marchew (Daucus carota) jest zimową rośliną dwuletnią, która jest uprawiana dla jadalnego korzenia. Jest to jedno z najczęściej spożywanych i produkowanych warzyw ze względu na różnorodność diety w Kolorze, smaku, błonniku i witaminie A, a także jego spożycie zarówno w postaci surowej, jak i gotowanej. Rocznie produkuje się z niego ponad 20 mln ton z przeznaczeniem do spożycia przez ludzi.

praktyki hodowli tkankowej są bardzo popularne w klonowaniu roślin. Pierwsze badania nad hodowlą tkanek marchwi zostały przeprowadzone w 1939 roku przez Gauthereta i Nobecourta. Jednak Steward et al. Reinert przedstawił pierwsze badania nad „embriogenezą marchwi”; próbowali wyhodować korzenie za pomocą zawiesiny komórkowej i kultur kalusa.

embriogeneza somatyczna jest skuteczną metodą zrozumienia i zbadania biochemicznych, fizjologicznych i genetycznych aspektów hodowli komórek roślinnych.

wiele badań nad hodowlą tkanek marchwi doprowadziło do opracowania prostej metody embriogenezy w marchwi. Zgodnie z tą metodą wzrost kultur marchwi może być indukowany przez usunięcie hormonu 2,4 – D z kultur zawiesiny komórkowej. Obecnie marchew jest często używany jako eksperymentalny model do analizy embriogenezy somatycznej w różnych laboratoriach na całym świecie.

materiał i sprzęt wymagane do ustanowienia Kultury

materiały sterylizowane

• 5 krucha kultura kalus marchwi, nieskażona i utrzymywana w temperaturze 25 ℃.
• 5 kolb Erlenmeyera (250 ml), zawierających podłoże hodowlane z 5 x 10-8 g/ml 2, 4-D.
• 5 cylindrów pomiarowych (100 ml) z nakrętkami foliowymi.
• 2 szpatułki.
• 25 arkuszy folii aluminiowej (100 x 100 mm).
• 2 kawałki sita nylonowego lub ze stali nierdzewnej o porowatości 250 µm, które można włożyć do otworu cylindrów pomiarowych.
• 5 szalek Petriego.

materiały Nie sterylizowane

• Wodoodporny długopis znakujący
• obrotowa Wytrząsarka
• palnik Bunsena
• 1 kolba Erlenmeyera (150 ml) zawierająca 95% etanolu
• Parafilm

procedura inicjowania i zakładania kultury

1. weź probówki kultury kalusowej, sterylne usta wszystkich 5 probówek i przenieś Kalus osobno do szalki Petriego (5 Kalli w 5 szalkach Petriego).
2. weź kolbę kanoniczną o pojemności 250 ml zawierającą podłoże hodowlane i 2, 4-D.
3. Przenieś wszystkie 5 calli z szalki Petriego do 5 kolb kanonicznych, osobno.
4. wypalić / sterylizować usta kolb i przykryć je nakrętką. Zabezpieczyć nasadkę za pomocą parafilmu.
5. Umieść wszystkie kolby zawierające kulturę na obrotowej maszynie wytrząsającej w ciemności lub przy słabym natężeniu światła przy 25 ℃.
6. po 7 dniach przełożyć kolby z shakera do sterylnego pomieszczenia.
7. Usuń Parafilm i nakrętkę foliową z każdej kolby i płomień / sterylne usta kolb.
8. przenieść zawiesinę każdej kolby do sterylnego cylindra o pojemności 100 ml oddzielnie, przepuszczając ją przez sito.
9. pozostaw zawartość na 10 minut, a następnie wyrzuć supernatant.
10. przenieść pozostałości komórek pozostawionych w cylindrze pomiarowym do kolby o pojemności 250 ml zawierającej 60 ml świeżego podłoża.
11. Powtórz krok 10 dla każdej kolby hodowlanej.
12. włóż wszystkie pięć kolb ponownie do shakera.
13. po 7 dniach powtórz wcześniej wykonaną procedurę (od kroku 6-10). Jednak tym razem tylko 1/5 pozostałych komórek jako inokulum.
14. powtórz procedurę około 3-4 razy. W ten sposób w zawiesinie marchwi pozostaną tylko pojedyncze komórki lub małe Agregaty.
15. w przypadku zawiesiny komórek marchwi liczba odpowiednich komórek waha się między 105 a 3 x 105 komórek/ml lub 100 i 300 mg (świeża masa) inokulum w objętości 60 ml świeżego podłoża zawierającego pożywkę i 5×10-8 g/ml, 2,4-D.
16. okres transferu wynoszący 7 dni jest odpowiedni dla marchwi, aby uzyskać pojedyncze komórki w hodowli zawiesiny.

Approximate Schedule of the Culture

Event	Timing (approximate)
Initiation of cell suspension and determination of total cell number and PCV (packed cell volume)	Day 0
First transfer of cultures	Day 8
Fourth transfer of cultures	Day 29

Result

What should you observe while experimenting? Oto kilka punktów do zapamiętania podczas notowania wyników.

• Data i czas trwania eksperymentu.
• liczba zastosowanych kultur i zabiegów.
• Zapisz morfologię i liczbę zakażonych kultur w odstępie trzech tygodni.
• określić PCV (hematokrytową objętość komórek) na początku i na końcu transferu Kultury.
• oszacuj całkowitą liczbę komórek po 3 subkulturach, w dniach 1, 2, 4 i 7, i narysuj wykres na podstawie czasu.
• zbadaj zależność między gęstością inokulum a wzorcem wzrostu.

hodowla zawiesiny zapewnia korzyść w porównaniu z innymi kulturami, ponieważ umożliwia ruch tkanki w pożywce hodowlanej, co ułatwia wymianę gazową. Ponadto usuwa wszelkie polaryzacje tkanki i gradient składników odżywczych wewnątrz i na nośniku.

zastosowanie hodowli tkankowej marchwi

1. do klonowania taprootów.
2. aby zbadać zmutowaną formę marchwi.
3. aby zbadać fizjologiczne reakcje marchwi, które mogą ułatwić zrozumienie również innych roślin.
4. aby zbadać wzrost i rozwój marchwi z jednokomórkowej.
5. aby zbadać reakcję marchwi na stres, która zapewnia wgląd w reakcje innych roślin.
6. aby wygenerować setki transgenicznych roślin z zawiesiny pojedynczych komórek do dowolnych celów eksperymentalnych.

Reinert J. and Yeoman M. M. (1982). Plant Cell and Tissue culture: a laboratory manual. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Newyork.

Hardegger M., Shakya R. (2004). Transformation of Carrot. W: Curtis I. S. (eds) transgenic Crops of the World. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2333-0_22.

wzrost i podział komórek marchwi w hodowli zawiesinowej. (1970). Fizjologia roślin i komórek. DOI: 10.1093 / oxfordjournals.pcp.a074564

https://www.atzlabs.com/prodcut-info/C1955-Carrot -…