Streszczenie

Karbendazym, jako środek grzybobójczy, był powszechnie stosowany do zwalczania chorób grzybiczych w rolnictwie, leśnictwie i lekach weterynaryjnych. W badaniu tym oceniano toksyczność ostrą i reprodukcyjną karbendazymu przy użyciu modelu Caenorhabditis elegans (C. elegans)w celu wstępnej oceny potencjalnego ryzyka związanego z tym fungicydem w produkcji rolnej i stosowaniu. Wyniki wykazały, że wzrost C. elegans był hamowany przez 0,01 µg/l karbendazymu. Leczenie 0,1 µg/l karbendazymu spowodowało znaczne zmniejszenie zachowań ruchowych i znaczne uszkodzenie układu rozrodczego i przeciwutleniającego, powodując drastyczne skrócenie żywotności nicieni. Wyniki te pozwalają lepiej zrozumieć zagrożenie dla środowiska karbendazymu i budzą nowe obawy dotyczące bezpieczeństwa.

1. Wprowadzenie

pestycydy, rodzaj odczynników chemicznych lub biologicznych, są szeroko stosowane w rolnictwie do regulowania wzrostu roślin i zwalczania chorób i szkodników owadzich, które mogą promować wzrost upraw i poprawiać plony . Jednak powszechne stosowanie pestycydów doprowadzi do różnego stopnia pozostałości w uprawach lub żywności, a tym samym wpłynie na zdrowie ludzkie . Problemy pozostałości pestycydów nie tylko przyciągnęły dużą uwagę konsumentów, ale także stały się jednym z kluczowych czynników wpływających na bezpieczeństwo żywności .

Karbendazym, jako środek grzybobójczy o szerokim spektrum działania, był stosowany do zwalczania chorób grzybowych w rolnictwie, leśnictwie i lekach weterynaryjnych . Karbendazym jest jednak klasyfikowany przez Światową Organizację Zdrowia do kategorii niebezpiecznych chemikaliów i został sklasyfikowany na liście priorytetowych substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego przez Komisję Europejską . W ostatnich latach oczywiste jest, że powszechne stosowanie karbendazymu z nadmiernym zasięgiem i przedawkowaniem oraz fakt, że karbendazym jest trudny do degradacji, prowadzą do problemu pozostałości karbendazymu w rolnictwie . Chociaż toksyczne działanie karbendazymu zgłaszano od lat 80. XX wieku, toksyczność karbendazymu staje się gorącym tematem ze względu na rosnące obawy dotyczące środowiskowych substancji zaburzających gospodarkę hormonalną . Karbendazym został zakazany w kilku krajach ze względu na jego negatywny wpływ na środowisko i zdrowie, taki jak zaburzenia rozwoju i reprodukcji, toksyczność i mutagenność . U szczurów wykazano niekorzystny wpływ karbendazymu na parametry biochemiczne, histopatologiczne i hematologiczne w wątrobie, nerkach i gruczołach dokrewnych oraz ich poziom hormonalny . Ponadto wymaga dalszych badań nad niskim stężeniem z powodu pozostałości karbendazymu.

Caenorhabditis elegans (C. elegans), jako ważny model badawczy, jest szeroko stosowany do oceny. Według Amrit et al. , C. elegans ma wiele zalet, takich jak mały rozmiar, szybki czas generowania, łatwość hodowli w laboratorium i krótka długość życia dorosłych. C. elegans został wybrany w tym badaniu jako organizm modelowy do oceny toksyczności niskiego stężenia karbendazymu, co można uznać za wartość odniesienia dla zastosowania karbendazymu w rolnictwie.

2. Materiały i metody

2.1. Chemikalia i szczepy

Karbendazym (Czystość ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Szanghaj, Chiny) rozpuszczono w N, N-dimetyloformamidach (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Szanghaj, Chiny) do produkcji 1 g/l oryginalnego roztworu karbendazymu. Stężenia DMF wynosiły 0,1% w roztworach ekspozycji końcowej (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg/l). 0,1% DMF bez karbendazymu stanowiło grupę kontrolną. C. elegans (dziki Typ N2) zostały pierwotnie uzyskane z Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, MN, USA). Nicienie hodowano na płytkach podłoża wzrostu nicieni (NGM), które wysiewano Escherichia coli OP50 w temperaturze 20°C, zgodnie z opisem . L1-larwa C. elegans zebrano przez przemywanie nicieni grawitacyjnych mieszaniną wybielającą (1 M NaOH, 10% NaHOCl).

