a Utilização de ATP farmacêutica pela engenharia de CDKs

Nós gerados mutante ‘Shokat’ CDKs contendo aminoácidos trocas conservado volumosos resíduos em seus ATP binding bolsos. No caso do CDK2 e do CDK3, tratava-se de uma troca de fenilalanina com alanina na posição 80, designada CDK2 (F80A). Nós também sintetizamos 12 análogos ATP para determinar se os CDKs projetados podem usar esses análogos à proteína Retinoblastoma recombinante do fosforilato (Rb) in vitro, e descobriram que eles utilizaram N6-(2-feniletil)-ATP (PE-ATP) de forma mais eficiente (figura 1a, e os dados não mostrados). Embora tanto o tipo selvagem como o cyclin e-CDK2 (F80A) usassem a proteína ATP normal para fosforilar glutationa-S-transferase (GST)-Rb, apenas a f80a kinase poderia usar PE-ATP. Foram obtidos resultados semelhantes com o cyclin e-CDK3, mas neste caso o mutante F80A deixou de poder utilizar o ATP normal, embora a base estrutural para esta observação não seja clara (figura 1a). Estes estudos confirmaram que as cinases de tipo selvagem e de engenharia exibem as especificidades ATP desejadas.

Considerando que o mutante CDKs utilizados de forma eficiente PE-ATP para phosphorylate Rb in vitro, experimentos semelhantes utilizando radiolabeled PE-ATP na célula lisados falhou porque o rotulado de fosfato foi clivadas de PE-ATP, por uma ATPase atividade no lisados (dados não mostrados). Portanto, mudamos para a forma de tiofosfato do análogo ATP (PE-ATP-γ-s), que não foi hidrolisado por lisatos (figura 1b). Embora as cinases geralmente utilizem ATP-γ-s de forma menos eficiente do que o ATP normal, a tiofosforilação tem várias vantagens neste contexto. Em primeiro lugar, os tiofosfatos são mais estáveis e resistentes às fosfatases . Em segundo lugar, uma vez que não existem eventos pré-existentes de tiofosforilação nas células, a rotulagem do tiofosfato fornece marcadores únicos para proteínas fosforiladas pela cinase mutante. Finalmente, o grupo de tiofosfato tem propriedades químicas semelhantes às do grupo sulfidrilo e é passível de modificações químicas. Expressámos e purificámos complexos solúveis de tipo selvagem e cyclin a-CDK2 (F80A) de bactérias e realizámos um ensaio semelhante de Rb kinase para testar a sua capacidade de utilizar PE-ATP-γ-S. Como mostrado na figura 1c, embora ambas as cinases possam usar a proteína GST-Rb (como indicado pela sua mudança de eletromobilidade) apenas o mutante F80A pode usar o PE-ATP-γ-S. Nós, portanto, usamos PE-ATP-γ-s para todos os nossos estudos subsequentes.

