Coxsackievirus B3 (CVB3) é um enterovírus da família Picornaviridae. Após a ligação ao receptor do coxsackievírus e do adenovírus (6, 64), o ARN viral entra no citoplasma, onde é traduzido em uma única poliproteína pela máquina translacional Hospedeira. A poliproteína é então processada proteoliticamente pelas proteases virais para produzir todas as proteínas estruturais e não estruturais virais. A ARN polimerase RNA dependente do vírus transcreve RNAs virais de cadeia negativa, que servem como modelos para a síntese de múltiplos genomas da progênie. Após a embalagem viral, o vírus é libertado, potencialmente sob a influência da proteína 2B codificada pelo vírus (67). Durante o processo replicativo e a libertação da progenitura viral, ocorre o efeito citopático (EPC) e a célula hospedeira é ferida, com eventual perda de viabilidade.os múltiplos processos celulares do hospedeiro são alterados durante a parasitização do picornavírus. A proteína do vírus 2Apro cliva directamente o factor de iniciação eucariótico 4 Gama (eIF4G). A clivagem deste fator de iniciação da tradução não só elimina a tradução de mRNA dependente da PAC (19); acredita-se que os produtos de clivagem estimulam a tradução de mRNA não mapeada, como o genoma do picornavírus Não celular (43), que usa um novo mecanismo interno de entrada de ribossomas para iniciar a tradução de proteínas (31, 76). As proteínas do poliovírus 2Apro e 3cproh demonstraram clivar a proteína de ligação TATA, com 3Cpro também desligando a transcrição de ARN polimerases I, II e III (11, 72, 74). Os fatores de transcrição TFIÍIC (10), CREB (73) e Oct-1 (75) também são clivados por 3Cpro durante a infecção por picornavírus. A proteína 2B do CVB3 demonstrou modificar a permeabilidade do retículo endoplasmático e da membrana plasmática (14), provocando um aumento da concentração citosólica livre de cálcio (28, 67) e lesões de membrana que podem facilitar a libertação da progenitura viral. Gradientes iônicos colapsam (40, 52), e a atividade da fosfolipase é alterada (24, 29). A infecção por CVB3 das células HeLa resulta na fosforilação de duas proteínas celulares por tirosina a 4 h após a infecção, e a inibição destas fosforilações reduz significativamente a produção de progenitura viral (27). É evidente que a infecção é um processo celular dinâmico no qual interações atempadas entre proteínas virais e hospedeiras determinam o resultado tanto para o vírus quanto para as células hospedeiras.

é agora claro que as proteases de cisteína na família das enzimas caspase são moléculas efectoras chave na morte das células apoptóticas. Uma vez ativados, os passos cleave específicas de substratos, incluindo poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) (35), fator de fragmentação do DNA (DFF) (37), gelsolin (34), lamin Um (58), sterol regulatory element-binding proteínas (68), α-fodrin (12, 66), focal adesão quinase (71), e da mdm2 (18), entre muitos outros. Estes eventos de clivagem resultam em alterações importantes nos processos celulares homeostáticos normais e nas alterações estruturais celulares morfológicas-celulares correspondentes.muitos vírus possuem mecanismos bioquímicos para evitar e/ou induzir apoptose nas células em que residem (ver referências 49 e 60). Diferentes vírus interagem em diferentes fases da via da morte apoptótica. Os vírus desenvolveram estratégias visando o complexo de sinalização do receptor FAS ligand-Fas ou o Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)–TNF, a família de Reguladores Bcl-2, ou a família de executores da caspase (49, 60). Os mecanismos de morte das células infectadas com CVB3 permanecem por determinar.; no entanto, existem evidências morfológicas limitadas relativamente à indução de apoptose em células infectadas por picornavírus. As provas obtidas com o vírus da encefalite murina de Theiler (32, 65) e o poliovírus (63) indicaram que as células infectadas por picornavírus são submetidas a apoptose, com base em critérios morfológicos, incluindo condensação nuclear e fragmentação do ADN.