2.2. Śmiertelność

oryginalne roztwory karbendazymu (1 G / L) rozcieńczono płynnym podłożem s (1,12 G K2HPO4, 5,92 G KH2PO4 i 5,85 g NaCl rozcieńczono 1 L wody), aby uzyskać końcowe stężenia karbendazymu 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, i 1 mg/l, który zawierał 0,1% DMF. S płynne medium z 0,1% DMF było grupą kontrolną. 30 nicieni (L4) przebadano w 96-studzienkowych płytkach dla każdego stężenia. Przeżycie nicieni liczono pod mikroskopem po hodowli przez 24 godziny w inkubatorze. Proces badania opiera się na metodzie Xiang et al. . Potrzebne były trzy równoległe eksperymenty.

2.3. Zachowanie Lokomotywy

co najmniej 10 C. elegans (L4) zostało wybranych losowo z każdego stężenia, aby określić zachowanie lokomotywy, które było rejestrowane zarówno przez częstotliwość uderzeń głowy, jak i czasy zginania ciała . Liczbę uderzeń głowy liczono na podstawie zmian kierunku zgięcia na śródstopiu C. elegans w ciągu 1 min. Pomiar zgięcia ciała zdefiniowano jako czasy zmian kierunku części nicieni hodowanych w NGM bez E. coli OP50 w ciągu 30 s.

2.4. Analizowano testy wzrostu i rozwoju

C. elegans narażony na karbendazym przez 24 godziny. Długość ciała nicieni narażonych na działanie karbendazymu oceniono za pomocą oprogramowania Image J. Potomstwo każdego C. elegans od larw L4 do dnia 1 był rejestrowany na etapie L3 po pojedynczym przenoszeniu na nową płytkę każdego dnia, aż do zaprzestania rozmnażania . Przeprowadzono co najmniej trzy równoległe testy.

2.5. Analiza długości życia

wszystkie C. elegans badane pod kątem długości życia hodowano w tym samym stanie w temperaturze 20°C. zsynchronizowane C. elegans hodowano w płytkach NGM o różnych stężeniach karbendazymu do dnia 4. Badane nicienie byłyby następnie przenoszone na nowe płytki NGM co 2 dni. Ocalałe i martwe C. elegans były rejestrowane codziennie (począwszy od pierwszego dnia dorosłości), aż wszystkie nicienie dla każdego stężenia padły . Przeprowadzono co najmniej trzy równoległe testy.

2.6. Oznaczanie uszkodzeń oksydacyjnych

wewnątrzkomórkowy ROS mierzono za pomocą dioctanu 2′, 7 ’ -dichlorodihydrofluorosceiny (H2DCFH-DA), który jest najbardziej powszechną i czułą reaktywną sondą do wykrywania tlenu. Dziki Typ N2 C. elegans przemywano w buforze M9, a następnie zakłócano ultradźwiękami. Supernatant analizowano poziom ROS zgodnie z instrukcją zestawu ROS. Końcowe stężenie robocze H2DCHE-DA wynosiło 10 μΜ . Fale wzbudzenia i absorbancji emisji wynosiły odpowiednio 485 nm i 535 nm. Przeprowadzono co najmniej trzy równoległe testy.

wewnątrzkomórkową całkowitą dysmutazę ponadtlenkową (T-SOD) oznaczono zgodnie z instrukcją zestawu t-SOD zakupionego w Instytucie Bioinżynierii Nanjing Jiancheng. Po trzykrotnym umyciu M9 badane nicienie zostały zakłócone ultradźwiękami i zareagowały zestawem T-SOD. Długość fali absorbancji wynosiła 550 nm. Ponadto supernatant był używany do wykrywania poziomu białka dla każdego stężenia, w którym długość fali absorbancji wynosiła 595 nm. Przeprowadzono co najmniej trzy równoległe testy.

