jednak ostatnie badania wykazały, że antybiotyki amfenikolowe wykazywały potencjalne niekorzystne skutki dla zdrowia ludzkiego . Dlatego zastosowania chloramfenikolu są zakazane w wielu krajach, w tym w państwach członkowskich UE, USA i Chinach . Chociaż istnieją oficjalne przepisy dotyczące tych antybiotyków, chloramfenikol jest nadal nielegalnie dodawany do kosmetyków, ze względu na niski koszt i doskonałe działanie przeciwbakteryjne. W celu zapewnienia bezpieczeństwa kosmetyków i utrzymania zdrowia ludzkiego należy opracować wrażliwe, niezawodne i dostępne metody wykrywania chloramfenikolu na poziomach śledzenia w próbkach kosmetyków.

opisano wiele metod analitycznych do wykrywania CAP i powiązanych antybiotyków, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) , chromatografia gazowa (GC) i chromatografia cieczowa-tandemowa spektrometria mas (LC-MS/MS) . Jednak metody te wymagają głównie drogich instrumentów, skomplikowanych procedur wstępnej obróbki i dobrze wyszkolonych sztabów i nie nadawały się do szybkiego przesiewania dużej liczby próbek. Zastosowano testy immunologiczne oparte głównie na rozpoznawaniu swoistym przeciwciało-antygen w celu szybkiego i wydajnego badania przesiewowego docelowych analitów. Substrat chemiluminescencyjny o wysokiej czułości można zastosować w bezpośrednim chemiluminescencyjnym teście immunosorbentów enzymatycznych (CL-ELISA). W porównaniu z konwencjonalnymi protokołami kolorymetrycznymi, czułość testów immunologicznych można poprawić co najmniej 2~3 razy z chemiluminescencją jako substratem.

poprzednie piśmiennictwo na temat immunologicznego wykrywania CAP nie może odróżnić CAP od jego analogów z rodziny amfenikoli (ryc. 1), w tym tiamfenikolu (TAP) i florfenikolu (FF), ze względu na przeciwciała specyficzne o dużej szerokości . W tych badaniach trudno jest określić, czy czapka zanieczyszczenia, jej analogi, czy ich suma, gdy wynik pozytywny. W tych badaniach wykorzystaliśmy przeciwciało monoklonalne o wysokiej specyficzności anty-CAP (mAb), które może wiązać się ze swoistością CAP i nieistotnymi wartościami CR dla większości badanych analogów. Na podstawie tego bardzo mAb opracowano wysoce specyficzną i bezpośrednią metodę CL-ELISA do oznaczania śladowych ilości CAP w kosmetykach. Ten opracowany protokół nie wymaga złożonej reakcji pośredniej koniugacji z drugorzędowym przeciwciałem znakowanym HRP. W przypadku podłoża chemiluminescencyjnego czułość można znacznie poprawić (schemat pokazany na fig.2). Przy użyciu znakowanego HRP anty-CAP mAb, test przeprowadzono w trybie szybkiej bezpośredniej immunoreakcji bez złożonych procedur immunoreakcji. Ta metoda CL-ELISA może być stosowana do specyficznego, szybkiego, półtrwałego i ilościowego wykrywania CAP w kosmetykach, a praca ta przyczyni się do kontroli jakości i regulacji CAP.

Rysunek 2

2. Materiały i metody

2.1. Chemikalia i odczynniki

normy dotyczące chloramfenikolu (CAP), cyprofloksacyny (CIP), florfenikolu (FF), penicyliny (PEN), raktopaminy (RAC), salbutamolu (SAL), sulfadiazyny (SUL) i tiamfenikolu (TAP) zostały zakupione od Sigma Aldrich (Czystość 99%, St.Louis, MO, USA). Zeyang Co. (Pekin, Chiny). SuperSignal chemiluminescence substrat solution został zakupiony w firmie Thermo Fisher (USA). System syntezy Milli-Q otrzymano z Millipore (Bedford, MA, USA) do oczyszczania wody. Inne odczynniki (Klasa analityczna) zostały zakupione od Beijing Reagent Corp. (Pekin, Chiny).

2.2. Osprzęt i oprzyrządowanie

Kostar białe, nieprzezroczyste 96-studzienne płyty z polistyrenu (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) zostały użyte w tym dziele. Czytnik mikropłytowy SpectraMax M5 otrzymano z Molecular Devices (CA, USA). Wirówka MIKRO 22R otrzymywana była z firmy Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Niemcy).

2.3. Bufory i roztwory

w tym opracowanym teście CL-ELISA przygotowano różne bufory i roztwory do testów immunologicznych.

sól fizjologiczna buforu fosforanowego (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4 i 0,2 g KCl rozpuszczono w 1 L dejonizowanej wody.

bufor blokujący (pH 7,4): 0,5% kazeiny w 0,01 M PBS.

bufor powlekający (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3 i 2,93 g NaHCO3 rozpuszczono w 1 L dejonizowanej wody.

bufor rozcieńczania enzymów (pH 7,4): 5% płodowej surowicy bydlęcej w 0,01 M PBS.

bufor myjący (PBST): 0,01% Tween-20 W 0,01 M PBS.

