 42. Genes variáveis dentro de amostras de RPE foram selecionados com base em sua expressão e dispersão média normalizada (corte de expressão = 0.0125-5, e corte de dispersão inferior = 0.5). Para a seleção de PC, foram avaliados os achados de PCHeatmap, jackStraw, desvios padrão PC e análise Clustree 43. Os primeiros 15 PCs foram usados para o projeto tSNE 44 e análise de agrupamento (resolução = 0,1, perplexidade = 40).os aglomerados celulares

foram analisados por duas abordagens. Os principais genes diferenciais foram identificados pela primeira vez para cada aglomerado usando o teste rank-sum de Wilcoxon. A expressão do gene de assinatura secundária (pontuações do módulo) foi calculada para hESC indiferenciada e vários tipos de células presentes na retina humana. Células expressando marcadores mesodérmicos foram subdivididas manualmente em um conjunto separado usando características de plotagem interativa de Seurat. Os dados são carregados em ArrayExpress (EMBL—EBI) – veja os detalhes abaixo.

animais

após aprovação pelo Comité de Ética Experimental Animal de Estocolmo Do Norte( DNR N25 / 14), 10 coelhos albinos brancos da Nova Zelândia (fornecidos pela Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Suécia) com 5 meses de idade, pesando entre 3,5 e 4,0 kg foram utilizados neste estudo. Todas as experiências foram realizadas de acordo com a declaração relativa à utilização de animais em estudos oftálmicos e de visão.

transplantação Subretinal

monocelulares hPSC-RPE foram lavadas com PBS, incubadas com Trípulo e dissociadas para suspensão monocelular. As células foram contadas em uma Neubauer hemocytometer câmara, utilizando de 0,4% Trip azul (Thermo Fisher Scientific Corp.), centrifugado a 300 × g por 4 minutos, e o pellet de células foi em suspensão no recém-filtro esterilizado PBS, para uma concentração final de 1000 células/µL. A suspensão celular foi então assepticamente aliquotada em 600 µL unidades e mantida em gelo até a cirurgia.os animais foram sujeitos a anestesia geral por administração intramuscular de 35 mg/kg de cetamina (Cetaminol, 100 mg/mL, Intervet) e 5 mg / kg de xilazina (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), e as pupilas foram dilatadas com uma mistura de 0, 75% de ciclopentolato/2, 5% de fenilefrina (APL). Foram realizadas microcirurgias em ambos os olhos utilizando uma técnica de 2 portas, 25 G de pars plana (Alcon Accurus, Alcon Nordic), tal como descrito anteriormente45. A suspensão celular foi retirada para uma seringa de 1 mL ligada a um tubo de extensão e uma cânula POLYTIP 38G (MedOne Surgical Inc). Sem vitrectomia prévia, a cânula foi inserida através do trocar temporal superior. Após o correto posicionamento da ponta, apurada por uma focal de retina flare, 50 µL de suspensão de células (equivalente a 50.000 células) foi injetado lentamente subretinally ~6 mm abaixo da margem inferior do nervo óptico cabeça, formando um uniforme da bolha que era claramente visível sob o microscópio. Foi tomado o cuidado de manter a extremidade dentro da bleb durante a injecção para minimizar o refluxo. Após a remoção do instrumento, a pressão da luz foi aplicada às esclerotomias sem self-selante. Foram administrados dois microgramas (100 µL) de triamcinolona intravítrea (Triescência, Alcon Nordic) uma semana antes da cirurgia, não tendo sido administrados antibióticos pós-cirúrgicos.para análises estatísticas, foram realizadas análises bidirecionais da variância e comparações múltiplas post hoc utilizando a correcção de teste de Tukey para avaliar as diferenças in vitro das diferentes densidades avaliadas e de triagem versus condições replatadas nos ensaios de secreção de TEER e PEDF.todas as quantificações foram realizadas sem ligação. Parâmetros estatísticos, incluindo as definições e o valor exacto de n (Por exemplo, número total de experiências, replicações, etc.).), desvios, valores P, e os tipos de testes estatísticos são reportados nas figuras, nas legendas das figuras correspondentes, e nesta seção. A análise estatística foi realizada usando Prism 7 (Software GraphPad, versão 7.0 c). Em todos os casos, a análise estatística foi realizada com base em dados de pelo menos três replicados experimentais biologicamente independentes. As comparações entre os grupos foram planeadas antes dos testes estatísticos e as dimensões dos efeitos-alvo não foram pré-determinadas. As barras de erro apresentadas nos gráficos representam a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. Todos os micrografos mostrados são imagens representativas de três experimentos independentes, salvo indicação em contrário (por exemplo, Fig. 1c).o resumo dos Relatórios de investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção da investigação.