para determinar se as caspases são activadas e responsáveis pelo CPE observado após a infecção por CVB3, células HeLa (American Type Culture Collection, Rockville, Md.) foram infectados, em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 5, com CVB3 (generosamente fornecido por Charles Gauntt, Universidade do Texas Health Sciences Center, San Antonio) ou sham tratados com meio essencial mínimo (MEM) sem soro fetal bovino (FBS) por 45 minutos. As células foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS), e o MEM completo contendo 10% de FBS foi então substituído. Um controlo positivo da apoptose consistiu em células HeLa tratadas com o derivado monoácido do ciclo a (BPD-MA) fotossensibilizador benzoporfirina durante 1 h E depois expostas à luz visível como descrito anteriormente (22, 23). As culturas foram examinadas e colhidas em 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 12 h depois da infecção. As células foram lavadas duas vezes em PBS frios e lisadas em 1 ml de tampão de lise (Tris de 20 mM , NaCl de 137 mM, 10% de glicerol, 1% de fluoreto de Nonidet P-40, 1 mM de fenilmetilsulfonilo, 0,15 U de aprotinina por ml) por área de cultura de 75 cm2. Após uma incubação de 20 minutos no gelo, os sobrenadantes foram recolhidos após centrifugação a 10 000 ×g e armazenados a -20°C para outras análises bioquímicas.o padrão temporal de produção de proteínas virais CVB3, vírus da progenitura e a evolução das alterações morfológicas degenerativas das células HeLa foram considerados em conjunto com um exame das proteínas da morte das células hospedeiras. As amostras de lisato celular foram separadas por electroforese em gel dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida. Proteínas foram transferidas para nitrocelulose (membranas nitrocelulose de Hybond ECL; Amersham). As membranas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente em tampão de bloqueio (PBS com 0,1% entre 20% e 5% de leite magro em pó). Após duas lavagens em tampão de lavagem (PBS com 0.1% Tween 20), as membranas foram incubadas com anticorpos contra o CVB3 (anti-CVB3 policlonal de coelho, 1:1000; produtos químicos precisos). As membranas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem e incubadas com um anticorpo secundário imunoglobulina de burro anti-coelho (Amersham). As membranas foram lavadas três vezes, e as imunoglobulinas secundárias conjugadas com peroxidase-rábano foram detectadas pelo método de quimioluminescência melhorado (ECL, Amersham) e expostas ao filme de autoradiografia de Hiperfilme (Amersham). Foi possível detectar aumentos significativos na síntese proteica viral entre 3 e 5 h após a infecção (Fig.1B). As proteases virais dividem as proteínas virais e hospedeiras logo após a infecção. Através da análise imunoblot com anti-eIF4G monoclonal do Ratinho (1:1.000; laboratórios de transdução), verificou-se que o eIF4G é clivado pela protease vírica 2A a partir de 1 h após a infecção, com uma maior perda de detecção da proteína 220 kDa por 5 h após a infecção (Fig. 1C). A quantidade de CVB3 no sobrenadante celular (vírus libertado) foi determinada em monocamadas de células HeLa pelo método do ensaio em placas com revestimento de ágar descrito anteriormente (3). Resumidamente, o sobrenadante da amostra foi diluído 10 vezes em série, as diluições foram sobrepostas em camadas de 90 a 95% de células confluentes de HeLa em placas de seis poços (Costar), e as células sobrepostas foram incubadas durante 1 h (5% de CO2, 37°C). O meio contendo vírus não-receptor foi removido, e MME quente completo contendo 0,75% de ágar foi sobreposto em cada poço. As placas foram incubadas de 36 a 48 h (5% de CO2, 37°C), fixadas com fixador de Carnoy (95% de ácido etanol–acético ), e manchadas com violeta de cristal de 1%. Progênie de vírus estava presente no sobrenadante em níveis basais entre 1 e 5 h. Por 6 h postinfection houve um aumento detectável no sobrenadante os níveis de vírus, e exponencial vírus produção começou em 9 h postinfection conforme determinado por ensaios de placa (Fig. 1A). As células HeLa exibiram mudanças marcantes na morfologia, incluindo condensação celular, arredondamento e liberação da monocamadora de cultura, entre 6 e 7 h após a infecção, como observado por microscopia de contraste(Fig. 1D).

