grzyb Candida guilliermondii jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, w tym w ludzkiej mikrobiocie skóry i powierzchni błon śluzowych.Chociaż gatunek ten wykazuje zmniejszoną zjadliwość w porównaniu z innymi gatunkami Candida, 3 jest obecnie uważany za pojawiający się patogen, z dużą częstością występowania w Ameryce Łacińskiej.18C. guilliermondii został uznany za czynnik etiologiczny wielu różnych zakażeń klinicznych, w tym rozsianych głównie u pacjentów z obniżoną odpornością, 22 i ognisk szpitalnych u pacjentów chirurgicznych z urządzeniami wewnątrznaczyniowymi.Obecnie zalecane leczenie inwazyjnej kandydozy u pacjentów z neutropenią obejmuje kaspofunginę (CFG) lub mykafunginę (Mfg) jako terapię pierwszego rzutu, liposomalną amfoterycynę B (LAMB) i anidulafunginę (AFG), podczas gdy flukonazol (FLC) jest zalecany tylko wtedy, gdy potwierdzona jest wrażliwość na ten lek.Jednakże, w kilku badaniach wykazano,że C. guilliermondii ma zmniejszoną wrażliwość na FLC8,15, 19, a niepowodzenia terapeutyczne związane z izolatami z wysokimi amfoterycyną B (AMB) zgłaszano minimalne stężenia hamujące (Mic).9,12,24 chociaż prawie 90% izolatów wykazuje Mic echinocandins równe lub niższe niż kliniczne wartości graniczne (CBP) wrażliwości (2µg/ml),17 podobnie jak inne gatunki Candida, takie jak C. parapsilosis, niektóre Izolaty C. guilliermondii wykazują Mic znacznie wysokie.Dostępne dane dotyczące skuteczności AFG w inwazyjnej kandydozie są ograniczone, a potencjalna rola tego leku w praktyce klinicznej jest słabo poznana.W tym kontekście badania na zwierzętach mogą odgrywać ważną rolę w lepszym zrozumieniu korelacji in vitro – in vivo.11 dlatego naszym głównym celem była ocena aktywności AFG in vitro i In vivo wobec różnych izolatów C. guilliermondii, porównując wyniki z wynikami AMB i FLC.
materiały i metody Izolaty grzybowe
cztery Izolaty kliniczne C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 i UTHSC 10-3207) wykorzystano w badaniu in vitro, a dwa z nich (UTHSC 11-685 i UTHSC 11-142) wybrano do modelu mysim na podstawie ich różnych wrażliwości in vitro. Izolaty zidentyfikowano poprzez sekwencjonowanie regionu wewnętrznej transkrybowanej przestrzeni (ITS) i domen D1–D2 rRNA, porównując sekwencje z sekwencjami typu szczepu tego gatunku.
badania in vitro
wrażliwość in vitro czterech szczepów na AMB, FLC i AFG oceniano stosując referencyjną metodę mikrodilucji bulionu, 6candida parapsilosis ATCC 22019 i Candida krusei ATCC 6258 jako kontrole jakości.
krzywe zabicia czasu zostały opracowane dla wszystkich szczepów zgodnie z wcześniejszymi badaniami.5,20 w skrócie, przygotowano roztwór podstawowy każdego środka przeciwgrzybiczego, AMB (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) i AFG (Pfizer Inc., Madryt, Hiszpania) rozpuszczono w dimetylosulfotlenku i FLC (Pfizer Inc., Madryt, Hiszpania) w wodzie destylowanej. Ponadto rozcieńczenia leku przygotowano w 9 ml standardowego pożywki RPMI 1640 w celu uzyskania stężeń 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 i 32 µg/ml każdego leku. Izolaty poddano subkulturze w temperaturze 35°C przez 24 godziny na płytkach agaru dekstrozy ziemniaczanej (PDA). Hodowle C. guilliermondii zawieszono w jałowym roztworze soli fizjologicznej, a otrzymane zawiesiny dostosowano do 5×106 jednostek tworzących kolonie(CFU) / ml za pomocą hemocytometru i seryjnego poszycia na PDA w celu potwierdzenia żywotności. Rozcieńczenia i kontrole (wolne od leków) zaszczepiono 1 ml zawiesin grzybów, w wyniku czego początkowe inokulum wynosiło 5×105cfu / ml i inkubowano w temperaturze 35°C. 0, 2, 4, 6, 8, 24, i 48 godzin po zaszczepieniu i rozcieńczeniu w wodzie destylowanej; 30 µl z nich hodowano na płytkach PDA i inkubowano w temperaturze 35°C przez 48 godzin w celu oznaczenia CFU/ml. Zmniejszenie CFU o ≥99,9% lub 3 log10 jednostek w porównaniu do inokulum początkowego uznano za grzybobójcze, natomiast zmniejszenie
log10 jednostek uznano za fungistatyczne. Granica wykrywalności wynosiła 50CFU / ml. All time-kill curve badania przeprowadzono w duplicate.In w eksperymencie wykorzystano badania vivo
samca myszy z-1 (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Hiszpania) o średniej wadze 30g. Myszy trzymano w standardowych skrzynkach z wolnym dostępem do jedzenia i wody. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były nadzorowane i zatwierdzane przez Komisję ds. dobrostanu i etyki zwierząt Universitat Rovira i Virgili.
