Streszczenie

Syndekan-1 (CD138) jest proteoglikanem przezbłonowym, o którym wiadomo, że ulega ekspresji w różnych prawidłowych i złośliwych tkankach. Jest to interesujące ze względu na możliwą prognostyczną rolę ekspresji różnicowej w nowotworach i jej rolę jako celu dla indatuksymabu, przeciwciała monoklonalnego sprzężonego ze środkiem cytotoksycznym. Aby kompleksowo przeanalizować CD138 w tkankach prawidłowych i nowotworowych, użyliśmy tkankowych mikromacierzy (TMAS) do analizy immunohistochemicznie wykrywalnej ekspresji CD138 w 2518 próbkach tkanek z 85 różnych jednostek nowotworowych i 76 różnych normalnych typów tkanek. Dane wykazały, że ekspresja CD138 jest obfita w guzach. Co najmniej sporadycznie słaba odporność CD138 mogła być wykryta u 71 z 82 (87%) różnych typów nowotworów, a 58 jednostek (71%) miało co najmniej jeden nowotwór o silnym pozytywnym działaniu. W tkankach prawidłowych szczególnie silną ekspresję stwierdzono w prawidłowym nabłonku płaskonabłonkowym różnych narządów, w komórkach przewodu pokarmowego i w hepatocytach. Wysoce standaryzowana analiza większości typów raka u ludzi doprowadziła do uporządkowania nowotworów według częstości i poziomu ekspresji CD138. Odporność CD138 była najwyższa w rakach płaskonabłonkowych, takich jak przełyk (100%), macica szyjki macicy (79,5%), płuca (85,7%), pochwa (89,7%) lub srom (73,3%) oraz w inwazyjnym raku urotelialnym (76,2%). W gruczolakorakach CD138 był również wysoki w raku płuc (82,9%) i jelita grubego (85,3%), ale często niższy w trzustce (73,3%), żołądku (54,2% w typie jelitowym) lub raku prostaty (16,3%). Ekspresja CD138 była zwykle niska lub nieobecna w guzach zarodkowych, mięsakach, nowotworach endokrynologicznych, w tym raku tarczycy i nowotworach neuroendokrynnych. Podsumowując, preferencyjna ekspresja w rakach płaskonabłonkowych w różnych miejscach czyni te nowotwory głównymi celami leczenia anty-CD138, gdy tylko mogą one stać się dostępne. Obfita ekspresja w wielu różnych normalnych tkankach może jednak stanowić przeszkodę w wykorzystaniu CD138 jako celu terapeutycznego.

1. Wprowadzenie

Syndekan-1 (CD138) jest jednym z czterech członków rodziny syndekanów. Jest to białko powierzchniowe komórki składające się z trzech domen strukturalnych, z których jedna jest zewnątrzkomórkowa i wiąże siarczany heparyny i siarczany chondroityny . Syndekan – 1 ma znaczenie dla interakcji komórka-komórka i komórka-macierz . Bierze udział w regulacji proliferacji komórek, migracji i organizacji cytoszkieletu . W normalnych tkankach wiadomo, że CD138 ulega ekspresji na komórkach plazmatycznych i różnych typach komórek nabłonkowych.

ekspresja CD138 w raku jest potencjalnym zainteresowaniem klinicznym, ponieważ specyficzne leki skierowane na CD138 są obecnie oceniane w badaniach klinicznych. W badaniu II Fazy dotyczącym plazmocytoma zgłaszano skuteczność kliniczną i niewielkie działania niepożądane . W badaniach przedklinicznych przeciwciała te wykazały również skuteczność przeciwko potrójnie ujemnemu rakowi piersi i czerniakowi . Jeśli leczenie anty-CD138 okaże się skuteczne, inne typy raka CD138-dodatnie mogą równie dobrze korzystać z takich terapii.

zmieniona ekspresja CD138 została opisana w różnych nowotworach złośliwych. Na przykład, nadekspresję CD138 odnotowano w raku piersi, pęcherza moczowego, pęcherzyka żółciowego, trzustki, jajnika, endometrium i prostaty . W innych typach raka, takich jak rak płuc, głowy/szyi, żołądka, nerek i jelita grubego, ekspresja CD138 była zmniejszona w porównaniu z sąsiednim prawidłowym nabłonkiem . W kilku z tych typów nowotworów zmniejszona lub zwiększona ekspresja CD138 była związana z niekorzystnym fenotypem nowotworu i złym rokowaniem pacjentów . Wcześniejsze badania nad CD138 w raku zastosowały różne odczynniki i protokoły ich immunohistochemicznego barwienia. Prawdopodobnie z tego powodu istniejąca literatura jest wysoce rozbieżna w odniesieniu do występowania ekspresji CD138 w różnych typach nowotworów. Na przykład, zakres zgłaszanej pozytywności CD138 waha się od 26% do 100% w raku pęcherza moczowego, od 23% do 89% w raku płaskonabłonkowego płuc, od 33% do 100% w raku piersi, od 50,5% do 87% w raku płaskonabłonkowym przełyku i od 24,7% do 89,7% w raku płaskonabłonkowym szyjki macicy.