para determinar se a máquina de morte das células hospedeiras é activada após infecção por CVB3, foi realizada uma análise imunoblot do lisato recolhido em pontos temporais específicos. A Caspase 3, que está presente nas células como uma proteína precursora com uma massa molecular de 32 kDa, é uma molécula primária envolvida na execução da morte celular. Utilizando o ratinho monoclonal anti-caspase 3 (1: 1.000; laboratórios de transdução), determinou-se que as células não infectadas continham a proteína precursora de 32-kDa. Após a infecção por CVB3, o nível da proteína precursora de 32 kDa começou a diminuir entre 7 e 8 h após a infecção, e foi quase completamente indetectável por 12 h após a infecção(Fig.2). Para determinar se a pro-caspase 3 esgotada tinha sido processada proteoliticamente a partir de um zimogénio de cadeia simples para a sua enzima activa de duas cadeias, os lisatos das células HeLa foram incubados com substratos fluorescentes da caspase 3, tal como descrito anteriormente (23). Brevemente, os lisados celulares foram incubadas com tampão de reação (20 mM Tris , 137 mM NaCl, 1% De Nonidet P-40, 10% de glicerol) contendo 100 µM de caspase 3 de substrato acetil-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-metilcumarina (Ac-DEVD-AMC) (Calbiochem, Cambridge, Mass.) ou Z-Asp-Glu-Val–Asp-7-amino-4-trifluorometilcoumarina (Z-DEVD-AFC) (produtos de sistemas enzimáticos, Livermore, Calif.). A mistura de reação foi incubada a 37 ° C durante 2 h, e a excitação por fluorescência de AMC ou AFC a 380 ou 400 nm, respectivamente, foi medida a 460 ou 505 nm, respectivamente, com um citofluorómetro 2350 (Biosystems Perseptive, Burlington, Ontário, Canadá). Usando esta abordagem, a actividade da caspase 3 foi evidente por 5 h após a infecção. O aumento da actividade da caspase 3 de 7 para 10 h após a infecção, quando o nível máximo de activação foi atingido, foi mantido até 12 h após a infecção (Fig. 2). Este ensaio da protease demonstrou que a caspase 3 estava numa forma activa em células infectadas e que era capaz de processar proteoliticamente outras caspases e substratos.Fig. 2. activação e clivagem da 32-kDa proorm após a infecção por CVB3 das células HeLa. A) incubou-se dez microgramas de lisato celular em 150 µl de tampão de reacção contendo o substrato específico Ac-DEVD-AMC da caspase 3. Após incubação a 37°C durante 1 h, os níveis de fluorescência foram determinados com um comprimento de onda de excitação de 380 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Note-se o aumento da fluorescência, que representa a actividade da caspase, que começa após 7 h após a infecção e aumenta para os níveis máximos em 10 h após a infecção. B) os lisatos das células HeLa foram separados por electroforese em gel dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida e transferidos para nitrocelulose. Imunoblotting for the presence of the 32-kDa proform of caspase 3 demonstrates that this protein is processed between 7 and 12 h postinfection.

