Streszczenie

istniejące testy chemotaksji nie generują stabilnych gradientów chemotaktycznych, a zatem—w czasie—funkcjonalnie mierzą tylko niespecyficzny ruch losowy (chemokineza). Dla porównania, technologia mikroprzepływowa ma zdolność do generowania ściśle kontrolowanego mikrośrodowiska, które może być stabilnie utrzymywane przez dłuższy czas, a zatem jest podatne na adaptację do badania chemotaksji. Opisujemy tutaj nowe urządzenie mikroprzepływowe do czułego oznaczania migracji komórkowej i pokazujemy jego zastosowanie do oceny chemotaksji komórek mięśni gładkich w gradiencie chemokin.

1. Wprowadzenie

ukierunkowana migracja komórek odgrywa kluczową rolę w zaburzeniach zapalnych, chorobach naczyniowych, gojeniu się ran i przerzutach nowotworowych . Opracowano szereg metod in vitro w celu ilościowego określenia migracji komórek, w tym zamykanie ran jednowarstwowych („scratch assay”) i komory Boydena . Jednak te obecne metody są stosunkowo niewrażliwe. Co więcej, takie podejścia mogą mierzyć tylko chemokinezę, czyli zwiększony ruch losowy, a nie migrację komórek ukierunkowaną na chemotaksję.

użyteczność transwellów scratch i Boyden chamber jest ograniczona przez ich konstrukcję metodologiczną.

dla testu scratch, zdefiniowana „rana” (scratch) jest wykonana w monowarstwie komórki zbiegu; komórki na krawędziach defektu stopniowo wypełniają pustkę, a czas przywrócenia zbiegu jest określany ilościowo. Szybsza naprawa zarysowania została zinterpretowana w celu odzwierciedlenia wzmocnionej „chemotaksji” z powodu manipulacji komórkami lub natury rozpuszczalnych czynników dodawanych do pożywki. Podczas gdy eksperyment jest koncepcyjnie prosty i technicznie łatwy do wykonania, komórki są kąpane w jednolitym stężeniu środka i nie ma gradientu stężenia chemioatrakcyjnego podczas całego eksperymentu; ruch, który wypełnia lukę, reprezentuje więc tylko „przypadkowy spacer.”Tak więc „migracja” w teście scratch jest w dużej mierze funkcją tylko zwiększonej chemokinezy. Co więcej, jak zwykle wykonuje się—zwłaszcza w ciągu kilku godzin długotrwałego testu—zamknięcie „rany” zarysowania prawdopodobnie obejmuje również znaczny Składnik proliferacji komórek.

Inna najczęstsza metoda pomiaru „chemotaksji” polega na użyciu transwellów komorowych Boydena. Różne stężenia określonych chemokin umieszcza się w dolnej komorze urządzenia, podczas gdy komórki, które mają być poddane ocenie, inkubuje się w górnej komorze; mikroporowata membrana oddziela dwie komory i tworzy wsparcie dla wzrostu komórek i częściową barierę dla migracji. Komórki, które są liczone na dolnej powierzchni błony, lub które gromadzą się w dolnej komorze, są zazwyczaj oceniane w jednym stałym punkcie końcowym. Test ten ma tę zaletę, że widoczna jest ukierunkowana migracja, to znaczy z górnej do dolnej komory, ale nadal jest problematyczna. Po pierwsze, nie ma „gradientu” chemokin od góry do dołu, a raczej tylko jednoetapową funkcję od niskich do wysokich stężeń. Po drugie, nie ma sposobu na utrzymanie różnicy chemokin od górnej do dolnej komory . Początkowo stężenie chemokiny w dolnym przedziale jest większe, ale w ciągu kilku minut do godzin stężenie wyrównuje się w wyniku dyfuzji, w którym to momencie ustaje specyficzna chemotaksja. Zamiast tego, długoterminowe pomiary bardziej prawdopodobne odzwierciedlają znaczący element chemokinezy. Ponadto, gdy komórki wpadają przez błonę i do dolnej komory, nie ma możliwości migracji odwrotnej. Wreszcie, komora Boydena jest również ograniczona, ponieważ liczenie komórek wymaga zakończenia eksperymentu; przebieg czasu wymaga zatem wielu urządzeń.

