resultados

identificação da Cadeia α Do Receptor IL-7 (CD127) como marcador para as células T Da Memória. Ao procurar novos marcadores para definir subconjuntos de células T efetoras e de memória no mouse, analisamos a expressão superficial do receptor IL-7 α-chain / CD127(Fig. 1a). Durante as respostas primárias à Lm, podem distinguir-se subpopulações distintas de populações de células T esplênicas específicas do antigénio com base nos níveis de expressão CD127. Células CD127 de baixa expressão (CD127low) predominam durante a fase efetiva aguda. Durante a transição para a fase de células T de memória, no entanto, as células CD127low gradualmente desaparecem, enquanto as populações que expressam níveis elevados (CD127high) permanecem notavelmente estáveis em tamanho ao longo do tempo (Fig. 1 a E c). Estes valores cinéticos distintos sugerem fortemente que a expressão CD127 é uma característica seletiva para as células T de memória de longa vida. Durante a fase efectora, as células CD127LOW CD8+ T migram preferencialmente para órgãos não-linfóides, enquanto apenas as células CD127high CD8+ T são detectadas em LN (Fig. 1b ). O baço representa um “órgão intermediário” onde todas as diferentes subpopulações são encontradas logo após a imunização (22, 23). Mais tarde, durante a fase de memória, as células T específicas do antigénio em todos os órgãos são caracterizadas por um fenótipo CD127high (Fig. 1 b E c). A comparação das capacidades das células T CD127low e CD127high-specific antigen para proliferarem em resposta à estimulação revelou diferenças marcantes entre os dois subconjuntos. Como mostrado na Fig. 1d, as células CD127high específicas da Listeria purificadas proliferam rapidamente após a estimulação anti-CD3, enquanto as células T CD127low proliferam mal. É pouco provável que estas diferenças na proliferação reflictam uma vantagem das células CD127-positivas através da estimulação IL-7R mediada pela Ab, uma vez que diferentes clones de mAb com actividade activadora ou bloqueadora conhecida do CD127 demonstraram o mesmo efeito em ensaios de estimulação in vitro a curto prazo (dados não apresentados).

Para mais diretamente demonstram que a longo memória viva as células T são exclusivamente presente no CD127 alta expressar compartimento logo após in vivo de desobstrução, realizamos adotivos de transferência de estudos usando um recentemente desenvolvido reversível MHC multimer-técnica de coloração (21), funcionalmente, isolar antígeno-específico T diretamente para as células ex vivo. Após a transferência adoptiva de células T CD127high LLO91–99 específicas de ratinhos infectados durante 10 dias com Lm, as células transferidas foram ainda detectáveis várias semanas mais tarde no baço de ratinhos receptores ingênuos (Fig. 2-A ), enquanto que os números de células após transferência de células CD127low estavam no limite de detecção. Esta observação não foi devida a diferenças de migração in vivo de células cd127 elevadas e CD127low transferidas, porque encontramos diferenças semelhantes para o pulmão (Fig. 2a ) e outros órgãos (LN e fígado, dados não apresentados). Para apoiar ainda mais a interpretação de que as células CD127high T mantêm exclusivamente células de memória específicas do antigénio, os ratos receptores foram desafiados após transferência adoptiva com infecção por Listeria. Mais uma vez, apenas em ratinhos que tinham recebido células T CD127high antes da infecção foi detectável uma rápida expansão das células T transferidas LLO91–99 específicas (Fig. 2b ). Mais uma vez, este resultado não foi devido a diferenças na migração porque a manutenção ou expansão das células T cd127low transferidas não foi detectável em qualquer outro órgão (Fig. (Dados não apresentados). Embora estes resultados de estudos de transferência adotiva apoiem fortemente a hipótese de que as células T de memória longa estão exclusivamente presentes no compartimento de células T CD127high, também observamos limitações substanciais desta abordagem experimental. Em particular, as células T de memória com função efetora imediata parecem ser bastante sensíveis aos experimentos de transferência adotivos e morrem rapidamente após a purificação e aplicação I. V.; embora sobrevivam por meses a anos se não forem tocadas in vivo (11). Assim, embora nossos resultados da transferência adotiva estejam em conformidade com a interpretação de que o CD127 é um marcador para as células T de memória de longa vida, não podemos excluir que os problemas intrínsecos relativos à sobrevivência de subpopulações distintas de células T também contribuam para o resultado dessas experiências.Fig. 2. estudos de transferência adoptiva indicam que as células T de memória longa estão exclusivamente presentes no compartimento CD127-positivo. CD127 CD8+ de alta e baixa expressão, H2-Kd/LLO91–99 células multimer-positivas de BALB / c Thy1.1 ratinhos foram seleccionados directamente ex vivo 10 dias após a infecção por Listeria. As células foram transferidas para ratinhos receptores de BALB/c ingênuos (Thy1.2), e 3 wk mais tarde, os baços e pulmões foram manchados para células dadoras (CD8+ e Thy1.1+). (a) os gráficos de barras resumem dados para números absolutos de Thy1.1+ células por órgão após transferência de células CD127high (abertas) ou CD127low (cheias) de células T. b) a mesma aquisição e apresentação de dados descrita em a, 5 dias após a infecção com 103 Lm.