biorąc pod uwagę te heterogeniczne dane, istniejąca literatura nie pozwala łatwo określić tych typów nowotworów, w których CD138 odgrywa szczególnie ważną rolę. Aby porównać częstość występowania i intensywność ekspresji CD138 pomiędzy jednostkami nowotworowymi i zidentyfikować te typy nowotworów, które mogą być optymalnymi kandydatami na leki anty-CD138, przeanalizowaliśmy ponad 2500 nowotworów i 76 prawidłowych tkanek przy użyciu jednego standardowego protokołu. W tym celu zastosowano wielowątkową mikromacierz tkankowy (TMA) zawierający do 50 różnych nowotworów z 85 różnych typów i podtypów nowotworów. Wyniki naszych badań identyfikują szeroki zakres jednostek nowotworowych o wysokiej ekspresji CD138.

2. Materiały i metody

2.1. Mikromacierze tkanek (TMAS)

do badania ekspresji CD138 w normalnych tkankach ludzkich i rakowych wykorzystaliśmy dwa różne zestawy wcześniej istniejących TMAs. Pierwszy TMA składał się z jednej próbki 76 różnych prawidłowych typów tkanek (608 próbek na jednym szkiełku). Druga TMA zawierała łącznie 3642 guzy pierwotne z 85 typów i podtypów nowotworów. Próbki rozdzielono pomiędzy 7 różnych bloków TMA (zawierających od 414 do 522 próbek). Skład TMA jest opisany w tabeli 1 w wynikach. Wszystkie próbki pochodzą z archiwum Instytutu patologii Szpitala Uniwersyteckiego w Hamburgu (Hamburg, Niemcy). Każdy blok TMA zawiera identyczną standardową sekcję kontrolną z 40 plamkami w tkance prawidłowej i nowotworowej w celu kontroli możliwej zmienności immunostacjonarnej. Tkanki utrwalano w 4% buforowanej formalinie, a następnie osadzano w parafinie. Średnica plamki TMA wynosiła 0,6 mm. wszystkie prace były zgodne z deklaracją Helsińską. Świadoma zgoda nie była konieczna.

2.2. Immunohistochemia

świeżo wycięte odcinki TMA poddano immunostabilności w jednym dniu i w jednym eksperymencie. Szkiełka poddano deparaffinizacji i wystawiono na indukowane Cieplnie pobieranie antygenu przez 5 minut w autoklawie w temperaturze 121°C w buforze pH 9 DAKO Target Retrieval Solution. Pierwotne przeciwciało specyficzne dla całkowitego Syndekanu-1 (mysie przeciwciało monoklonalne, klon JASY1, Dianova, Hamburg, Niemcy, rozcieńczenie 1 : 200) stosowano w temperaturze 37°C przez 60 minut. Wiązane przeciwciało wizualizowano następnie za pomocą zestawu EnVision Kit (DAKO, Glostrup, Dania) zgodnie ze wskazówkami producenta. W przypadku tkanek nowotworowych oszacowano procent dodatnich komórek nabłonkowych i zarejestrowano półtrwałą intensywność barwienia (0, 1+, 2 + i 3+). W przypadku analiz statystycznych wyniki barwienia podzielono na cztery grupy. Guzy bez zabarwienia uznano za negatywne. Guzy o intensywności barwienia 1+ w ≤70% komórek i intensywności 2 + w ≤30% komórek uznano za słabo dodatnie. Guzy o intensywności barwienia 1+ w >70% komórek, intensywności 2+ w 30% do 70% lub intensywności 3+ w ≤30% uznano za umiarkowanie pozytywne. Guzy o intensywności 2+ w >70% lub intensywności 3+ w >30% komórek uznano za silnie dodatnie. Kategorie te reprezentują standardowe odcięcia, które inni i my wykorzystaliśmy w licznych badaniach IHC .