2.4. Konkurencyjna procedura Chemiluminescencyjna ELISA (CL-ELISA)

do reakcji immunologicznej przyjęto białe, nieprzezroczyste płytki polistyrenowe z 96 studzienkami. 100 µL antygenu sprzężonego z CAP rozpuszczono w buforze powlekającym w końcowym stężeniu w 0,00042 ng mL-1, który dodano i inkubowano w temperaturze 4°C przez 20 godzin w celu powlekania. Po trzykrotnym przemyciu buforem płuczącym do każdej studzienki dodano bufor blokujący (150 µL na studzienkę) i inkubowano w celu zajęcia nadmiaru aktywnych miejsc w temperaturze 37°C przez 1,5 h. powlekane płytki przechowywano w temperaturze 4°c przed użyciem.

do analizy nakrętek powlekane płytki mikrotitrowe wstępnie kondycjonowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie do każdej studzienki dodano po kolei 30 µL przetworzonych próbek lub wzorca CAP I 70 µL znakowanego HRP przeciwciała anty-CAP (2,46 ng mL-1) rozcieńczonego buforem do rozcieńczania enzymów. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut w celu bezpośredniej reakcji konkurencyjnej. Po pięciokrotnym umyciu płytki buforem płuczącym dodano Nadsygnalny roztwór podłoża chemiluminescencyjnego (100 µL / studzienkę) i zmierzono intensywność chemiluminescencji każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek SpectraMax M5.

2.5. Krzywa wzorcowa

do oceny krzywych kalibracyjnych zbadano dziesięć różnych poziomów stężenia. Najwyższe stężenie było przy 1000 ng mL-1, A następujące stężenia rozcieńczano seryjnie o jedną trzecią poprzedniego. Każde stężenie przeprowadzono trzykrotnie zgodnie z protokołem CL-ELISA.

b/B0 określa się dla stosunku chemiluminescencji wyników. Tutaj B oznacza intensywność chemiluminescencji o różnym stężeniu standardowym CAP, A B0 oznacza intensywność chemiluminescencji bez standardu CAP w każdym teście.

standardowe krzywe oceniano przez wykreślenie B/B0 przy innym stężeniu standardowym CAP i dopasowanie danych do następującego czteroparametrowego równania logistycznego przy użyciu Origin (Wersja 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):w tym równaniu a oznacza górną asymptotę (współczynnik chemiluminescencji B/B0 bez standardu CAP). B jest nachyleniem krzywej w punkcie przegięcia. C, reprezentujący 50% maksymalnej absorbancji, jest wartością X w punkcie przegięcia. A D jest niższą asymptotą (sygnał tła).

2.6. Przygotowanie próbki do analizy CL-ELISA

próbki kosmetyków (2,00 g ± 0,02 g) ważono dokładnie i przeniesiono do probówek wirówkowych z polipropylenu o pojemności 50 mL. Następnie dodano 20 mL PBS i wir przez 30 s, a następnie ultra-sonikację przez 3 minuty do ekstrakcji czapki. Każdą próbkę odwirowywano w temperaturze 12000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a supernatant zebrano i przesączono przez membranę 0,22 µm. Trzydzieści ilorazów mikrolitrów supernatantu z każdej próbki dodano do powlekanej płytki 96-studzienkowej w celu analizy zgodnie z opracowaną procedurą CL-ELISA.

2.7. Dokładność i precyzja

negatywne próbki kosmetyków z balsamem podkładowym zostały wcześniej potwierdzone analizami UPLC-MS/MS. Następnie każdą próbkę doprawiono standardowym Kapslem w trzech różnych stężeniach 5, 20 i 100 ng L−1. Analizę przeprowadzono zgodnie z opracowanym protokołem CL-ELISA z pięcioma replikatami każdy (n = 5). Stężenia próbek obliczono zgodnie z krzywą kalibracji, a dokładność i precyzję oceniono na podstawie odzysku wszystkich próbek.

3. Wyniki i dyskusja

3.1. Swoistość testu

swoistość metody oceniano poprzez ocenę stopnia reaktywności krzyżowej (CR) ze strukturalnie pokrewnymi związkami CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL i TAP. Wartości CR zostały ocenione za pomocą następującego równania:W tym równaniu IC50 jest połowicznie maksymalnym stężeniem substancji hamującej. Wyniki swoistości mAb anty-CAP przedstawiono w tabeli 1. Na podstawie wyników uzyskano nieistotne wartości CR (poniżej 0,01%) dla wszystkich badanych w tym badaniu analogów, w tym najbardziej związanych ze strukturą TAP i FF. Można wywnioskować, że ten opracowany test CL-ELISA może być stosowany do wykrywania swoistego CAP.

Analogue IC50 (ng mL−1) CR (100%) CAP 0.034 100 TAP >1,000 <0.01 FF >1,000 <0.01 SAL >1,000 <0.01 RAC >1,000 <0.01 SUL >1,000 <0.01 CIP >1,000 <0.01 PEN >1,000 <0.01

Tabela 1

wartość IC50 i reaktywności krzyżowej (CR) analogi nasadek.