myszy miały neutropeniczną neutropenię dzień przed zakażeniem przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) 200 mg / kg cyklofosfamidu (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Hiszpania) plus dożylne (IV.) wstrzyknięcie 5-fluorouracylu (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Hiszpania) w dawce 150 mg/kg.10,14 w dniu zakażenia myszy poddano testowi dożylnemu 1×108cfu / zwierzę z każdego z dwóch szczepów C. guilliermondii, UTHSC 11-685 i UTHSC 11-142, w 0,2 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej do żyły ogonowej bocznej.3,4
losowo ustalono grupy ośmiu zwierząt dla każdego szczepu i leku. Grupy leczono w następujący sposób: dezoksycholan amfoterycyny B (AMBd) (Xalabarder Pharmacy, Barcelona, Hiszpania) w dawkach 0,8 mg/kg IV.raz na dobę (QD); liposomalna amfoterycyna B (jagnięcina) (Gilead Sciences S. A., Madryt, Hiszpania) przy 10 mg / kg IV., QD; FLC (Pfizer Inc., Madryt, Hiszpania) w dawce 25 mg/kg doustnie (P. O.) przez zgłębnik, dwa razy na dobę (BID); i AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Wielka Brytania) w dawce 10 mg/kg masy ciała/dawkę i. p., QD. Wszystkie zabiegi rozpoczęły się 24h po wyzwaniu i trwały 7 dni. Grupa kontrolna nie była leczona. Aby zapobiec zakażeniom bakteryjnym, wszystkie myszy otrzymywały podskórnie ceftazydym w dawce 5 mg/kg mc. dziennie od 1 do 7 dni po zakażeniu. Myszy sprawdzano codziennie i uśmiercano w dniu 8 po zakażeniu przez anoksję CO2. Skuteczność każdego leku oceniano na podstawie badań histopatologicznych i zmniejszenia obciążenia tkanek. Nerki usunięto w warunkach aseptycznych, a jedną z nich ważono i homogenizowano w 2 ml jałowej soli fizjologicznej. Seryjne 10-krotne rozcieńczenia homogeniatów nanoszono na PDA i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 35°C w celu obliczenia CFU/g. W badaniu histopatologicznym pozostałą nerkę zamocowano 10% buforowaną formaliną, odwodniono, osadzono parafinę i pokrojono na sekcje 2µm, które zabarwiono hematoksyliną-eozyną (H-E) i okresową plamą kwasową-Schiff (PAS) do badania za pomocą mikroskopu świetlnego.
statystyki
liczby kolonii z tkanek analizowano za pomocą testu U Manna–Whitneya, przy użyciu Graph Pad Prism 4.0 Dla Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Gdy wartości P były mniejsze niż 0, 05, różnice uznano za istotne statystycznie.
Wynikiw badaniach in vitro
Mic AMB wynosiło 0, 25–1µg/ml, 0, 06–0, 25 µg/ml dla AFG i 0, 5–1µg/ml dla FLC. Po odcięciu wrażliwości na AMB, FLC i AFG przeciwko C. guilliermondii, 16 wszystkich izolatów było wrażliwych na trzy leki. Szczepy kontroli jakości były w akceptowanych zakresach.