3. Wyniki

3.1. Problemy techniczne

w naszej analizie TMA można było zinterpretować łącznie 2518 (69%) Z 3642 próbek tkanki nowotworowej. Przyczyny niepowodzenia analizy obejmowały ułamek brakujących próbek lub próbek pozbawionych jednoznacznych komórek nowotworowych. Analizowano wystarczającą liczbę próbek dla wszystkich 76 prawidłowych typów tkanek, umożliwiając pełną normalną ocenę tkanek.

3.2. Syndekan-1 w prawidłowych tkankach

wszystkie dodatnie immunostainingi CD138 w prawidłowych tkankach podsumowano w tabeli 2. CD138 ulegał ekspresji obficie, głównie w różnych typach komórek nabłonkowych. Szczególnie silna ekspresja CD138 zaobserwowano w płaskonabłonkowych komórkach nabłonkowych różnych narządów (Fig. 1 (a)), komórkach kielicha przewodu pokarmowego (Fig.1(b)), komórkach kolumnowych pęcherzyka żółciowego (Fig. 1(c)) i hepatocytach (Fig. 1(d)). Nie wykryto zabarwienia CD138 w następujących tkankach: aorta/intima, aorta/media, serce (lewa komora), mięsień szkieletowy, mięsień szkieletowy/język, miometrium, wyrostek mięśniowy, przełyk, żołądek, jelito kręte, opad okrężnicy, miednica nerki i pęcherz moczowy, penis (żołądź/ciało gąbczaste), jajnik (zręba), tkanka tłuszczowa (Biała), śledziona, grasica, jajnik (ciałko żółte), jajnik (torbiel pęcherzykowa), tarczyca, móżdżek, mózg, przysadka mózgowa (płat tylny), przysadka mózgowa (płat przedni) i szpik kostny.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

ryc. 1

reprezentatywne obrazy odporności CD138 w tkankach prawidłowych i nowotworowych: (a) prawidłowa wątroba, (b) rak wątrobowokomórkowy, (C) prawidłowy przełyk, (d) rak płaskonabłonkowy przełyku, (e) gruczolak okrężnicy i (f) rak okrężnicy.

3.3. CD138 w tkankach nowotworowych

odporność była głównie błoniasta, ale czasami także w cytoplazmie. Sporadyczne przebarwienia zrębu występowały również, ale nie brano pod uwagę tej analizy. Dodatni wynik CD138 zaobserwowano w 1118 z 2518 analizowanych guzów (Tabela 1). Odporność CD138 uznano za słabą u 330 (13%), umiarkowaną u 226 (9%) i silną u 562 guzów (22%). Reprezentatywne plamy tkanki nowotworowej z ekspresją CD138 przedstawiono na fig. 1 (e) i 1 (h). Co najmniej część ekspresji CD138 można było wykryć w 75 z 85 (88%) kategorii nowotworów, w tym w 60 (71%) kategoriach, w których co najmniej jeden nowotwór wykazywał silne dodatnie wyniki (Tabela 1). Do typów nowotworów, w których we wszystkich analizowanych przypadkach stwierdzono obecność CD138, należały gruczolak podstawnokomórkowy, gruczolak okrężnicy, rak płaskonabłonkowy przełyku, guz z komórek ziarnistych i guz Brennera jajnika. Szczególnie znamienną ekspresję CD138 stwierdzono także w raku odbytu (90,9%), raku płaskonabłonkowym skóry (92,9%), raku wątrobowokomórkowym (97,7%), raku filodowym piersi (94,4%) i guz Warthina przyusznic (92,7%). Typy nowotworów o szczególnie niskiej lub nieobecnej odporności CD138 obejmowały guzy zarodkowe jąder, kilka mięsaków, czerniaka, złośliwego międzybłoniaka i drobnokomórkowego raka pęcherza moczowego.

4. Dyskusja

wyniki tego badania dostarczają kompleksowego przeglądu ekspresji Syndekanu-1 w guzach ludzkich. Dane pokazują, że—we wszystkich organach pochodzenia—raki płaskonabłonkowe (i urotelialne) są szczególnie podatne na ekspresję Syndekanu-1, często na wysokim poziomie. Mimo, że gruczolakoraki pochodzące z jelita grubego i płuc są również wysokimi ekspreserami, immunostaining CD138 wydaje się być na ogół mniej intensywny i rzadziej w gruczolakorakach. Jest to najlepiej widoczne w narządach, w których występują zarówno gruczolakoraki, jak i raki płaskonabłonkowe, jak w szyjce macicy i przełyku. Przewaga komórek płaskonabłonkowych ekspresji CD138 staje się widoczna nawet w nowotworach o identycznej patogenezie, takich jak rak szyjki macicy, Rak jamy ustnej lub rak płaskonabłonkowy odbytu, które często są związane z wirusem brodawczaka ludzkiego. Klinicznie ważne typy nowotworów o niskiej do pośredniej częstotliwości i poziomach ekspresji CD138 obejmują nowotwory nerek i endometrium, podczas gdy niskie częstotliwości pozytywności stwierdzono w raku prostaty, nowotworach endokrynologicznych, w tym raku tarczycy, i nowotworach neuroendokrynnych, a także nowotworach z komórek zarodkowych. Pomimo pewnych odstępstw, nasze dane są w dużej mierze zgodne z literaturą. Kilku innych badaczy wcześniej opisało szczególnie wysoki poziom ekspresji CD138 w raku płaskonabłonkowym .