Caspase 3 cliva substratos específicos de resíduos de ácido aspártico (42). A PARP, uma proteína nuclear envolvida na reparação do ADN (13, 69), demonstrou ser um substrato para a caspase 3 activada, bem como para outras caspases (35). Nas células apoptóticas, a PARP é clivada a partir de uma proteína 116-kDa, produzindo fragmentos de 85 e 25 kDa, determinados com anticorpos para o amino e carboxilo terminal da proteína, respectivamente. Nas células HeLa infectadas com CVB3, a degradação do PARP, com o aparecimento de um fragmento de 85 kDa, foi detectável por 9 h após a infecção, com uma redução adicional dos níveis do peptídeo 116-kDa em 10 e 12 h após a infecção, conforme determinado pela análise imunoblot com anti-PARP monoclonal do Rato (1:2000; Biomol) (Fig. 3).Fig. 3. clivagem específica de substratos de PARP e DFF pela caspase 3 após infecção por CVB3. A) o lisato celular foi obtido a partir de células HeLa infectadas com CVB3, e a análise imunoblot foi realizada com um anticorpo anti-PARP que reconhece um fragmento de clivagem de 85 kDa. Note – se que a clivagem do PARP começou às 9 horas após a infecção, com uma perda marcada da proteína nativa 116-kDa ocorrendo às 10 horas após a infecção. B) O lisato celular foi igualmente analisado para a clivagem da DFF por imunoblotting após infecção por CVB3. Observe a mudança no estado do DFF começando às 9 h após a infecção, com a aparência de um fragmento de 30 kDa.

DFF é uma proteína citosólica que pode ser clivada pela caspase 3 (37). Uma vez clivada, esta proteína libera uma endonuclease que migra para o núcleo, onde pode clivear DNA em locais internucleossômicos, resultando em fragmentação de DNA (16). Foi demonstrado anteriormente que a degradação do ADN internucleossómico é uma característica celular da infecção por picornavírus (32). Como determinado pelo uso de rabbit policlonal anti-DFF (generosamente fornecido por Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas), o DFF é separado de uma proteína de 45 kDa, produzindo um fragmento de 30 kDa começando às 9 h após a infecção, com processamento contínuo e perda da proteína de 45 kDa entre 10 e 12 h pós-infecção (Fig. 3).

para determinar se as caspases produzem directamente o EPC característico que ocorre após a infecção por picornavírus ou são activadas após as alterações morfológicas, as células foram tratadas com o inibidor geral da caspase benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona (ZVAD.fmk). Uma solução-mãe (100 mM em sulfóxido de dimetilo) de ZVAD.a fmk (Bachem) foi diluída em MEM completa para concentrações que variavam entre 0 e 200 µM, e as diluições foram incubadas com células durante 30 minutos antes da infecção ou do tratamento com luz. Após a infecção por CVB3, as células foram lavadas com PBS, e MEM completa contendo 10% de FBS e ZVAD fresco.fmk (0 a 200 µM) foi então substituído. Este péptido demonstrou inibir a indução de alterações morfológicas por múltiplos estímulos apoptóticos (46, 54). ZVAD.a fmk em concentrações de 50, 100 e 200 µM bloqueou tanto a actividade da caspase como a clivagem de PARP e DFF nas células HeLa tratadas com BPD-MA e luz (Controlo Positivo da apoptose) (Fig. 4). Nas células HeLa infectadas com CVB3, a clivagem de PARP e DFF foi parcialmente prevenida pelo inibidor em concentrações de 50 e 100 µM (Fig. 4). Na concentração mais elevada do inibidor (200 µM), não houve evidência de fragmentos de clivagem de PARP ou DFF nas células tratadas com CVB3 às 10 horas após a infecção. A clivagem da Caspase de proteínas estruturais tais como actina, gelsolina, lamina B e cinase de adesão focal é responsável pelas alterações morfológicas observadas após a indução da apoptose (42, 45). Às 2 horas após a fotoactivação do BPD-MA, as células HeLa foram condensadas, tinham uma extensa membrana blebbing, e estavam liberando do monolayer(Fig.5). Em concentrações crescentes de ZVAD.fmk, este fenótipo apoptótico não era aparente, com as células mantendo uma morfologia semelhante à das células de controle(Fig. 5). As células HeLa infectadas com CVB3 foram condensadas e libertaram-se da camada monolayer, mas não exibiram hemorragias nas membranas às 10 horas após a infecção (Fig. 5). Bloqueio da actividade da caspase por ZVAD.a fmk em concentrações até 200 µM não alterou o fenótipo citopático, apesar de a clivagem dos substratos (DFF e PARP) ter sido inibida.Fig. 4. o