Technologia Mikroprzepływowa może przezwyciężyć te ograniczenia, generując długotrwały stabilny i kontrolowany gradient rozpuszczalnych czynników, które mogą być stale monitorowane w czasie . Wykorzystując komórki, które zostały potraktowane w celu zablokowania proliferacji, takie urządzenie pozwala na prawdziwą bieżącą ocenę chemotaksji w porównaniu z chemokinezą. Rysunek 1 przedstawia takie urządzenie, w którym stężenie źródła i zlewni jest utrzymywane przez tworzenie odpowiednich Studni, których objętość jest duża w stosunku do strumienia dyfuzyjnego przez łączący kanał hydrożelowy . W stanie stacjonarnym między tymi dwoma studzienkami tworzy się liniowy gradient stężenia. Chociaż przepływ śródmiąższowy przez region hydrożelu może zakłócić gradient, jeśli ciśnienie hydrostatyczne w dwóch studniach nie jest równe, gradienty ciśnienia są eliminowane przez połączenie studni źródłowych i zlewni z dodatkowymi kanałami i zbiornikami, które służą jako drogi o niskim oporze dla przepływu cieczy i równowagi ciśnienia. Gradienty mogą być zatem utrzymywane przez kilka dni i wykorzystywane do badania migracji komórek w sposób wrażliwy i specyficzny z różnymi typami komórek . W prezentowanej pracy opisano zastosowanie takich urządzeń do oceny chemotaksji dla pierwotnych hodowli komórek mięśni gładkich i porównania jej z technikami scratch i Boyden chamber dla czułości.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Device design and stability of concentration gradients as a function of time. a) dolne 3 studnie są studniami komórkowymi i / lub źródłowymi dla chemokin, a górne 3 studnie służą jako zbiorniki do utrzymania równoważnego ciśnienia w dolnych studniach. W zależności od projektu eksperymentalnego, studnie boczne lub studnia Centralna mogą służyć jako studnie źródłowe; komórki w studni Centralnej mogą migrować w kierunku różnych bodźców chemokin po obu stronach, lub różne populacje komórek w studniach bocznych mogą migrować w kierunku centralnego bodźca chemokin. (b, c) gradienty stężenia są pokazane schematycznie po dodaniu wskaźnika fluorescencyjnego barwnika o niskiej masie cząsteczkowej do studni źródła i zbiornika źródła, w ciągu 2 godzin (b) lub 72 godzin (c). d) graficzne wyświetlanie gradientów stężenia od 0 godziny do 72 godzin po dodaniu barwnika fluorescencyjnego do studni źródłowej i zbiornika.

2. Materiały i metody

2.1. Pierwotna Hodowla komórek mięśni gładkich (SMC)

aorty pobrano od 8-tygodniowych myszy C57 / B6 (Charles River, Wilmington, MA) za pomocą sterylnych nożyczek do sekcji. Przylegający tłuszcz usunięto, a aorty inkubowano przez 20 minut w temperaturze 37°C w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco 's Eagle’ s (Dmem; Invitrogen, Grand Island, NY) zawierającej 1% penicyliny/streptomycyny, 2% płodowej surowicy bydlęcej i 5 mg/mL kolagenazy typu II (Invitrogen). Aorty przepłukiwano w zimnym DMEM, a adventitia ostrożnie rozcięto; następnie pocięto na małe kawałki i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C w DMEM zawierającym 1 mg/mL kolagenazy typu i (Invitrogen) i 0,125 mg/mL elastazy typu III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). Po wielokrotnym pipetowaniu w celu dysocjacji tkanki otrzymaną mieszaninę komórkową zawieszono w świeżej „pożywce SMC” (DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną; 2% nieistotnych aminokwasów, 1% L-glutaminą; wszystkie odczynniki z Invitrogenu) i hodowano w temperaturze 37°C w inkubatorze 5% CO2 na płytkach pokrytych 1 mg/mL fibronektyny przez 30 minut. Po ustanowieniu kultury komórkowej (zazwyczaj po pierwszym przejściu), SMC są uprawiane na niepowlekanych plastikowych kolbach (Corning Incorporated, Corning, NY).