purificação de pé único dos peptidos tiofosforilados

o uso de CDKs e análogos ATP de engenharia facilita a fosforilação de substrato altamente específico: o próximo desafio é como identificá-los dentro de um lisato complexo. Procurámos utilizar as etiquetas de tiofosfato para capturar covalentemente e enriquecer peptídeos tiofosforilados após fosforilação e digestão dos lisatos. No entanto, um problema-chave era distinguir quimicamente tiofosfopeptídeos e peptídeos contendo cisteína. Embora um método quimiosseletivo para o enriquecimento de tiofosfopeptídeos tenha sido descrito, a enorme abundância de resíduos de cisteína em uma mistura complexa de proteínas torna esta abordagem difícil . Usámos um método simples de captura e libertação para isolar selectivamente os peptidos tiofosforilados no interior dos lisatos das células tripsinizadas (figura 2a). Proteínas dentro de um lisado foram fosforilada in vitro com cyclin UM-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-S. A proteína mistura foi posteriormente digeridas e a resultante peptídeos foram misturados com Thiopropyl Sepharose 6B , uma ativado bissulfeto de resina que capta a cisteína contendo peptídeos e thiophosphopeptides através de um dissulfeto de troca de reação. Uma vez que a eluição tradicional do ditiotreitol (DTT) liberta ambos os tipos de péptidos ligados, utilizámos as diferenças qualitativas entre os péptidos ligados à resina e os péptidos contendo cisteína na ligação do fosforotiolatesulfeto e da ligação do alquildissulfeto, respectivamente. Com valores de pH elevados, a ligação do fosforotiolatesulfeto é hidrolisada e o alquildissulfeto permanece intacto . O tratamento da resina com uma base forte (como o hidróxido de sódio) liberta especificamente tiofosfopeptídeos (e converte-os também em fosfopeptídeos normais), mas não os péptidos contendo cisteína, por hidrolisamento da ligação fosforotiolatesulfeto (figura 2b). Uma vez que os peptídeos ligados via cisteína não são eluídos na etapa final, não podemos recuperar os tiofosfopeptídeos contendo cisteína. Além disso, a eluição resulta na perda da assinatura do tiofosfato convertendo o tiofosfopeptido num fosfopeptido. O nosso método de isolamento dos tiofosfopeptídeos difere modestamente do de Blethrow et al. na medida em que capturamos os tiofosfopeptídeos usando a química de troca de dissulfetos (resina de dissulfeto) em vez de alquilação (resina de iodoacetamida), e nós os eludimos seletivamente com hidrólise de base ao invés de oxidação.

Para testar a viabilidade desta abordagem, nós fosforilada GST-Rb com cyclin UM-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-S e aplicada, o nosso processo de purificação, para um tripsina resumo da mistura de reação. Os peptídeos isolados foram analisados por espectrometria de massa em tandem de eletrospray (ESI-MS/MS) usando um espectrômetro de massa de armadilha iônica. Os peptídeos foram identificados combinando os espectros de massa tandem com um banco de dados de sequência de proteínas humanas (com sequência GST-Rb adicionada) usando o software SEQUEST . O substrato GST-Rb contém cinco cisteínas, bem como sete locais SP/TP, que são locais favorecidos para a fosforilação CDK . Recuperamos vários fosfopeptídeos contendo apenas e todos os locais de fosforilação esperados (Tabela 1). Além disso, não recuperamos nenhum péptido contendo cisteína e muito poucos péptidos não específicos. Isto constituiu uma prova de princípio para os nossos ensaios em grande escala.

a Identificação dos humanos cyclin UM-CDK2 substratos na célula lisados

o Nosso objetivo foi identificar potenciais cyclin UM-CDK2 em substratos de um proteoma grande escala. Para reduzir a complexidade da amostra, fraccionamos todo o lisado celular das células HEK293 em 11 frações usando cromatografia de troca iônica e precipitação de sulfato de amônio (arquivo de dados adicionais 1). Efectuámos então ensaios in vitro de cinase em cada fracção. Como um controle positivo, nós também adicionamos uma pequena quantidade de GST-Rb a cada reação. Depois de digerir a mistura de reação com tripsina, aplicamos nosso protocolo de purificação para isolar os tiofosfopeptídeos das misturas de peptidos. Os peptídeos recuperados foram submetidos a cromatografia líquida-análise MS/MS e pesquisa de bases de dados. Recuperámos vários números de peptídeos e pelo menos um fosfopeptídeo Rb de cada uma das fracções de lisato (ficheiro de Dados Adicionais 2).

