wyniki

najpierw oceniliśmy,czy CD63 i H, K-Atpaza znajdują się w tym samym przedziale subkomórkowym w komórkach ciemieniowych żołądka. Wcześniejsze prace wykazały, że komórki ciemieniowe szczura wykazują wysoki poziom CD63 (22). Mikroskopia immunofluorescencyjna na zamrożonych fragmentach żołądka szczura wskazuje, że CD63 jest obecny w większości komórek żołądka szczura, w tym w komórkach ciemieniowych (Fig. 1a). CD63 częściowo kolokalizuje się z HKa w komórkach ciemieniowych. Dodatkowo przeanalizowaliśmy wysoko oczyszczony preparat TVE z żołądka świni (miły prezent od C. T. Okamoto). H, K-Atpaza stanowi około 50% zawartości białka w podobnych preparatach (23). Analiza Western blot wskazuje, że CD63 jest obficie obecny w tym oczyszczonym preparacie TVE (Fig. 1B).

aby zbadać możliwą interakcję in situ między CD63 A H,K-Atpazą, przeprowadziliśmy eksperymenty pull-down z wykorzystaniem biotynylowanej lektyny pomidorowej. Wcześniejsze badania wykazały, że lektyna ta wiąże się specyficznie i jednoznacznie z HKß w preparatach żołądkowych (24-27). Wytłoczyliśmy preparat TVE z anty-hkß mAb i biotynylowaną lektyną pomidorową, aby potwierdzić, że lektyna wiąże się konkretnie z glikozylowanym HKß(Fig . 1C). Następnie użyliśmy biotynylowanej lektyny pomidorowej do wyizolowania białek, które wchodzą w interakcje z HKß w preparacie TVE. Analiza Western blot wskazuje, że CD63 jest wytrącany przez lektynę pomidorową (Fig. 1D), wykazując,że CD63 i H, K-Atpaza wiążą się in situ i sugerując, że związek ten może być istotny fizjologicznie. Wstępna obróbka preparatu TVE 4% SDS, a następnie 20-krotne rozcieńczenie w buforze do lizy, znacznie zmniejszyła ilość wytrąconego CD63. Ilość wytrąconego HKß nie została zmieniona w wyniku tego leczenia (nie przedstawiono danych). Dane te sugerują, że obecność CD63 w badaniu pull-down wynika z jego związku z HKß, a nie z bezpośredniego związku między CD63 a lektyną pomidorową.

aby zbadać funkcjonalne znaczenie interakcji między CD63 i HKß, transfekowaliśmy komórki COS-7 cDNA kodującym królika HKß pojedynczo lub razem z cDNA kodującym konstrukcję CD63 oznaczoną znacznikiem (CD63-FL). Wykazaliśmy, że HKß nie musi gromadzić się z HKa, aby dotrzeć do powierzchni komórki w transfekowanych komórkach COS (20). Użyliśmy konstruktu CD63, który nosi znacznik epitopu flagowego na końcówce N, ponieważ końcówka C CD63 zawiera motyw oparty na tyrozynie, który jest wymagany do wewnątrzkomórkowego handlu tą tetraspaniną (13).

komórki COS zakażone HKß i CD63-FL poddano immunoprecypitacji przy użyciu PAB anty-FLAG. Analiza Western blot materiału immunoprecypitowanego wskazuje, że koprecypituje hkß z CD63 (Fig. 2, HKß + CD63-FL). Białka CD63-FL i hkß koimmunoprecypitują w różnych detergentach, w tym 2% CHAPS, 1% Brij 96 i 1% Triton X-100. Związek między CD63 i HKß stanowi jeden z niewielu opisanych kompleksów tetraspaniny, który przetrwał rozpuszczalność w Tritonie X-100 i dlatego prawdopodobnie będzie stanowił bezpośrednią interakcję (28). Podjednostka β ma dwie formy: ßm (dojrzały), który jest modyfikowany węglowodanami złożonymi, i ßc (rdzeń), który jest modyfikowany węglowodanami o wysokiej zawartości mannozy (29). Obie formy koprecypitują z CD63, chociaż stosunek ßc do ßm w osadie zmienia się w zależności od warunków rozpuszczania.

HKß nie został wykryty w immunoprecypitacjach FLAG przeprowadzonych na komórkach transfekowanych samym HKß, wykazując, że FLAG pAb nie oddziałuje z podjednostką β (Fig. 2, HKß). HKß nie koimmunoprecypituje z FLAG pAb z mieszaniny (50: 50, obj./obj.) lizatów wytworzonych z komórek transfekowanych pojedynczo CD63-FL i podjednostką β, potwierdzając, że interakcja zachodzi in vivo (Fig. 2, drugi pas). Próbki inkubowane z flag pAb nie wytrącają lizosomalnego białka Lamp-1, co wskazuje, że interakcja między CD63-FL i HKß jest specyficzna, a nie artefaktem niepełnej rozpuszczalności przedziału CD63 (Fig . 2).