ZVAD-fmk inibe a activação da caspase, bem como a clivagem da PARP e da DFF após a infecção por CVB3 ou a indução de apoptose através do tratamento das células HeLa com TPB-MA e luz. A) o lisato celular foi incubado em tampão de reacção contendo o substrato específico da caspase Ac-DEVD-AFC. Após incubação a 37°C durante 1 h, os níveis de fluorescência foram determinados com um comprimento de onda de excitação de 400 nm e um comprimento de onda de emissão de 505 nm. Note-se a ausência de activação da caspase nas células HeLa tratadas com ZVAD-fmk (50 a 200 µM) às 10 horas após a infecção por CVB3 e às 2 horas após o tratamento com BPD-MA e luz. B) O lisato celular foi recolhido das células HeLa tratadas e a análise imunoblot foi realizada com um anticorpo anti-PARP. Note a clivagem equivalente de PARP nas células HeLa infectadas com CVB3 sem ZVAD.FMK e as células HeLa tratadas com luz sem ZVAD.fmk. ZVAD.o tratamento com fmk (50 a 200 µM) de células HeLa impediu o processamento do PARP nas células BPD-MA e HeLa tratadas com luz, enquanto nas células HeLa tratadas com CVB3 o processamento do PARP foi limitado, mas não completamente inibido, pelo tratamento com ZVAD.fmk a 50 ou 100 µM. C) a análise Imunoblot da clivagem da DFF às 10 horas após a infecção por CVB3 e às 2 horas após o tratamento com BPD-MA e a luz mostraram que o padrão de clivagem era semelhante ao da PARP. As culturas infectadas com Sham foram tratadas da mesma forma que as culturas infectadas, sem vírus.

Uma característica clássica dos vírus da família Picornaviridae é o EPC celular após a infecção. Desde a descoberta de uma técnica de cultura celular extraneural para a multiplicação do poliovírus (17), mudanças degenerativas na morfologia celular foram notadas. Descrito pela primeira vez por Robbins et al. (48) em 1950, estes cytopathic alterações nucleares de encolhimento, condensação da cromatina, a célula de arredondamento, e lançamento de camada única, com eventual progressão para acidophilic citoplasma, nuclear pyknosis e fragmentação da cromatina nuclear (karyorrhexis) (47).

a recente compreensão dos mecanismos de morte celular define o palco para o exame das proteínas de morte das células hospedeiras e o seu possível papel no CPE da infecção por CVB3. Muitos vírus inibem ou ativam a morte celular, estratégias que transmitem aspectos distintos da lesão celular, respostas inflamatórias, ou persistência viral. Como mencionado acima, estudos anteriores de picornavírus revelaram as características morfológicas da morte de células apoptóticas, incluindo retração celular, fragmentação do DNA e condensação nuclear (21, 32, 47).