proteínas do fosforilato de CDKs de uma forma orientada para a prolina tanto na serina como na treonina, e numerosos estudos sustentam a ideia de que o motivo S/T-P-X-R/K representa o motivo consensual do CDK. A partir dos fosfopeptídeos, identificamos um total de 203 proteínas: 180 candidatos foram fosforilados dentro do SP ou do TP motifs (Proline-directed; Additional data file 3). Estes substratos candidatos representam uma vasta gama de processos biológicos, incluindo o controlo do ciclo celular, o metabolismo do ADN e do ARN, a tradução e as estruturas celulares (Figura 3). Um total de 96 em 222 (43%) dos sites orientados em prolina conformou-se com o consenso CDK conhecido (com um resíduo positivamente carregado na posição +3). Curiosamente, cerca de 24% dos sites orientados em prolina (53/222) continham um resíduo positivamente carregado nas posições +4 ou +5, sugerindo que este motivo também pode ser favorecido pelo CDK2. De facto, Blethrow et al. observou também que um número substancial de substratos de cyclin B-CDK1 contêm locais não consensuais. Para os peptídeos que continha não-consenso sites, descobrimos que cerca de 50% do correspondente proteínas transportadas pelo menos um K/RXLφ ou K/RXLXφ motivo (onde φ é um grande resíduo hidrofóbico e X é qualquer aminoácido) distal para a fosforilação sites, e quase todos eles realizadas, pelo menos, um mínimo de RXL motivo (dados Adicionais do arquivo de 3). Isto é consistente com a ideia bem estabelecida de que estes motivos promovem a ligação cyclin a-CDK2 a substratos . Além de selecionar para fosforilação com motivos de consenso CDK, identificamos 28 proteínas que foram anteriormente implicadas como substratos CDK (marcadas em negrito no arquivo de Dados Adicionais 3) . Assim, quase 15% dos nossos candidatos já foram encontrados como alvos do CDK, apoiando ainda mais a ideia de que os nossos métodos capturados e enriquecidos para substratos do CDK2. Por último, 43% das fosforilações encontradas foram previamente identificadas em análises de fosfoproteomas in vivo em larga escala, indicando que estas fosforilações não se limitam às nossas condições de lisato .

utilizámos sistemas semelhantes de isolamento dos fosfopeptídeos e cyclin-CDKs conexos, e previmos que poderia haver sobreposições substanciais nos substratos revelados por ambos os estudos. Na verdade, encontramos quase 50% (30/68) dos substratos do cyclin B-CDK1 em nossa lista de candidatos do cyclin a-CDK2; assim, esses métodos são robustos e reprodutíveis (arquivo de Dados Adicionais 4). No entanto, existem também diferenças substanciais entre as duas listas, que provavelmente resultaram de muitos factores, incluindo diferenças processuais, diferentes tipos de células, identificação incompleta do péptido pelo EM e especificidade do substrato conferida pelas subunidades de ciclina e/ou cinase. Algumas destas diferenças podem também reflectir as diferentes funções biológicas do cyclin a-CDK2 e do cyclin B-CDK1. Por exemplo, encontramos nove proteínas envolvidas na tradução de proteínas e/ou função ribossoma, mas nenhuma dessas proteínas foi encontrada com cyclin B-CDK1, apesar de sua abundância relativamente alta.

embora tenhamos identificado um número de substratos CDK2 conhecidos, não identificamos alguns substratos CDK2 previamente descritos. Alguns dos fatores listados acima também podem explicar a falta de encontrar substratos CDK2 conhecidos em nossas análises. Além disso, os substratos já fosforilados pelos CDKs endógenos não teriam sido tiofosforilados in vitro. Também é possível que algumas proteínas não tenham sido solubilizadas durante a preparação do lisato e/ou a fase de sonicação e excluídas das nossas análises. Finalmente, é possível que grandes complexos proteicos possam ter sido interrompidos pelos procedimentos de fraccionamento antes da reação cinase, e que as proteínas que são fosforiladas pelo CDK2 apenas no contexto destes complexos podem não ser descobertas por nossos métodos.também recuperámos quatro fosfopeptídeos correspondentes ao cyclin a e ao CDK2 e 27 fosfopeptídeos adicionais com sítios não orientados para a prolina (ficheiro de dados adicionais 5). Suspeitamos que estes fosfopeptídeos resultavam da auto-fosforilação da ciclina a-CDK2 e fosforilação de fundo por outras cinases, e outros relataram fosforilação de fundo semelhante . Para testar essas possibilidades, realizamos uma reação cinase de controle usando cyclin a-CDK2 (F80A) e PE-ATP-γ-s SEM NENHUM lisato celular adicionado e recuperamos três dos quatro peptídeos cyclin a-CDK2 (arquivo de dados adicionais 5). Além disso, quando realizamos uma reação similar “cinase-only” na presença de γ-32P-ATP, observamos a incorporação de 32P em ambas as proteínas de forma dependente da dose (arquivo de dados adicionais 6). Estes experimentos confirmaram que havia antecedentes de auto-fosforilação de cyclin a-CDK2 nos ensaios originais.