SMC były używane od 2 do 7 i były 99.5% czystości według oceny cytometrii przepływowej po zabarwieniu na α-aktynę mięśni gładkich. W celu barwienia komórki są zbierane i utrwalane 1% paraformaldehydem (Sigma-Aldrich) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Przeciwciało α-aktyny sprzężone z FITC (Sigma-Aldrich) w rozcieńczeniu 1: 100 w buforze 10X BD perm/wash (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornia) stosowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki przemywa się dwukrotnie 1% płodowej surowicy bydlęcej w PBS i raz 1% płodowej surowicy bydlęcej w PBS zawierającej 1% formaldehydu i natychmiast analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC-sprzężony izotyp myszy IgG1 (BD Pharmingen) jest używany jako kontrola izotypu. Komórki do testów chemotaktycznych zbierano po osiągnięciu zbiegu.

2.2. Leczenie mitomycyną C

komórki trypsynizowano (0,25% trypsyny-EDTA; Invitrogen) przez 2 minuty w temperaturze 37°C, przemyto pożywką SMC, a następnie inkubowano w postaci jednokomórkowej zawiesiny w 40 µg/mL mitomycyny C (MMC; Sigma-Aldrich) w pożywce SMC przez 30 minut w temperaturze 37°C. Po dwóch dodatkowych płukaniach w PBS komórki oceniano pod kątem żywotności, proliferacji lub zdolności migracyjnej. W przypadku testu gojenia się ran (scratch) leczenie MMC przeprowadzono po poszyciu SMC i gdy komórki były w 100% zbiegające; komórki inkubowano w 40 µg/mL MMC w pożywce SMC przez 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie przemyto dwa razy w PBS przed badaniem.

2.3. Test hamowania proliferacji SMC

Po leczeniu MMC lub inkubacji kontrolnej w pożywce SMC, SMC hodowano w 6-studzienkowych płytkach (Corning Incorporated). Komórki odzyskiwano po 1 h, 24 h lub 48 h metodą trypsynizacji, a liczbę komórek i żywotność oceniano przez zliczanie za pomocą hemocytometru i wykluczenie z błękitu trypan.

2.4. Test gojenia/zarysowania ran

SMC hodowano w 12-studzienkowych płytkach (Corning Incorporated) do zbiegu, a następnie leczono MMC. Po umyciu dodano świeżą pożywkę SMC i monowarstwę komórki zarysowano w powtarzalny sposób za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 µL. Różne stężenia czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF; R&Systemy D, Minneapolis, MN) w nośnikach SMC zostały dodane do każdej studni. Odległość między krawędziami wady zarysowania mierzono i uśredniano z pięciu oddzielnych punktów po 3, 6 i 9 h lub do momentu zamknięcia wady rany.

2.5. Boyden Chamber Transwell Test

100 µL zawiesin SMC przy stężeniu 1,0–1,5 × 105 komórek/mL (1,0–1,5 × 104 komórek ogółem) załadowano do górnych wkładek transwella (Costar, Corning Incorporated) i 600 µL mediów SMC zawierających różne stężenia PDGF umieszczono w dolnej komorze. Po 6 h, 12 h lub 24 h inkubacji, błonę transwell zabarwiono Hoechst 33342 (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta, a transmitowane komórki na dolnej powierzchni policzono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu oprogramowania MetaMorph NX Microscopy Automation and Image Analysis (BioCompare, South San Francisco, CA). W pożywce w dolnej komorze nie zidentyfikowano żadnych komórek. W doświadczeniach mających na celu ocenę, czy migracja komórek reprezentuje chemotaksję lub chemokinezę losową przy braku gradientu stężenia, płytkowy czynnik wzrostu-BB (PDGF) dodano do dolnej komory, tylko do górnej wkładki lub zarówno do górnej wkładki, jak i do dolnej komory.