Co-formação de populações de células T específicas do antigénio com CD127 e CD62L permite a discriminação entre as subpopulações da Célula T Da Memória. Uma caracterização adicional da população de células T CD127high mostrou que ela pode ser subdividida em subpopulações expressando altos e baixos níveis de CD62L (Fig. 3). A análise funcional directa ex vivo (21) das células T purificadas (10-12 dias após a infecção, quando todas as subpopulações são detectáveis simultaneamente no baço) revelou diferenças funcionais adicionais. Enquanto que os subconjuntos das células T Cd62low apresentam actividade citolítica ex vivo vigorosa e imediata, as células T CD127high/ CD62Lhigh demonstram uma lise muito fraca das células alvo revestidas de peptídeo (Fig. 3). Intracelular de citocinas coloração de classificados subpopulações revelou que CD127high/CD62Llow células T, como a CD127low/CD62Llow subconjunto, produzir citocinas efetoras INF-γ e fator de necrose tumoral α; em contraste, o CD127high/CD62Lhigh subconjunto produz IL-2, mas não IFN-γ e fator de necrose tumoral α. Assim, a combinação marcador de CD127 e CD62L permite a identificação de subpopulações de células T com características muito semelhantes às descritas anteriormente em humanos. As células CD127low / Cd62low T demonstram todas as características conhecidas de uma população de células T efectoras reais (TE, actividade proliferativa deficiente, sobrevivência in vivo limitada e função efectora imediata). O subconjunto CD127high/ CD62Lhigh corresponde às características do MCT, e as células CD127high/Cd62low T correspondem à descrição do Met.Fig. 3.

CD127 / CD62L double staining distingue entre subconjuntos de células T CD8+ distintos; resultados semelhantes podem ser encontrados em humanos. Coloração dupla de células CD8+, H2-Kd/LLO91–99 multimer-positivas para a expressão da superfície de CD62L (eixo y) e CD127 (eixo x) após infecção com Lm; são indicadas percentagens relativas de subpopulações em quadrantes. As subpopulações CD127low/Cd62low, CD127high/Cd62low e CD127high/CD62Lhigh foram ordenadas directamente ex vivo 12 dias após a infecção por Listeria e transferidas para diferentes ensaios funcionais. A actividade citolítica foi avaliada após incubação de células separadas na presença de células alvo e peptídeo LLO91–99 (quadrados) ou sem peptídeo (círculos). Foi efectuada uma coloração intracelular da citoquina nas subpopulações específicas de LLO91–99 seleccionadas ex vivo (como indicado acima) para IL-2 (Topo), IFN-γ (meio) e Factor de necrose tumoral α (fundo) após uma breve restimulação in vitro com peptídeo LLO91–99 (áreas negras; as áreas brancas representam controlos não estimulados); são indicadas percentagens de células citocinas positivas.

geração de subpopulações distintas das células T de memória depende da ajuda das células T mediadas por CD40L. Como sentimos que poderia ser problemático basear exclusivamente a interpretação de que a expressão CD127 pode ser usada como um marcador para distinguir entre células T efetoras e de memória de longa vida em experimentos de transferência de células adotivas, decidimos analisar linhas mutantes do mouse com defeitos na geração de memória T. Se CD127 é de fato um marcador de células T de memória “precoce”, devemos ser capazes de identificar diferenças durante os pontos de tempo inicial e final dentro dos subconjuntos CD127-positivos em ratos com defeitos de memória.