następnie zbadaliśmy, czy interakcja między HKß i CD63 wpływa na subkomórkową lokalizację podjednostki β. HKß jest obecny na powierzchni komórki w przejściowo transfekowanych komórkach COS (Fig. 3 A-C). Istnieje wyraźna redystrybucja podjednostki β do wewnątrzkomórkowych pęcherzyków zawierających CD63, gdy komórki COS są współwystępowane zarówno HKß, jak i CD63-FL (Fig . 3 D-F). Aby wykluczyć możliwość, że ta zmieniona lokalizacja może być niespecyficznym efektem nadekspresji CD63, zbadaliśmy wpływ ekspresji CD63 na dystrybucję AQP4. AQP4 jest kanałem wodnym, który jest obecny w bazolateralnych błonach plazmatycznych komórek ciemieniowych. Nie ulega regulowanej endocytozie i egzocytozie z Atpazą H, K (30, 31). Kanał ten nie koimmunoprecypituje z CD63-FL w lizacie Triton X-100 koimmunoprecypitowanych komórek COS (Fig. 4a). Gdy kotransfekowane komórki są wizualizowane za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, AQP4 nie jest obecny w komorze zawierającej CD63 (Fig. 4B), co wskazuje, że indukowana przez CD63 redystrybucja do pęcherzyków wewnątrzkomórkowych jest specyficzna dla białek oddziałujących z tą tetraspaniną.

aby zbadać mechanizmy redystrybucji hkß za pośrednictwem CD63, skorzystaliśmy z ostatnich prac, które scharakteryzowały wewnątrzkomórkowy handel CD63. Rous et al. (13) wykazano, że motyw oparty na tyrozynie obecny na skrajnym końcu C CD63 oddziałuje z podjednostkami μ2 i μ3 adaptera. Białko μ2 jest członkiem heterotetramerycznego kompleksu AP-2. Kompleks ten występuje w błonie osocza i łączy białka ładunku z otoczką klatryny, pośrednicząc w ich endocytozie (14). Białko μ3 jest członkiem heterotetramerycznego kompleksu AP – 3. Kompleks ten uczestniczy w celowaniu lizosomalnym i znajduje się zarówno w sieci trans-Golgiego, jak i w komorze pęcherzykowej, która częściowo kolokalizuje się z endosomami (12). Gdy motyw CD63 oparty na TYROZYNIE JEWM zostaje zmutowany do AEVM, CD63 nie jest w stanie oddziaływać z μ2 lub μ3 i ulega ekspresji głównie na powierzchni komórki (13). Gdy hkß współspresuje się z oznaczoną znacznikiem konstrukcją CD63-aevm, zarówno CD63-AEVM, jak i podjednostka β są rozprowadzane na powierzchni komórki (Fig. 3 G-I). Tak więc, na wewnątrzkomórkową dystrybucję HKß wpływają sygnały przemytnicze osadzone w ogonie CYTOPLAZMATYCZNYM CD63.

Kiedy Sekwencja JEWM w ogonie CD63 jest zmutowana do JEWIEGO, zmodyfikowany motyw nadal wchodzi w interakcje z μ3, ale nie wiąże się już z μ2 (13). CD63-YEVI jest zlokalizowane głównie w późnym przedziale endosomalno-lizosomalnym, najprawdopodobniej dlatego, że zmienione białko tetraspaniny przenosi się bezpośrednio do tego przedziału po początkowym przejściu biosyntetycznym przez Golgi (13). Niewielka populacja CD63-YEVI, która dociera do błony plazmatycznej, wykazuje upośledzoną internalizację, ponieważ nie może już oddziaływać z μ2 (13). Gdy hkß i oznaczony znacznikiem cd63-YEVI są współspresowane w komórkach COS, znaczna część CD63-YEVI jest zlokalizowana do późnego przedziału endosomalno-lizosomalnego; jednakże podjednostka β pozostaje na powierzchni komórki i nie jest redystrybuowana do przedziału wewnątrzkomórkowego (Fig. 3 J–L). Analiza koimmunoprecypitacji potwierdza, że HKß może wiązać się zarówno z CD63-YEVI, jak i CD63-AEVM (dane nie pokazane). Dane te sugerują, że aby HKß był rozprowadzany do wewnątrzkomórkowego przedziału CD63-dodatniego, białka te muszą oddziaływać na powierzchni komórki i być endocytowane jako kompleks.