2.7. Analiza danych

wszystkie dane podano jako średni ± standardowy błąd średniej (SEM) przy użyciu jednokierunkowego ANOVA. Wykresy zaprezentowano przy użyciu Origin 8.5 i GraphPad Primer 7, a analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS 19.0. Poziom istotności statystycznej przeprowadzono przy użyciu i .

3. Wyniki

3.1. Określenie zachowania ruchowego C. elegans after Carbendazim Acute Exposures

LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.

Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans po ostrych ekspozycjach karbendazymu, analizując dane dotyczące częstotliwości uderzeń głowy i czasów zginania ciała nicieni(Fig. 1 (A) i 1 (b)). Oba wykazały znaczne zmniejszenie stężenia karbendazymu w zakresie od 0,01 µg / l do 100 µg / l (). Dodatkowo, uderzenia głowy nicieni narażonych na 100 µg/L zmniejszyły się do 68,27%. W przypadku testu zgięć ciała, gdy stężenia karbendazymu wynosiły 10 µg/l i 100 µg / l, miał on znaczący wpływ hamujący na zgięcia ciała C. elegans odpowiednio o 36,77% i 35,48% w porównaniu z kontrolnym.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Effects of C. elegans on physiological traits exposed to carbendazim. (a) The head thrashes of C. elegans after carbendazim exposure; (b) the body bends of C. elegans po ekspozycji na karbendazym; (c) długość ciała C. elegans po ekspozycji na karbendazym; oraz (d) powierzchnia ciała C. elegans po ekspozycji na karbendazym. Dane (średnia ± sem) przedstawiono na rysunkach jako wartości procentowe w porównaniu z grupą kontrolną. Gwiazdki przedstawiają znaczenie pomiędzy każdą grupą ekspozycji a grupą kontrolną (i).

3.2. Określenie wzrostu i rozwoju C. elegans po ostrej ekspozycji na Karbendazym

w porównaniu z grupą kontrolną (Fig.1(C) i 1(d)), długość ciała i powierzchnia ciała były znacząco () zmniejszone w grupach ekspozycji z 0,01 µg/l do 100 µg/L. oba zostały zmniejszone odpowiednio o 19,16% i 22,15% przy leczeniu 0,01 µg/l w porównaniu z grupą kontrolną. Stężenie 10 µg/l miało najbardziej negatywny wpływ, a długość ciała i powierzchnia ciała C. elegans zostały zmniejszone odpowiednio o 35,21% i 65,22% w porównaniu z grupą kontrolną.

3.3. Oznaczanie wielkości potomstwa C. elegans po ostrej ekspozycji na Karbendazym

zgodnie z fig.2 wielkość potomstwa nicieni uległa znacznemu zmniejszeniu () w grupach leczonych z 0,1 µg/l do 100 µg/L. wielkość potomstwa C. elegans zmniejszyła się najistotniej, co zmniejszyło się do 43,71% przy leczeniu 10 µg/l w porównaniu z grupą kontrolną.

Rysunek 2

wpływ C. elegans na wielkość potomstwa narażonego na karbendazym. Dane (średnia ± sem) przedstawiono jako wartość procentową w porównaniu z grupą kontrolną. Gwiazdki przedstawiają znaczenie pomiędzy każdą grupą narażenia a grupą kontrolną (and).

3.4. Oznaczanie długości życia C. elegans po ostrej ekspozycji na Karbendazym

długość życia C. elegans została znacząco zahamowana o 0,01 µg/l do 100 µg/l karbendazymu zgodnie z krzywą długości życia przedstawioną na fig.3. Wyniki wykazały, że długość życia C. elegans została zmniejszona z 24 do 20 dni przy leczeniu 0,01 µg/l karbendazymu. Długość życia nicieni leczonych 0,01 µg/l karbendazymu została zmniejszona o 20,00%. Gdy stężenie karbendazymu wynosiło 100 µg / l, żywotność C. elegans zmniejszyła się najbardziej o 45,83%.