Caspase 3, uma protease de cisteína com homologia para a proteína Ced-3 daaenorhabditis elegans (77), é considerada uma das principais proteínas envolvidas na fase de execução da morte celular. A apoptose induzida por estímulos múltiplos, incluindo Fas, TNF, etoposido, estaurosporina, terapia fotodinâmica, radiação ionizante e retirada do fator de crescimento, envolve processamento pro-caspase 3 e subsequente ativação (15, 23, 30, 33, 51). A partir das 7 às 8 horas após a infecção com CVB3, a pro-caspase 3 está esgotada e os ensaios de activação da caspase demonstraram que esta proteína está clivada na sua forma activa. Várias proteínas podem activar a caspase 3, incluindo a caspase 8 (através da sinalização através dos receptores TNF ou Fas) (55), a granzima B de linfócitos citotóxicos (62) e a caspase 9 (através da libertação do citocromo C mitocondrial e da montagem de factores de activação da protease apoptótica) (36). Uma vez ativada, a caspase 3 pode degradar substratos específicos, o que por sua vez resulta em alterações estruturais e perda de regulação homeostática dos processos celulares. Tem sido demonstrado que numerosas proteínas são clivadas pelas caspases activadas. De forma consistente com a activação da caspase 3, tanto a PSP como a DFF são clivadas após a infecção por CVB3. A activação da Caspase e a fragmentação do ADN estão directamente ligadas através da clivagem da DFF (37). DFF é um fator citosólico humano que consiste em duas subunidades de 45 e 40 kDa, a maior das quais é degradada em polipéptidos menores pela caspase 3. In recent studies by Enari et al. (16) utilizando células de linfoma Murino, isolou-se uma DNase activada pela caspase (CAD). O equivalente Murino da proteína DFF foi isolado e denominado inibidor da CAD (50). A clivagem da Caspase 3 do inibidor da CAD (DFF) permite a translocação nuclear da caspase e a degradação do ADN. DFF é clivado a partir de 9 h após a infecção, resultando em um fragmento de 30 kDa (Fig. 3) que podem ser posteriormente processados para um fragmento de 11-kDa (37). A PARP está localizada no núcleo e está envolvida na reparação do ADN. A clivagem do PARP começa às 9 horas após a infecção, sugerindo que uma vez que as caspases são ativadas no citosol, elas são capazes de acessar substratos localizados em núcleos.de notar, inibição da caspase com o inibidor geral da caspase ZVAD.a fmk não preveniu o CPE induzido pelo CVB3 após a infecção. Entre 6 e 7 h após a infecção, o EPC tornou-se aparente por microscopia de contraste no nosso modelo de infecção CVB3. O tempo entre a infecção e a aparência do EPC, como observado por microscopia de contraste, foi consistente com o ZVAD.concentrações de fmk de 50 a 200 µM. Além de não afetar o tempo para CPE, ZVAD.o tratamento com fmk resultou em células com um aspecto morfológico semelhante ao das células infectadas não tratadas(Fig. 5). Usámos o tratamento com TPB-MA e luz como um método alternativo de indução da apoptose nas células HeLa (22, 23). Inibição da activação da caspase com o inibidor ZVAD.a fmk impediu o fenótipo apoptótico (Fig. 5). A partir destes resultados, concluímos que a actividade da caspase e a clivagem de substratos não explicam a característica CPE associada à infecção por picornavírus, mas são activadas após as alterações morfológicas.o ponto de intersecção do ciclo replicativo viral e a activação da via de morte da célula hospedeira permanece por determinar. A infecção por picornavírus rapidamente resulta na inibição do ARN celular e da síntese proteica (19, 74). Estudos iniciais das relações entre alterações metabólicas induzidas pelo picornavírus e o EPC induzido pelo vírus indicaram que a inibição da síntese proteica e do ARN não estava directamente relacionada com alterações morfológicas celulares (4). Os inibidores da síntese de proteínas e ARN retardaram a morte celular, mas as células apresentaram menos alterações morfológicas do que as células infectadas por picornavírus (5). A inibição da síntese de proteínas e ARN com qualquer um dos agentes múltiplos, tais como actinomicina D, puromicina e toxina da difteria, resulta em apoptose (39). Estudos iniciais realizados em sistemas de infecção por poliovírus mostraram que a puromicina, um inibidor da tradução de proteínas virais e hospedeiras, atrasa o início das alterações citopáticas, sugerindo que certas proteínas virais podem ser directamente citotóxicas (4). Aumentar o MOI leva a um início mais rápido do CPE (observações não publicadas), embora quase toda a tradução de proteína hospedeira é desligada dentro de 3 h em um MOI relativamente baixo (25), como o utilizado neste estudo (MOI = 5). Recentemente tem sido demonstrado que a 2B proteína codificada por coxsackievirus e vírus associados com a membrana celular fracções, incluindo o plasmalemma e retículo endoplasmático, e perturba de iões de movimento, incluindo o movimento de Ca2+ para o citosol (1, 67). O influxo de Ca2 + ocorre na apoptose (7, 44), mas não é claro se o influxo ocorre antes ou após a ativação da caspase. Através do exame das necessidades iónicas das caspases, foi determinado que a concentração de iões de cálcio tem pouco efeito sobre a actividade da caspase (56). Um influxo precoce de cálcio após a infecção por coxsackievírus pode resultar da influência da proteína 2B sobre a permeabilidade da membrana, e o grande influxo tardio de cálcio observado (>6 h pós-infecção) (67) pode ser um efeito a jusante da activação da caspase.durante as fases iniciais da infecção, seria vantajoso para o vírus inibir a morte da célula hospedeira, permitindo assim a produção máxima de descendência viral. Nas fases tardias do ciclo de vida viral, também seria benéfico para o vírus induzir apoptose em vez de necrose. Tal mecanismo de morte é um potencial meio de evasão do sistema imunológico hospedeiro pelo vírus durante a sua libertação para o tecido circundante. A apoptose é caracterizada pela fagocitose rápida das células afectadas sem a libertação de citoquinas pró-inflamatórias (53).demonstrou-se que os vírus