2.6. Test Urządzenia mikroprzepływowego

urządzenia mikroprzepływowe (Fig .1(A)-1(c)) przygotowuje się w sposób opisany w innym miejscu. Jak pokazano na fig.1(d), gradienty dodawanych odczynników są stabilne przez co najmniej 72 godziny. W zależności od protokołu eksperymentalnego komórki do oceny umieszcza się w studni centralnej, a z dwóch studni bocznych powstają różne gradienty chemotaktyczne. Alternatywnie, migracja dwóch różnych populacji komórek może być oceniana z bocznych studni, doświadczając identycznych gradientów stężenia generowanych przez odczynniki umieszczone w studni centralnej. Stężenia komórek zawsze wynosiły 4-5 × 105 / mL, a 40 µL zawiesin komórkowych (1,6–2,0 × 103 komórki) załadowano do studzienek testowych.

komórki inkubowano w urządzeniach przez różne punkty czasowe, a następnie barwiono Hoechst 33342 (Invitrogen). Lokalizację każdej komórki określono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), a przebyty dystans oceniano za pomocą programu Matlab (MathWorks, Natick, MA). „Całkowita migracja” jest zdefiniowana jako suma odległości migrowanych przez wszystkie komórki poza początkową lokalizację początkową; ten wskaźnik migracji jest używany do analizy statystycznej (Rysunek 2).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

rysunek 2

ocena migracji komórek w urządzeniach mikroprzepływowych. Komórki platerowano w centralnej dolnej studzience urządzenia mikroprzepływowego, z 50 ng / mL PDGF w pożywce SMC umieszczonej w lewej dolnej studzience i samym pożywce SMC umieszczonej w prawej dolnej studzience, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin. (a, b) obraz kontrastu fazowego chemotaksji komórek z kanału centralnego w kierunku PDGF 50 ng/mL w lewym kanale; obrazy są dzielone wzdłuż kanału między zlewem a studniami źródłowymi tak, że pełna długość kanału może być pokazana w powiększeniu wystarczającym do umożliwienia rozdzielczości komórkowej. (c, d) obraz kontrastu fazowego chemokinezy komórkowej z kanału centralnego tylko w kierunku medium SMC. (e, f) obraz fluorescencyjny małej mocy lewego (e) lub prawego; (f) kanał w 48 h po zabarwieniu za pomocą Hoechst 33342. (g) obraz fluorescencyjny O Dużej Mocy lewego kanału w panelu (e); czarny kwadrat bez komórek w pobliżu prawej strony obrazu (gwiazdka) jest słupkiem strukturalnym, który wyznacza punkt początkowy migracji. H) przykład analizy migracji. Pionowa czerwona linia oznacza punkt początkowy; odległość od punktu początkowego do środka każdego jądra komórkowego jest mierzona, a suma wszystkich tych indywidualnych pomiarów staje się całkowitą odległością migracji za pomocą Matlab.

kolagen typu i (Invitrogen) służy do wypełniania kanału między studniami centralnymi i bocznymi i jest substratem, przez który migrują komórki. Można stosować zarówno kolagen 1 mg/mL, jak i 2 mg/mL. Chociaż 1 mg/mL kolagenu powoduje nieco wyższą niespecyficzną chemokinezę komórek tła, a Ładowanie żelu jest technicznie trudniejsze niż w przypadku kolagenu 2 mg/mL, niższe stężenie kolagenu pozwala na większą migrację pierwotnych kultur SMC, a czułość testu jest lepsza. O ile nie określono inaczej, stężenie kolagenu w kanałach migracyjnych wynosiło 1 mg / mL dla wszystkich eksperymentów.

2.7. Analiza statystyczna

porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu studenta lub jednokierunkowego ANOVA. Znaczenie zostało określone na poziomie.

3. Wyniki i dyskusja

jak pokazano na fig.3(a), proliferacja komórek jest blokowana przez leczenie MMC. Nie ma istotnej różnicy w żywotności komórek między SMC leczonym MMC ( % ) i nieleczonym SMC ( % ) przez okres do 48 godzin po leczeniu. Tak więc, akumulacja komórek w różnych testach migracji reprezentuje prawdziwy ruch komórek bez żadnego składnika proliferacji komórek. Jest to ważne, ponieważ bez leczenia MMC wskaźniki migracji z długotrwałych inkubacji mogą być zakłócane przez przypadkową proliferację komórkową.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

w testach scratch (Fig.3(b)) z pierwotnymi kulturami SMC, komórki losowo migrowały (chemokineza) w celu wypełnienia wad z porównywalną szybkością, niezależnie od stężenia PDGF, w tym przy braku jakiegokolwiek środka chemotaktycznego. Bez leczenia MMC, wady ran mają tendencję do zamykania się nieco wcześniej, co sugeruje element proliferacji komórek.