aby ustalić, czy hkß wykryty w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych odpowiada białkowi, które zostało endocytozowane z powierzchni komórki, zaobserwowaliśmy internalizację podjednostki β w obecności i braku ekspresji egzogennego CD63. Komórki COS współwystępowały z HKß i CD63-FL. Następnie komórki schłodzono do 4°c w celu zatrzymania endocytozy i powierzchni oznaczono hkß mAb. Znakowane komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 40 minut, aby umożliwić wznowienie endocytozy. Po inkubacji komórki ochłodzono do 4°C i powierzchniowo oznakowano skoniugowanym przez Cy5 kozim przeciwgrzybiczym IgG. Komórki utrwalano i inkubowano z antyflag pAb, a następnie znakowano zarówno sprzężonymi izotiocyjanianem fluoresceiny kozimi anty-mysimi IgG, jak i skoniugowanymi rodaminami kozimi anty-króliczymi IgG. Tak więc, hkß, który pozostał na powierzchni, wizualizowano na kanale Cy5, zinternalizowany HKß wizualizowano na kanale izotiocyjanianowym fluoresceiny, a CD63-FL wizualizowano na kanale rodaminy. Analiza ta wykazała, że internalizowana podjednostka β kolokalizuje się z CD63, co sugeruje, że pula hkß, która jest kolokalizowana z CD63, pochodzi przez endocytozę z błony komórkowej (Fig. 5 E–H). Komórki, które nie wykazują nadmiernej ekspresji CD63, wykazują znacznie mniej zinternalizowaną podjednostkę β Po 40-minutowej inkubacji (Fig . 5 A-D).

aby ocenić internalizację HKß i zweryfikować, czy HKß i CD63 łączą się na powierzchni komórki, przeprowadziliśmy eksperymenty biotynylacyjne na powierzchni komórki. W pierwszym eksperymencie komórki COS transfekowano samą podjednostką β i biotynylowano estrem biotyny-SS-N-hydroksysukcynimidu w temperaturze 4°C. duplikaty próbek inkubowano następnie w temperaturze 37 ° C przez różne okresy czasu, aby umożliwić wznowienie endocytozy. Komórki zwrócono do 4°C, a jedną płytkę z każdego punktu czasowego pozbawiono pozostałej powierzchni komórki biotyny przez wystawienie na działanie impermeantowego środka redukującego membranę MesNa. Komórki lizowano i inkubowano paciorkami streptawidyny. Białka związane z paciorkami streptawidyny oddzielono za pomocą SDS/PAGE, a błony zbadano za pomocą hkß mAb (Fig. 6a). Frakcja podjednostki β na powierzchni komórki nie zmienia się znacząco w miarę postępu internalizacji w temperaturze 37°C. Po pierwszych 10 minutach niewielka część znakowanego powierzchniowo HKß jest sekwestrowana wewnątrz komórki, a stosunek powierzchni do zinternalizowanego HKß pozostaje wysoki. Dane te sugerują, że podjednostka β Nie związana z CD63 albo bardzo powoli internalizuje się, albo jest internalizowana, ale szybko wraca na powierzchnię, podobnie jak receptor transferryny.

następnie staraliśmy się scharakteryzować zachowanie HKß, które wiąże się z CD63. Komórki COS współwystępowały z HKß i CD63-FL. Komórki biotynylowano i usuwano zgodnie z opisem powyżej. Aby wyizolować populację HKß związaną z CD63, lizat komórkowy inkubowano z FLAG pAb i sprzężonymi z białkiem a kulkami agarozowymi. Immunoprecypitowany materiał eluowano niewielką ilością buforu zawierającego 3% SDS, rozcieńczono 30-krotnie 1% Tritonem X-100 i inkubowano z paciorkami streptawidyny. Białka związane z paciorkami streptawidyny oddzielono za pomocą SDS/PAGE i zbadano za pomocą hkß mAb (Fig. 6b). Dla komórek, które nie zostały poddane protokołowi usuwania, sygnał wykryty w tej Zachodniej plamce reprezentuje całkowitą pulę znakowanych powierzchniowo podjednostek β związanych z CD63, w tym kompleksów, które nadal znajdowały się na błonie plazmatycznej i kompleksów, które zostały zinternalizowane w pęcherzyki. Dla komórek, które poddano protokołowi strippingu, sygnał reprezentuje populację podjednostki β związanej z CD63, która była obecna na powierzchni komórki podczas biotynylacji, a następnie była internalizowana i chroniona przed pasem MesNa.

w punkcie czasowym 0-min, biotynylowany HKß jest łatwo wykrywany w immunoprecypitatach anty-FLAG z nierozrywanych komórek, wykazując, że HKß i CD63 są zdolne do asocjacji na powierzchni komórki. Cały biotynylowany HKß odzyskany w punkcie czasowym 0-min jest wrażliwy na pasek MesNa. Ilość biotynylowanej podjednostki β związanej z CD63 zabezpieczonej przed odczynnikiem MesNa zwiększa się, gdy komórki mogą inkubować w temperaturze 37°C. W rzeczywistości ilość hkß, która jest obecna na powierzchni i związana z CD63 w 0 min, jest w przybliżeniu taka sama jak ilość HKß, która jest związana z CD63 i chroniona przed odpędzaniem w 45 min. Wyniki te sugerują, że podjednostka β związana z CD63 jest internalizowana i nie wraca na powierzchnię komórki.