Nós também realizamos reações de cinase de controle usando as frações de lisato, GST-Rb ‘spike-in’, e PE-ATP-γ-s sem a adição de cyclin a-CDK2. Estas reacções de controlo “sem-cinase” fosforiladas 7 dos 27 fosfopeptídeos não-prolina dirigidos na nossa lista (ficheiro de dados adicional 5), o que sugere que a maioria, se não todos, destes fosfopeptídeos resultou da fosforilação de fundo por cinases que são capazes de utilizar o análogo ATP numa extensão limitada. Por exemplo, a maioria destes peptídeos contém locais de fosforilação direccionados para resíduos ácidos que são motivos de caseína kinase 2. Caseína kinase 2 é único na medida em que pode utilizar GTP, bem como ATP; assim, o local ativo pode acomodar os análogos ATP volumosos, tais como PE-ATP . O importante é que não recuperamos nenhum fosfopeptídeo Rb desses experimentos de controle, indicando que não havia atividade CDK não específica em nossos ensaios. Também recuperámos 44 peptídeos não modificados, 12 dos quais continham resíduos de cisteína. A maioria destes peptídeos originou-se de várias frações de lisato (arquivo de Dados Adicionais 2). Suspeitamos que estes resultaram da ligação de baixo nível não específico de peptídeos à resina, apesar das rigorosas condições de lavagem, e no caso dos peptídeos contendo cisteína, de uma pequena quantidade de hidrólise da ligação de alquildissulfeto durante a fase de eluição. Em resumo, os nossos métodos foram altamente selectivos, e os nossos estudos identificaram um grupo surpreendentemente grande de substratos de cyclin a-CDK2 candidatos, a maioria dos quais não foram previamente identificados como alvos CDK.

Validation of candidate substrates as cyclin a-CDK2 targets

we employed several strategies to validate some of the novel candidates in our list as cyclin a-CDK2 substrates. Como as nossas identificações proteicas foram baseadas em sequências de peptídeos, começamos por confirmar que a cyclin a-CDK2 fosforilou três candidatos nativos de comprimento total e que foram imunoprecipitados através de etiquetas de epítopos de 293 células transferidas (EF2, TRF2 e RAP1). Como essas proteínas não estavam presentes na lista cyclin B-CDK1 , determinamos se elas também são fosforiladas pela cyclin B-CDK1. Cada candidato ao CDK2 foi fosforilado tanto pelo cyclin a-CDK2 como pelo cyclin B-CDK1, embora o EF2 tenha sido fosforilado em menor grau do que o TRF2 ou o RAP1 (figura 4a). Também expressámos TRF2, RAP1, e a proteína ribossómica RL12 como fusões de GST e purificámo-los de Escherichia coli. Quando usamos cyclin a-CDK2 para fosforilar TRF2 e RAP1 in vitro, as proteínas eram altamente fosforiladas, e análises de MS revelaram que essas fosforilações ocorreram nos mesmos locais que inicialmente identificamos (figura 4b). Também usamos cyclin a-CDK2 e cyclin B-CDK1 para fosforilar GST-RL12, e descobrimos que ambos os CDKs também fosforilaram RL12 in vitro (figura 4c). Estes estudos confirmam assim que os peptídeos identificados na nossa tela representam proteínas que podem ser fosforiladas pela ciclina a-CDK2, pelo menos in vitro. Embora tenhamos encontrado diferenças qualitativas na capacidade da cyclin a-CDK2 e da cyclin B-CDK1 para fosforilar proteínas específicas, em cada caso os candidatos foram fosforilados por ambos os CDKs. Porque a preparação enzimática nós utilizados nestes estudos continha um excesso de livre CDK2 (F80A), foi considerada a possibilidade de que algum substrato phosphorylations pode resultar da associação endógena cyclins com CDK2 (F80A) que foi monoméricos, ou que pode ter dissociado da cyclin durante as condições do ensaio. Descobrimos que a quantidade de atividade do cyclin B-CDK2 (F80A) nestes extratos era negligenciável em comparação com o cyclin a-CDK2 (F80A), e não conseguimos detectar nenhuma atividade do cyclin e-CDK2 (F80A) (arquivo de dados adicionais 7). No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que alguns peptídeos podem ter sido fosforilada pela CDK2 (F80A) em complexo com um endógena cyclin, e a especificidade de qualquer candidato substrato para cyclin Uma comparação com outros cyclins que ativar CDK2 precisa ser validado como descrito abaixo.