Devido a estudos recentes demonstraram a importância das células T de ajuda para a geração de longa duração memória de respostas (2-4), decidimos determinar se a presença ou ausência de CD4+ células T de ajuda durante CD8+ células T de desobstrução leva a diferenças na antígeno de células T específicas subconjunto composições detectado no início posteffector fase. Ratos deficientes em MHC II, que não possuem células T CD4+ convencionais, têm uma resposta de memória CD8+ defeituosa, e a qualidade da proteção diminui ao longo do tempo (2-4). A coloração das subpopulações das células T 10 dias após a infecção primária revelou que o subgrupo CD127high/Cd62low está quase completamente ausente em MHC II–/– ratinhos (Fig. 4a ); as outras subpopulações estão presentes em frequências semelhantes às dos ratos WT C57BL/6. Estes dados demonstram que a ausência de células T ajuda impede a geração eficiente de um subconjunto de células T com um fenótipo de memória efetora, o que parece ser crucial para a rápida expansão in vivo e função efetora.Fig. 4.

As respostas de memória deficientes em MHC II–/– e CD40L – / – ratinhos correlacionam-se com os defeitos iniciais na geração de subconjuntos de células T distintos. a) murganhos deficientes em WT C57BL/6 (esquerda) e MHC II (direita) foram infectados com uma dose subletal de Lm expressante de ovalbumina; gráficos em pontos de células T CD8+, H2-Kb/SIINFEKL-positivas manchadas para CD62L (eixo y) e CD127 (eixo x) 10 dias após a infecção primária são mostrados. b) Número de bactérias viáveis no baço 3 dias após a reinfecção (≈10 × DL50; 5 wk após a infecção primária) com Listeria em CD40L–/– (preenchido) e WT BALB/c (aberto); n = 3 por grupo. c) cinética das células T específicas de LLO91-99 determinada pela coloração do tetrâmero H2–Kd/ LLO91–99 em ratos CD40L–/– ( • ) ou WT BALB / c (□) após infecção primária (0,1 × DL50) e recall (2,5 × DL50; 5 wk após infecção primária) com LMC; três ratos por ponto Temporal. (d) WT BALB/c ratos e CD40L–/– ratos recebeu BrdUrd pela ingestão de água durante a recordar a infecção por Lm (2.5 × DL50; 5 semanas após a infecção primária) durante toda a fase de expansão (dias 1 a 5); ponto gráficos mostram BrdUrd incorporação (eixo x), em T CD8+ células coradas com H2-Kd/LLO91–99 tetramers (eixo y), a coloração foi realizada no dia 5. e) coloração dupla de células CD8+, H2-Kd/ LLO91–99 tetramer-positivas a partir de um rato CD40L–/– BALB/c para CD62L (eixo y) e CD127 (eixo x) 10 dias após a infecção primária (controlo WT BALB/c ver Fig. 2c ). f) O número absoluto de subconjuntos LLO91–99 de células T tetramer positivas no baço foi determinado 10 dias após a infecção primária através da coloração de CD62L e CD127.

Uma vez que mecanismos importantes de ajuda das células T CD4+ são mediados através da interacção de CD40 e CD40L (24– 26), investigámos se o CD40L–/– ratinhos apresenta um fenótipo semelhante ao do MHC II– / – ratinhos. De acordo com outros estudos recentes (27), O CD40L–/– ratinho não demonstrou diferenças na carga bacteriana ou na depuração bacteriana após infecção primária por Listeria (dados não apresentados) e tem respostas primárias primárias CD8+ t normais a uma dose subletal de Lm (Fig. 4c ). No entanto, a sua capacidade de limpar rapidamente a reinfecção com uma dose mais elevada de Lm (≈10 × DL50)é reduzida (Fig. 4b ), correlacionando-se com a diminuição das respostas das células T de memória CD8+ (Fig. 4c ) e um subconjunto CD127high/Cd62low muito reduzido (Fig. 4 e E f) durante a fase inicial do sector pós-sectorial. Durante a reinfecção com Listeria, a proliferação de células T respondentes em ratos CD40L–/– é equivalente à das populações celulares em ratos WT, indicando que o fenótipo não é devido a um defeito geral na capacidade proliferativa das células T de memória (Fig. 4d ) mas sim para reduzir o número de células T de memória capaz de responder imediatamente ao reencontrador de antigénios. Este fenótipo foi demonstrado por experiências de rotulagem in vivo nas quais BrdUrd foi incorporado durante toda a fase de expansão (Fig. 4d ) e através de estudos in vivo de perseguição por impulsos BrdUrd, que monitorizam a perda do rótulo de proliferação (dados não apresentados).