interagem a vários níveis da via apoptótica. Vários gammaherpesvírus (incluindo o sarcoma humano 8 associado a Kaposi), bem como o vírus tumorigénico molluscum contagiosum contêm proteínas inibitórias do piolhos que interagem com a proteína FADD do adaptador Fas e competem para inibir o recrutamento da caspase 8 e subsequente activação (61). A expressão do vírus cowpox serpin CrmA bloqueia a activação mediada pela caspase 8 das caspases a jusante, como a caspase 1 e a caspase 3 (55). As proteínas IAP (para inibidores da apoptose) constituem uma família de proteínas, expressas por baculovírus, que bloqueiam a apoptose induzida pela infecção viral ou pela caspase 1 (78). Além disso, vários homólogos virais da família de proteínas Bcl-2 foram descobertos (2, 8, 20, 70). Adenovírus (9, 20, 57), vírus da peste suína Africana (41), e vírus de Epstein-Barr (26, 41, 59) codificam proteínas (E1B-19K, LMWS-HL, e BHRF1, respectivamente) que apresentam seqüência de homologia a pró-sobrevivência de genes Bcl-2 família.a identificação de proteínas virais que induzem directamente a apoptose não está tão amplamente documentada como a das proteínas virais que inibem a morte celular. O vírus da imunodeficiência humana lentivírus e o vírus da leucemia das células T humanas tipo 1 codificam os reguladores de transcrição Tat e Tax, que têm demonstrado aumentar a expressão de Fas ligand enquanto diminuem a expressão de membros da família Bcl-2 (79, 80). Os produtos genéticos E1A, E3 e E4 codificados pelo adenovírus humano causam a morte celular após expressão na cultura celular. Os genes indutores da morte por adenovírus são expressos no final do ciclo de infecção e, em última análise, sobrecarregam os genes inibidores da morte codificados pelo vírus (38).os nossos dados demonstram que a activação da caspase 3 segue, em vez de preceder, alterações degenerativas morfológicas induzidas pelo CVB3 nas células HeLa infectadas. Substratos específicos do processo das caspases activadas, incluindo PARP e DFF. No entanto, a inibição da actividade da caspase não elimina o aspecto morfológico (EPC) das células infectadas pelo vírus, determinado por microscopia de contraste. O processamento e a clivagem da Caspase dos substratos podem ser importantes na alteração final dos processos homeostáticos normais nas células infectadas e podem facilitar a depuração final das células infectadas pelo vírus. As proteases virais 2A, 3C e 3CD podem clivar proteínas estruturais específicas, resultando em alterações morfológicas consistentes com o CPE, de uma forma análoga à ação das caspases, que clivam substratos separados para alcançar um fenótipo apoptótico distinto.

• Copyright © 1998 American Society for Microbiology

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15.Hug

a inibição da síntese das proteínas das células HeLa após a infecção por poliovírus está correlacionada com a proteólise de um polipéptido de 220.000 dalton associado ao factor de iniciação eucariótico 3 e a um complexo proteico de ligação da tampa.J. Biol. Chem.25719821480614810

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