3.2. Optymalizacja procedury CL-ELISA

stosunek antygenu do przeciwciał w konkurencyjnym systemie reakcji znacząco wpływa na immunoreakcję. W tym protokole CL-ELISA oceniano i optymalizowano stosunek antygenu do przeciwciał. Stosunek antygenu do przeciwciał 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, i 30: 70. Wyniki zostały zoptymalizowane zgodnie z IC50 i RLUmax (maksymalne względne jednostki światła) i przedstawione w tabeli 2. Wartość IC50 wzrastała znacząco wraz ze wzrostem stosunku przeciwciał. Gdy stosunek antygenu do przeciwciała wynosił 70:30, uzyskano najbardziej wrażliwy wynik z najniższą wartością IC50. Dodatkowo, wysoki odsetek przeciwciał prowadził do wysokiej wartości RLUmax. Jednakże, dla badanych stosunków antygen do przeciwciał, wszystkie wartości RLU były odpowiednie do wykrywania CAP. Ze względu na wysoką czułość podłoża chemiluminescencyjnego nie stwierdzono wyraźnej różnicy wartości RLUmax. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

Antigen antibody ratio IC 50 (ng mL−1) RLUmax 70/30 0.016 2.11E8 60/40 0.017 2.38E8 50/50 0.021 2.45E8 40/60 0.035 2.68E8 30/70 0.033 2.64E8

tabela 2

optymalizacja stosunku przeciwciał antygenowych.

3.3. Czułość

IC50, LOD (mierzone za pomocą IC10) i zakres detekcji (IC20−IC80) uzyskano z sigmoidalnej krzywej kalibracyjnej w celu oceny czułości proponowanego protokołu CL-ELISA (Fig.3). W tym badaniu LOD wynosił 0,0021 ng mL-1, podczas gdy wartość IC50 wynosiła 0,016 ng mL-1 dla CAP. Zakres detekcji tej metody wynosił 0,00979−0,12026 ng mL-1. W porównaniu z ustalonymi testami immunologicznymi, metoda ta wykazywała wyższą czułość i niższą LOD dla CAP .

Rysunek 3

3.4. Dokładność i precyzja

w celu dokładności i dokładności badań obliczono najpierw odzysk czapki w próbkach wzmocnionych. Dokładność i precyzja zostały ocenione za pomocą pięciu replik w ciągu trzech dni walidacji. Przy trzech wzmocnionych poziomach 5, 20 i 100 ng L−1 średnie wartości odzysku CAP w próbkach kosmetyków z dodatkiem spiked primer lotion wynosiły od 82,7% do 99,6%. Zmienność śróddzienna i międzydzienna wynosiła odpowiednio mniej niż 9,8% i 8,2% (wyniki przedstawiono w tabeli 3).

Analyte Spiked level (ng L−1) Recovery (%) Intra-day variation (%) Inter-day variation (%) CAP 5 82.7−99.6 9.8 8.2 20 85.3−98.9 7.9 6.4 100 88.6−96.9 6.1 5.5

Tabela 3

4. Wnioski

w ramach tych badań opracowano nowatorską i bardzo czułą metodę CL-ELISA do wykrywania CAP w kosmetykach. MAb wykorzystany w teście wykazywał wysoką swoistość wobec CAP z nieistotnymi wartościami CR względem jego analogów, szczególnie dla większości struktur związanych z TAP i FF. Na podstawie tego właśnie mAb, proponowana metoda CL-ELISA mogłaby być zastosowana do wykrywania CAP konkretnie zamiast mieszanin CAP i innych analogów. Jest to pierwszy raport CL-ELISA do oznaczania CAP w kosmetykach. Metoda LOD wynosiła 0,0021 ng mL-1, IC50 0,016 ng mL-1, A Zakres detekcji 0,00979 – 0,12026 ng mL−1. W próbkach kosmetyków z kolcami średnie wartości odzysku wahały się od 82,7% do 99,6%, przy czym zmienność śróddzienna i międzydzienna wynosiła odpowiednio mniej niż 9,8% i 8,2%. Test oferuje zalety wysokiej specyficzności, prostoty, szybkich czasów analizy i opłacalności. Pod względem czułości i swoistości opracowana metoda CL-ELISA jest lepsza od większości zgłaszanych testów immunologicznych do wykrywania CAP. Można wywnioskować, że ta opracowana metoda CL-ELISA może być stosowana do specyficznego, szybkiego, semiquantitative i ilościowego wykrywania CAP w kosmetykach.

dostępność danych

dane wykorzystane do potwierdzenia wyników tego badania są dostępne u odpowiedniego autora na żądanie.

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktów interesów dotyczących publikacji niniejszego artykułu.

podziękowania

chcielibyśmy podziękować LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową w przygotowaniu niniejszego manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodowy R&D Key Programme of China (nr 2017YFE0110800), National Natural Science Foundation Of China (nr 31871718) oraz EU Horizon 2020 Research and Innovation action (nr 727864-EU-China-Safe).