jeśli chodzi o rozpuszczanie i denaturowanie białek przed ogniskowaniem izoelektrycznym i elektroforezą w żelu 2-D, większość badaczy wybiera mocznik. Nie jest to zaskakujące, ponieważ ten łagodny czynnik chaotropowy może całkowicie zakłócić interakcje między cząsteczkami białka i zwiększyć wydajność aktywności proteazy w trawieniu białek, jednocześnie skutecznie zapobiegając agregacji i/lub wytrącaniu się białek. Ponadto mocznik jest również stosowany do renaturowania białek z wcześniej denaturowanych próbek.

pomimo swojej popularności jako skuteczny denaturant białek, stosowanie roztworu mocznika w trawieniu białek wiąże się ze szczególnym wyzwaniem – zwiększa ryzyko karbamylacji. Dlaczego to cię martwi? Oto kilka powodów, dla których karbamylacja może być szkodliwa dla Twojego eksperymentu i dlaczego należy jej unikać za wszelką cenę.

1. oprócz blokowania N-końcowych końców cząsteczek białka, karbamylacja zakłóca charakterystykę białek i czyni je niedostępnymi do dalszego użycia.
2. agresywnie atakuje łańcuchy boczne reszt argininy i lizyny i czyni białko nieodpowiednim do trawienia enzymatycznego.
3. utrudnia enzymatyczne trawienie białek i niekorzystnie wpływa na identyfikację i kwantyfikację białek w analizie MS.
4. mylą wyniki uzyskane z peptydów z nieoczekiwanym czasem retencji i zwiększają złożoność próbki.
5. zmniejsza efektywność jonizacji i negatywnie wpływa na intensywność sygnału wykrytych pików.
6. indukuje zmianę punktu izoelektrycznego białek i prowadzi do artefaktualnych wyników.
7. może wpływać na wyniki badań karbamylacji in vivo.

Co powoduje Karbamylację?

z definicji karbamylacja odnosi się do modyfikacji potranslacyjnej, która zmienia właściwości strukturalne i funkcjonalne białek. Jest to spowodowane nieenzymatyczną reakcją pomiędzy kwasem izocyjanowym a wolnymi grupami aminowymi.

w roztworach wodnych mocznik występuje w równowadze z cyjanianem amonu. Należy zauważyć, że (1) mocznik w roztworze dysocjuje samoistnie wytwarzając jony cyjanianu i amonu, (2) rozkłada się do kwasu izocyjanowego (CNOH), postaci, która aktywnie reaguje z białkowymi grupami aminowymi i indukuje karbamylację, oraz (3) Szybkość dysocjacji mocznika i zakres karbamylacji zależy od temperatury, pH i czasu inkubacji.

zapobieganie Karbamylacji: kilka przydatnych wskazówek do rozważenia

nic nie może zmienić faktu, że mocznik w obecności ciepła i białek zawsze doprowadzi do karbamylacji. Możesz użyć mocznika najwyższej jakości i nadal ryzykujesz karbamylacją.

na szczęście istnieje kilka sposobów ochrony peptydów przed karbamylacją. Oto kilka skutecznych strategii, które można wykorzystać do osiągnięcia tego celu.

• podczas wykonywania zabiegów proteomicznych należy zawsze stosować świeżo przygotowane odczynniki na bazie mocznika. Stosuj wysokiej jakości bufory na bazie suchego mocznika, wstępnie zmieszane i gotowe do użycia, pochodzące z wiarygodnych źródeł i zachowaj szczególną ostrożność podczas przygotowywania próbek. Uwaga: przechowuj stały materiał w temperaturze pokojowej i utrzymuj obsługę do minimum.
• usunąć mocznik z próbki białka przed trawieniem, stosując dializę i / lub szybką chromatografię fazy odwróconej lub stosując kolumny spinowe.
• utrzymuj próbkę w stosunkowo niskiej temperaturze, aby zmniejszyć szybkość rozkładu mocznika. Należy unikać podgrzewania buforów zawierających mocznik powyżej 37oC, aby zmniejszyć ryzyko karbamylacji.
• Dejonizować roztwór mocznika za pomocą żywicy jonowymiennej w celu zmniejszenia stężenia cyjanianu.
• zakwaszać roztwór mocznika (100 mM HCl), aby utrudnić tworzenie kwasu izocyjanowego.
• używaj odczynników, takich jak etanoloamina, etylenodiamina, metyloamina i Tris-HCl, aby zminimalizować karbamylację białka/peptydu. Odczynniki te pomagają usuwać cząsteczki cyjananu, czyniąc je niedostępnymi dla peptydów.

co prawda strategie te mają swoje wady (tj., wymagają wydłużonego czasu obsługi, indukują wytrącanie łatwo denaturowanych białek i mogą być nieodpowiednie dla licznych technik trawienia enzymatycznego), ale ponieważ trawienie enzymów odbywa się w podwyższonych temperaturach przez długi okres czasu, nie masz wyboru, jak usunąć mocznik z mieszaniny trawionej. W przeciwnym razie zawsze ryzykujesz karbamylację. To ryzyko, którego nie chciałbyś podjąć.