Fig.3(c) przedstawia wyniki migracji SMC przy użyciu testu Boyden chamber transwell. Wczesny (12 h) punkt czasowy wykazuje niewielką, ale znacznie zwiększoną migrację w odpowiedzi na 10-50 ng / mL PDGF w porównaniu z brakiem chemokiny w dolnej studni. Jednakże nie było rozróżnialnej różnicy w migracji w zakresie 10-krotnego stężenia PDGF, co sugeruje, że test jest stosunkowo niewrażliwy, przynajmniej dla pierwotnych kultur SMC. Co więcej, do 24 godzin nie ma różnic między żadnym stężeniem chemokin (w tym medium kontrolnego), co sugeruje, że migracja w tym punkcie czasowym jest niespecyficzna, gdy stężenia cytokin zaczną się równoważyć między górną i dolną studzienką.

aby formalnie wykazać, że migracja przez błonę w górnej odwiercie niekoniecznie jest spowodowana skierowaną chemotaksją, PDGF dodano do górnej odwiertu, z PDGF lub bez PDGF w dolnej komorze. Nawet przy braku gradientu chemokin, PDGF w górnej komorze prowadził do znacznie zwiększonej wędrówki (Fig. 3 (d)); można to przypisać tylko zwiększonej chemokinezie.

eksperymenty transwella sugerują zatem, że chociaż początkowe różnice stężeń PDGF mogą indukować pewien stopień zwiększonej migracji komórek w kierunku wyższych stężeń w dolnych studzienkach, późniejsza dyfuzja PDGF prowadzi do losowej chemokinezy.

dla porównania, eksperymenty z dawką i reakcją przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych (Fig.4) wykazują znaczącą chemotaksję przy stężeniach tak niskich jak 2.5 ng / mL PDGF (Fig. 4(b)) i wykazują zależne od dawki zwiększenie chemotaksji o wartości szczytowej około 25-50 ng / mL(Fig.4 (A)). Co ciekawe, wyższe stężenia PDGF (np. 100 ng/mL) prowadzą do mniejszej migracji, zgodnie z zatrzymaniem chemotaksji w wysokich dawkach (18). Należy zauważyć, że bez uprzedniego leczenia MMC wskaźnik migracji jest większy (Fig. 4 (a)), podkreślając niezbywalny udział proliferacji w „pozornej” chemotaksji występującej przy dłuższych czasach testowania. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or „gold standard” Boyden chamber approaches.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 4

Microfluidic device assay. a) krzywe dawka-odpowiedź z i bez wcześniejszego leczenia MMC. Traktowane MMC i nieleczone SMC umieszczano w bocznych studzienkach komórkowych, z różnymi stężeniami PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL i 100 ng/mL) obecnymi w centralnych studzienkach źródłowych. Migrację mierzono po barwieniu Hoechst 33342 i mikroskopii fluorescencyjnej po 48 godzinach, przy użyciu programu Matlab do obliczenia całkowitej migracji. Kontrole (tylko SMC medium) i każde stężenie PDGF oceniano w trzech egzemplarzach urządzeń. Istotne różnice można zaobserwować od 5 ng/mL do 100 ng/mL PDGF w porównaniu z grupą kontrolną (). B) Chemokineza a chemotaksja w urządzeniach mikroprzepływowych. SMC traktowane MMC z lub bez 2,5 ng/mL PDGF platerowano w centralnej studni komórkowej; 2,5 ng/mL lub 50 ng / mL PDGF dodano do bocznych studzienek źródłowych. Bez obecności PDGF w studni centralnej komórki, test wykazuje znacznie większą całkowitą migrację po 48 godzinach z 50 ng/mL w studni źródłowej („0-50”) w porównaniu z 2,5 ng/mL w studni źródłowej („0-2, 5”). Obecność 2,5 ng / mL PDGF w centralnej studni komórki prowadzi do znacznie większej całkowitej migracji, gdy występuje gradient stężenia („2,5-50”; ), co można przypisać miejscowemu efektowi chemokinezy. W przypadku braku gradientu („2,5–2,5”) występuje migracja związana z chemokinezą, która jest znacznie mniejsza niż migracja obserwowana w przypadku gradientu („0-2, 5”;). C) eksperyment z przebiegiem czasowym przeprowadzany jako panel b).