Rysunek 3

wpływ C. elegans na przeżycie narażone na karbendazym. Dane (średnia ± sem) przedstawiono jako wartość procentową w porównaniu z grupą kontrolną. Gwiazdki przedstawiają znaczenie pomiędzy każdą grupą narażenia a grupą kontrolną (and).

3.5. Wpływ ostrej ekspozycji na Karbendazym na układ przeciwutleniający C. elegans

poziomy ROS kontroli i leczonych C. elegans przy ekspozycji na karbendazym w różnych stężeniach przedstawiono na fig.4(A). Wykazano, że poziom wewnątrzkomórkowego ROS był znacznie zwiększony () w zakresie od 0,01 µg/l do 100 µg/l karbendazymu. W porównaniu z grupą kontrolną, poziom ROS był zwiększony co najwyżej o 70,60% przy leczeniu 10 µg / L. zgodnie z wynikami wewnątrzkomórkowych poziomów SOD, miał wzrost w leczeniu z 0.01 µg/l do 100 µg/l karbendazymu (Rysunek 4 (b)). Poziom SOD był zwiększony o 10,70% przy 0,1 µg/l karbendazymu w porównaniu z grupą kontrolną.

(a)

(b)

(a)
(b)

rysunek 4

wpływ C. elegans na układ przeciwutleniający narażony na karbendazym. a) poziom ROS C. elegans po ekspozycji na karbendazym; B) poziom SOD C. elegans po ekspozycji na karbendazym. Dane (średnia ± sem) przedstawiono jako wartość procentową w porównaniu z grupą kontrolną. Gwiazdki przedstawiają znaczenie pomiędzy każdą grupą narażenia a grupą kontrolną (and).

4. Dyskusja

Karbendazym, jako fungicydy, jest szeroko stosowany w rolnictwie w celu zahamowania wzrostu grzybów. Karbendazym został zabroniony do stosowania w Australii, większości krajów Unii Europejskiej i USA ze względu na jego ciężką toksykologię i trwały charakter . W tym badaniu po raz pierwszy użyto C. elegans jako organizmy modelowe do oceny wpływu karbendazymu na zachowanie Lokomotywy, wzrost i rozwój, reprodukcję, żywotność i systemy przeciwutleniające. Co więcej, Wyniki wykazały, że miał negatywny wpływ na C. elegans.

zgodnie z 24 h-LC50 stężenie ostrej toksyczności C. elegans narażone na różne stężenia karbendazymu wynosi 0,867 mg/L. 96-h LC50 karbendazymu w odpowiedzi na danio pręgowanego przedstawiono jako 1,75 mg/l . Jaja Karpia pruskiego Carassius gibelio wykazały działanie toksyczne przy stężeniu 0,036 mg / L . Badania wykazały, że wzrost i rozwój Navicula sp. jest hamowany przez karbendazym o wartości 24 h-EC50 wynoszącej 2,18 mg/L. chociaż szybkość wzrostu glonów jest odzyskiwana po ekspozycji 72 h, zawartość chlorofilu-A pozostaje znacznie zmniejszona, gdy leczenie karbendazymem przekracza 0,5 mg/l . W tej chwili C. elegans wystawiony na niskie stężenie karbendazymu wybrano do oceny jego wpływu w zależności od rzeczywistego stężenia dziennego narażenia człowieka. Niskie stężenie karbendazymu nie oznacza, że jest bezpieczny. W niektórych badaniach karbendazym wykazuje negatywny wpływ biologiczny przy znacznie niższych dawkach.

zachowanie Lokomotywy oceniano w celu oceny neurotoksyczności C. elegans (larwa l4) po 24-godzinnej ekspozycji na karbendazym. Wyniki wykazały, że karbendazym może mieć negatywny wpływ na zachowanie Lokomotywy poprzez wykrycie uderzenia głową i zginania ciała C. elegans, które były bardziej wrażliwe w grupie o wyższej ekspozycji. Zachowanie zarodków danio pręgowanego wystawionych na działanie karbendazymu jest wrażliwe . Wcześniejsze badania wykazały, że ryby mają nieprawidłowe zachowanie, gdy subletalne stężenia karbendazymu wynoszą 0,22–0,43 mg/l .