standaryzowana ocena 85 różnych typów i podtypów nowotworów pozwoliła nam określić kolejność w rankingu w odniesieniu do poziomu ekspresji CD138 w raku. Uważamy, że dane te są szczególnie przydatne dla tych typów nowotworów, dla których wcześniejsze dane były częściowo rozbieżne. Badanie dostarczyło również informacji na temat szeregu istotnych typów nowotworów, dla których do tej pory brakowało danych dotyczących CD138. Należą do nich na przykład rak płaskonabłonkowy sromu i kanału odbytu, gruczolakorak przełyku, nasieniak, rak embrionalny i guz pęcherzyka żółtkowego jąder, drobnokomórkowy rak pęcherza moczowego, guzy neuroendokrynne trzustki, guz chromochłonny, grasiczak, guz zrębu żołądkowo-jelitowego (GIST), mięsak naczyniowy i mięsak lejkowaty. Ponadto uzyskano dane specyficzne dla podtypu dla kilku typów nowotworów, dla których wcześniejsze analizy przeprowadzono na kohortach nowotworowych z mniej szczegółowymi informacjami na temat morfologii nowotworu, takimi jak rak urotelialny, rak piersi, endometrium i rak jajnika. Dane te stanowią zatem kolejny przykład przydatności TMA składającego się z próbek wielu różnych typów nowotworów i normalnych tkanek do kompleksowego scharakteryzowania biomarkera lub przeciwciała (demonstracja naszych danych w porównaniu z poprzednimi badaniami została pokazana na fig .2).

Rysunek 2

przegląd ekspresji CD138 w tkance nowotworowej z różnych badań uszeregowanych według obecnego badania (Czerwony Krzyż), kropki dla badań z danymi specyficznymi dla podtypu, kwadraty dla badań bez danych specyficznych dla podtypu oraz kod koloru wskazuje liczbę guzów włączonych do wcześniejszych badań: czerwony:<10, żółty: 10-25, a czarny: > 25.

różne wcześniejsze badania sugerują związek ze słabym wynikiem pacjentów w przypadku zwiększenia lub zmniejszenia stężenia Syndekanu-1 . Białko CD138 może mieć supresor nowotworu i funkcje promujące nowotwór, które zależą od guza . Nasza kohorta nowotworowa była pozbawiona jakichkolwiek informacji o stadium guza lub wyniku klinicznego. Pośrednie dowody na zmienną rolę różnicowej ekspresji CD138 dla progresji guza pochodzą jednak z porównania powiązanych podtypów nowotworowych. Na przykład, niższy poziom ekspresji CD138 w gruczolakoraku jelita grubego i w inwazyjnym raku urotelialnym (pT2-4) w porównaniu z gruczolakami okrężnicy i nieinwazyjnymi guzami pęcherza moczowego (pTa) dowodzi utraty równoległej progresji nowotworu CD138 w tych guzach. Niższa ekspresja CD138 w chromofobowym raku nerki w porównaniu z jego łagodnym odpowiednikiem oncocytoma może być również postrzegana jako argument za tym, że obniżenie regulacji CD138 jest związane z agresywnością nowotworu w tych nowotworach nerek pochodzących z dystalnego kanalika nerkowego. Jednak wyższe poziomy ekspresji CD138 w raku kory nadnerczy niż w gruczolaku nadnerczy sugerują, że wzrost poziomu CD138 może towarzyszyć progresji tych nowotworów.