nie tylko urządzenie mikroprzepływowe może być używane do pomiaru chemotaksji, ale może również wyraźnie odróżnić udział chemokinezy i chemotaksji w migracji (Rysunek 4(b)). Tak więc, przy braku gradientu chemokin (np. 2.5 ng / mL PDGF zarówno w studzienkach środkowych, jak i bocznych), wskaźnik migracji odzwierciedla chemokinezę. Dla porównania, bez PDGF w studni Środkowej i 2,5 ng/mL w studni bocznej, wskaźnik migracji odzwierciedla skierowaną chemotaksję. Urządzenie mikroprzepływowe może również oceniać chemotaksję w obecności istniejącej chemokinezy, tak jak wtedy, gdy studnia środkowa zawiera 2,5 ng/mL PDGF, a studnia boczna zawiera 50 ng/mL. Istnieje niewielka, ale statystycznie większa migracja, gdy bodziec jest gradientem chemotaktycznym, a nie prostą chemokinezą.

ponieważ gradient chemokiny jest ustalany w ciągu 2 godzin (17) i jest stabilny przez kilka dni, komórki mogą stale migrować w górę gradientu stężenia w czasie (Fig.4(c)). Dla porównania, inne klasyczne metody albo nie mają gradientu stężenia (scratch assay), albo mają tylko przejściowy gradient chemokin, tak że chemokineza—zamiast ukierunkowanej chemotaksji-jest coraz bardziej przyczyniająca się.

urządzenie mikroprzepływowe opisane w tej pracy jest lepsze pod wieloma względami w porównaniu z innymi metodami in vitro wcześniej stosowanymi do badania chemotaksji. W szczególności, komora Boydena-z udziałem gradientu chemokiny przez porowatą membranę – była standardowym testem chemotaktycznym od 1950 roku. jednak to urządzenie ma znaczące ograniczenia w tym, że gradienty nie są ani stabilne, ani liniowe, z początkowym ostrym wzrostem stężenia, który stopniowo pogarsza się w czasie. Niedawno opracowano technologie systemów mikro-elektromechanicznych (MEMS), które wykorzystują mikrochipy mikroprzepływowe do naśladowania warunków in vivo; w tych urządzeniach komórki są stale narażone na siły ścinające pod kontrolowanym przepływem. Jednak ciągły przepływ tych urządzeń stanowi wyzwanie dla utrzymania stabilnych gradientów chemokin. Chociaż hydrożele między źródłem i kanałem zlewu mogą tworzyć liniowe gradienty stężenia, subtelne zmiany w studniach i kanałach mogą powodować gradienty ciśnienia, które zakłócają gradienty poprzez przepływ śródmiąższowy ; co więcej, ciągły przepływ urządzeń ma tendencję do rozcieńczania wszelkich chemioatraktantów wydzielanych przez źródła komórkowe. W opisanym wcześniej nowatorskim urządzeniu mikroprzepływowym i zwalidowanym do migracji komórek mięśni gładkich w tym artykule, Źródło dużej objętości i studnie zlewozmywakowe utrzymują stabilne gradienty chemokin w łączącym hydrożelu; każdy przepływ śródmiąższowy jest eliminowany przez połączenie źródła i studni zlewozmywakowych z dodatkowymi kanałami i zbiornikami, które służą jako obwód rezystor-kondensator. Gradienty stężenia są więc stabilne i liniowe przez kilka dni. Obecne prace doprecyzowały zastosowanie, włączając leczenie mitomycyną-C w celu zmniejszenia zakłócającego udziału proliferacji i pokazując, w jaki sposób chemotaksję i chemokinezę można ocenić w tej samej konfiguracji eksperymentalnej.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

podziękowania

praca ta została wsparta przez Grant z BWh-BRI Fund to Sustain Research Excellence-Bridge Research Grant. Chen Zhang był wspierany przez China Scholarship Council przez 18 miesięcy. Ovid C. Amati i Richard T. Lee był częściowo wspierany przez Centrum Nauki i technologii NSF CBET-0939511.