geração reduzida de subconjuntos de células T com um fenótipo de memória Efectora logo após a Primagem é transmitida para o conjunto de células T de memória tardia. Os nossos dados mostram que, na ausência de células T CD4+ ou CD40L, O subconjunto de células T CD127high/Cd62low T é significativamente reduzido logo após a primagem. Além disso, nós (Fig. 4b ) e outros (3-5) demonstraram que a diminuição da ajuda das células T durante a preparação das células T provoca alterações na qualidade da imunidade protectora em relação à reinfecção com Lm ou vírus da coriomeningite linfocítica. Para ligar mais claramente o defeito observado na geração inicial de células T CD127high/ Cd62low com a qualidade da memória subsequente de células T nestes ratos, analisamos mais detalhadamente as populações de células T específicas do antigénio durante a fase de memória (5 wk após infecção primária de Listeria). Neste momento, a análise de células T específicas do antigénio deve ser realizada em células derivadas de diferentes tecidos devido ao seu comportamento migratório distinto. Além do baço, escolhemos LN como um tecido representativo para os órgãos linfóides e o pulmão como um típico compartimento periférico, não-linfóide. Neste momento, as células T específicas do antigénio nestes órgãos são quase todas CD127high (Fig. 1b ); as células do pulmão são Cd62low( dados não apresentados), enquanto que a maioria das células T da memória específica do antigénio no LN são CD62Lhigh (Fig. 5b). Para determinar o número de células T da memória específica do antigénio com função efectora imediata clara nos diferentes órgãos, realizámos coloração intracelular da citocina para o IFN-γ. Como mostrado na Fig. 5a, CD40L – / – ratinhos são caracterizados por um número substancialmente diminuído de células T de memória específica do antigénio com função efectora imediata em comparação com ratinhos WT. Este resultado é verdadeiro no nível de frequências (percentagem) dentro do compartimento de células T CD8+ e em números absolutos (Fig. 5a ). However, MHC tetramer staining of LN-derived lymphocytes(Fig. 5b) revelou números quase idênticos de células T específicas do antigénio com um fenótipo CD62Lhigh. Algumas células T específicas do antigénio Cd62low também são detectáveis em LNs de ratinhos WT, correlacionando-se com as frequências das células produtoras de IFN-γ (Fig. 5a ). Esta população está basicamente ausente em LNs de CD40L – / – mice; todo o subconjunto CD8+/ Cd62low é reduzido em CD40L- / – mice, sugerindo um defeito geral na geração deste subconjunto de células T. Em resumo, nossos dados mostram que a ausência de células CD4+ T dependentes de CD40L ajuda durante o período de primagem resulta em diferenças quantitativas nas subpopulações específicas de antígeno CD8+ T, com um número muito reduzido de células exibindo um fenótipo de memória efetora (CD127high/Cd62low). Estas diferenças quantitativas nas células com função efectora precoce imediata são transmitidas para a fase de memória e afetam a qualidade da imunidade protetora.Fig. 5.

alterações dependentes de CD40L nos subconjuntos das células T logo após a preparação das células T serem transmitidas para o conjunto de células T de memória subsequente. A) Os linfócitos foram isolados a partir de pulmões, baços e LN derivados de ratinhos WT BALB/c ou CD40L–/– 35 dias após a infecção primária com Lm (0, 1 × DL50). A coloração intracelular do IFN-γ foi realizada após uma breve restimulação in vitro na presença de peptídeo LLO91–99 para identificar as células T com função efectora imediata. As parcelas Dot mostram resultados representativos para diferentes órgãos( como indicado); os números indicam as frequências globais das células produtoras de IFN-γ. A primeira linha de gráficos de barras resume os dados para freqüências de IFN-γ-produzir, LLO91–99-células T específicas dentro do CD8+ compartimento; a linha dos gráficos de barra para a direita resume os dados para números absolutos de IFN-γ-produzir, LLO91–99-células T específicas em diferentes órgãos . b) as células LN foram colhidas 35 dias após a infecção primária descrita em A; as células T específicas de LLO91–99 foram detectadas por coloração MULTIMER MHC (parcela de ponto, eixo de y), juntamente com a coloração para a expressão de superfície CD8 e CD62L (parcela de ponto, eixo de x). Gráficos dos pontos representativos são mostrados para as células gravadas nas células CD8+ T; as frequências dentro de cada quadrante estão indicadas. Gráfico de barras para a esquerda resume os dados de frequências de MHCS multimer – e CD62L-positivo células T no CD8+ compartimento; a linha do gráfico de barras para a direita resume os dados para números absolutos de LLO91–99/H2-Kd multimer-positivo das células T em LN (CD40L–/– (preenchido) e WT BALB/c (abra); n = 3 por grupo).