CD138 jest białkiem błonowym i jako taki potencjalnym celem terapii przeciwciałami. Istnieją wysiłki w celu opracowania odpowiedniej terapii nowotworów cd138-dodatnich. Wykazano, że CD138 wykazuje nadmierną ekspresję na powierzchni komórek szpiczaka mnogiego, co jest stosowane w badaniach przedklinicznych w leczeniu przeciwnowotworowym indatuksymabem, przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym ze środkiem cytotoksycznym, który jest obecnie oceniany w badaniach przedklinicznych dotyczących plazmakomięsaka i potrójnie ujemnego raka piersi w połączeniu z innymi lekami . Na podstawie naszych danych, raki płaskonabłonkowe, niezależnie od miejsca ich pochodzenia, stają się kolejnymi możliwymi kandydatami do leczenia anty-CD138, gdy takie leczenie okaże się skuteczne i stanie się dostępne. Obfita ekspresja CD138 w różnych normalnych tkankach, w tym płaskonabłonkowym nabłonku z różnych różnych narządów, identyfikuje różne miejsca, w których mogą pojawić się potencjalne skutki uboczne tych terapii.

analiza ekspresji CD138 jest obecnie stosowana w rutynowej patologii diagnostycznej do rozróżniania i ilościowego oznaczania komórek plazmatycznych, na przykład w szpiku kostnym i biopsji endometrium, gdzie obecność komórek plazmatycznych wskazuje na przewlekłe zapalenie błony śluzowej macicy. Oprócz dwóch możliwych WYJĄTKÓW, nasze dane dostarczają niewiele dowodów na analizę ekspresji Syndekanu-1, dostarczając wskazówek diagnostycznych w trudnych sytuacjach diagnostycznych. Niska ekspresja w międzybłoniaku w porównaniu do wysokiej częstości występowania silnej ekspresji w gruczolakoraku płuc sugeruje, że Syndecan – 1 może być potencjalnie dodany do długiej listy przeciwciał, które pomagają odróżnić te jednostki nowotworowe. Niska częstotliwość ekspresji Syndecan-1 (10%) niedawno również zostały opisane dla otrzewnej międzybłoniaka . Ponadto, CD138 był znacznie wyższy w raku wątrobowokomórkowym w porównaniu z rakiem żółciokomórkowym wątroby. Jednak inne przeciwciała, takie jak na przykład arginaza lub BSEP, są lepszymi separatorami tych jednostek nowotworowych .

jest ograniczeniem tego badania, że podejścia immunohistochemiczne, zwłaszcza przy użyciu wizualizacji jasnego pola, nie są optymalne dla ilościowego oznaczania białek. Co ważne, brak odporności nie wyklucza biologicznie istotnej ekspresji CD138 w „ujemnych” normalnych lub nowotworowych komórkach. Każdy protokół określa próg wykrywalności, poniżej którego tkanki są uważane za negatywne. Powyżej tej granicy wykrywalności intensywność barwienia umożliwia pewne oznaczanie ilościowe białek, ale jest to ograniczone przez maksymalne zabarwienie intensywności, które nie może stać się zauważalnie silniejsze w przypadku jeszcze wyższych poziomów ekspresji białka. Co więcej, sporadyczne barwienie zrębu zostało pominięte w naszym badaniu, chociaż inni i my wykazaliśmy, że istnieją dowody na klinicznie istotną rolę ekspresji CD138 w zrębu związanym z guzem. Jednak barwienie zrębu jest rzadkie i wymagałoby większej liczby próbek na typ nowotworu do znaczącej analizy.

podsumowując, badanie to zapewnia kompleksowy przegląd ekspresji CD138 w guzach ludzkich. Preferencyjna ekspresja w rakach płaskonabłonkowych w różnych miejscach sprawia, że nowotwory te są głównymi celami leczenia anty-CD138, gdy tylko staną się dostępne. Obfita ekspresja w wielu różnych normalnych tkankach może jednak stanowić przeszkodę w wykorzystaniu CD138 jako celu terapeutycznego.

dostępność danych

dane immunohistochemiczne użyte do potwierdzenia wyników tego badania są zawarte w artykule.

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

wkład autorów

JI, DP, C H-M, GS, RS, CM i C M-K pomyślano i zaprojektowano badanie, przeanalizowano dane i ZREDAGOWANO rękopis. SW, CF i SK wykonały większość kluczowych analiz immunohistochemicznych. GS, SK i RS były zaangażowane w pierwotną koncepcję badania. TC, FB, FJ i C H-M dostarczyły dane. Ww, VC, AL, AH, DH, GS, SK i KM uczestniczyli w przetwarzaniu tkanek, diagnostyce patologicznej i analizie immunohistochemicznej. DD, AB, CG, AM, GS i RS dostarczyły materiały, dane kliniczne i pomoc techniczną. Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali manuskrypt.