Validação de RL12 como uma vivoCDK2 substrato

acima de estudos validado vários novos candidatos identificados no nosso ecrã CDK2 substratos in vitro. No entanto, para determinar se um novo substrato é também fosforilado pelo CDK2 in vivo, realizamos uma análise mais abrangente da proteína ribossómica RL12. Nós primeiro misturado immunoprecipitates de epítopo marcados cyclin UM-CDK2 e RL12 expressa em células humanas em presença de γ-32P-ATP e descobriu que cyclin UM-CDK2 fosforilada RL12 in vitro (Figura 5a). A fosforilação foi abolida em grande parte em um RL12 mutante, onde a fosfosserina identificada S38 foi substituída por uma alanina, e foi restaurada quando S38 foi substituída por uma treonina (figura 5b). Utilizámos então o mapeamento fosfopeptídeo para identificar o peptídeo que contém S38, e confirmámos que foi fosforilado directamente pelo CDK2 in vitro (figura 5c). Para testar se RL12 também é fosforilada in vivo em um CDK2 dependente da forma e no mesmo local, nós metabolicamente rotulado células com 32P-orthophosphate, e immunoprecipitated tipo selvagem ou RL12-S38A a partir de células overexpressing ou cyclin E-CDK2, catalytically inativos cyclin E-CDK2, ou o inibidor de CDK p21 (para inibir endógena CDKs) . Uma vez que não é possível estudar a fosforilação endógena de RL12 devido à ausência de um anticorpo anti-RL12 adequado, estes estudos examinaram a fosforilação do RL12 ectópico in vivo (estas condições de transfecção levaram a uma sobreexpressão de cerca de cinco a dez vezes do RL12 mRNA (ficheiro de dados adicionais 8). Descobrimos que o tipo selvagem RL12, mas não o RL12-S38A, foi fosforilado in vivo (figura 5d). Esta fosforilação foi aumentada nas células sobreexpressoras da ciclina e-CDK2, mas não inactiva da ciclina e-CDK2, e diminuiu nas células sobreexpressoras do inibidor da CDK p21 (que inibe as cyclin-CDKs endógenas; Figura 5d). Por último, utilizámos o mapeamento dos fosfopeptídeos e as análises do ácido fosfoamino das proteínas rl12 imunoprecipitadas das células rotuladas e confirmámos que a fosforilação RL12 pela cyclin e-CDK2 in vivo também ocorreu em S38 (figura 5e). Foi também notificada fosforilação in vivo por RL12 S38 em estudos com fosfoproteínas .

Apesar de ter validado a cada romance, os candidatos que testamos até agora, mostrando que a duração total de proteínas são fosforilada pela CDK2, alguns candidatos na nossa lista provavelmente vai provar não ser fisiologicamente relevantes cyclin UM-CDK2 substratos. Por exemplo, as reações cinase foram realizadas em lisatos, e a compartimentalização subcelular in vivo pode restringir o acesso do CDK2 a alguns candidatos. Além disso, é possível que outras cinases celulares sejam redundantes ou mais importantes do que o CDK2 em relação a substratos individuais in vivo. É, portanto, fundamental que os candidatos sejam rigorosamente avaliados em um contexto tão fisiológico quanto possível. Para este efeito, em estudos em curso, estamos a utilizar uma abordagem de orientação genética para mutar um subconjunto destes locais de fosforilação nos genes endógenos para estudar o seu significado fisiológico.