wady rozwojowe mogą być również jedną z przyczyn nieprawidłowego poruszania się . Wzrost i rozwój C. elegans zostały zbadane w naszych badaniach. Wyniki wykazały, że długość ciała i powierzchnia ciała C. elegans zostały znacząco zmniejszone w trakcie leczenia przekraczając 0,01 µg/l karbendazymu. Prawidłowy wzrost kręgowców jest związany z metaboliczną homeostazą hormonu tarczycy . Williams et al. wskazali, że karbendazym może powodować utratę plemników po implantacji, wady rozwojowe płodu oraz powolny wzrost i rozwój.

toksyczność reprodukcyjna karbendazymu wykazano, że karbendazym może hamować polimeryzację mikrotubul grzybów i komórek ssaków, powodując zakłócenie montażu mikrotubul przez działanie z β-tubuliną, co powoduje upośledzenie segregacji chromosomów w procesie podziału komórek . Tworzenie mikrotubul przez niekowalencyjne wiązania α-i β-tubuliny jest odpowiedzialne za segregację chromosomów w procesie mitozy i mejozy . Wielkość potomstwa C. elegans znacznie zmniejsza się przy stężeniu 0,1 µg/l karbendazymu. Stwierdzono, że karbendazym wpływa na układ rozrodczy u japońskich przepiórek i chomików . Na podstawie naszych badań stwierdzono, że żywotność C. elegans uległa znacznemu zmniejszeniu przy stężeniu karbendazymu ≥0,01 µg/l. Badania wykazały, że karbendazym prowadzi do niepłodności i toksyczności rozwojowej oraz przejawia toksyczność zarodków, apoptozę komórek rozrodczych i teratogenezę u różnych gatunków ssaków .

apoptoza to złożona zaprogramowana śmierć komórki, która jest wysoce regulowanym zjawiskiem charakteryzującym się szeregiem procesów komórkowych . Wiele badań wykazało, że wytwarzanie ROS wywołane stresem oksydacyjnym jest związane z apoptotyczną śmiercią komórek . Nasze badania wykazały, że karbendazym może powodować znaczny wzrost wartości ROS i niewielki wzrost wartości SOD. Stres oksydacyjny spowodowany zanieczyszczeniem środowiska powoduje zwiększoną ekspresję ROS, a następnie uszkadza system obrony przeciwutleniającej . SOD jest odpowiedzialny za detoksykację toksycznych wolnych rodników i ich działania, co służy do oceny poziomu stresu oksydacyjnego i stanu antyoksydacyjnego komórek . METALOENZYM SOD przyspiesza transformację endogennych cytotoksycznych rodników ponadtlenkowych do H2O2, a wzrost poziomów ekspresji SOD może przyczynić się do poprawy aktywności enzymu w celu wyeliminowania rodników ponadtlenkowych indukowanych przez karbendazym i zapobiegania występowaniu dysfunkcji komórkowych podczas ekspozycji na karbendazym . Wyższe stężenia karbendazymu mogą powodować silny stres oksydacyjny, który następnie niszczy równowagę homeostazy komórkowej i sprzyja apoptozie . Jednak karbendazym w niskich stężeniach może nadal znacząco uszkodzić układ rozrodczy zgodnie z naszymi Wynikami.

5. Wniosek

o ile nam wiadomo, w niniejszym badaniu oceniono bezpieczeństwo karbendazymu po raz pierwszy wystawionego na działanie C. elegans. Wykazano, że karbendazym może mieć szkodliwy wpływ na zachowanie Lokomotywy, rozwój i wzrost, reprodukcję, żywotność i układ przeciwutleniający C. elegans. Mam nadzieję, że należy zwrócić większą uwagę na stosowanie karbendazymu w oparciu o wyniki. Ponadto należy dokonać dalszej oceny bezpieczeństwa stosowania karbendazymu, w szczególności toksyczności bioakumulacyjnej i potencjalnego działania genotoksycznego.

dostępność danych

wszystkie dane generowane lub analizowane podczas tego badania są zawarte w tym artykule.

konflikty interesów

autorzy oświadczają, że nie występują w nich konflikty interesów.

podziękowania

badania te zostały wsparte przez National Natural Science Foundation Of China (31501569).