Kinetyka zabijania AMB wykazywała szybkie działanie grzybobójcze, które zwiększało się wraz ze stężeniem leku. W stężeniach równoważnych MIC lek ten wykazywał działanie grzybobójcze na trzy z czterech badanych izolatów (Fig. 1). Aktywność ta rozpoczęła się natychmiast po zaszczepieniu w stężeniach powyżej 1µg/ml, a grzybobójczy punkt końcowy został osiągnięty po 4 godzinach przy 32µg / ml. AFG w stężeniach powyżej 0,5 µg / ml wykazuje działanie grzybobójcze począwszy od 4H inkubacji. Grzybobójczy punkt końcowy został osiągnięty po 12-24h inkubacji przy 32µg / ml (Fig. 2). FLC wykazał aktywność fungistatyczną wobec wszystkich czterech izolatów (Fig. 3).
testy kinetyki zabijającej czas AMB przeciwko czterem szczepom C. guilliermondii . ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg / ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, (Δ) 1µg / ml, (Δ) 2µg / ml, ( ▿ ) 8µg/ml, (♦) 32µg / ml, (●) Kontrola. Linie przerywane oznaczają spadek CFU o 3log10 jednostek wzrostu w porównaniu z początkowym inokulum (aktywność grzybobójcza), linie przerywane wskazują granicę oznaczalności badania.
testy kinetyki zabijającej czas AFG przeciwko czterem szczepom C. guilliermondii . ( ■ ) 0,03 µg/ml, ( ▴ ) 0,12 µg / ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, (Δ) 1µg / ml, (Δ) 2µg / ml, ( ▿ ) 8µg/ml, (♦) 32µg / ml, (●) Kontrola. Linie przerywane oznaczają spadek CFU o 3 log10 jednostek wzrostu w porównaniu z początkowym inokulum (działanie grzybobójcze), linie przerywane wskazują granicę oznaczalności badania.
testy kinetyki zabijającej czas FLC przeciwko czterem szczepom C. guilliermondii . ( ■ ) 0,03 µg/mL, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, (●) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿)8µg/ml, (♦) 32µg / ml, (●) Kontrola. Linie przerywane oznaczają spadek CFU o 3log10 jednostek wzrostu w porównaniu z początkowym inokulum (aktywność grzybobójcza), linie przerywane wskazują granicę oznaczalności badania.
badania In vivo
jagnięcina w dawce 10 mg / kg była jedynym lekiem zdolnym do zmniejszenia obciążenia grzybiczego w nerkach myszy zakażonych każdym z dwóch szczepów, przy czym redukcja była znacznie wyższa niż w przypadku innych terapii (P≤0, 04). AMBd i FLC były w stanie zmniejszyć obciążenie tkanek u myszy zakażonych szczepem, który wykazał najniższe Mic dla tych dwóch leków, tj. 0,25 µg / ml dla AMB i 0,5 µg / ml dla FLC (p≤0,008). W przypadku AFG zmniejszenie obciążenia grzybiczego było niewielkie i mniejsze niż w przypadku AMBd i znacząco zmniejszało obciążenie tkanek w nerkach tylko w odniesieniu do grupy kontrolnej dla szczepu UTHSC 11-685 (P = 0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 i FLC 50; cP0. 05 kontra AFG 10 i FLC 50.
badanie histologiczne wykazało ogniskowe nacieki komórek grzybów w nerkach nieleczonych zwierząt oraz u myszy leczonych AMBd, FLC lub AFG. Nerki myszy leczonych jagnięciną wykazały tylko łagodną inwazję grzybiczą. Objawy martwicy, reakcji zapalnej lub zmian miąższu nie były obserwowane w grupach kontrolnych ani u leczonych zwierząt (Fig. 5).
obecność nacieku grzybiczego (czarna strzałka) w odcinku nerkowym myszy kontrolnej zakażonej C. guilliermondii, w 8 dni po zakażeniu (okresowe przebarwienia kwasowe, powiększenie 1000×). Bar=10µm.
dyskusja
badania in vitro nie wykazały zmniejszonej wrażliwości izolatów C. guilliermondii na FLC lub AFG. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, krzywe zabijania czasowego AMB wykazały zależną od stężenia aktywność grzybobójczą wobec wszystkich izolatów, 4,5, 7 i FLC wykazały efekt fungistatyczny niezależnie od badanego stężenia.Wiadomo, że AMBd wykazuje wyższą skuteczność niż jego postać lipidowa, zwłaszcza w nerkach, gdy jest podawany w tych samych dawkach.1 jednak badania farmakokinetyczne wykazały, że po podaniu 0,75 mg/kg AMBd Cmax AMB osiągane w surowicy myszy wynosiło 0,30 µg / ml.25 jednak mikrofon AMB jednego z dwóch testowanych izolatów jest wyższy niż ta wartość; dlatego użyliśmy dużej dawki jagnięciny, aby osiągnąć wyższe stężenia.1 rzeczywiście, podawanie jagnięciny w dawce 10 mg / kg było skuteczne w zmniejszaniu obciążenia grzybiczego obu szczepów. Fakt ten korelował z krzywymi zabijania, w których AMB osiągnęła działanie grzybobójcze przeciwko dwóm izolatom badanym in vivo, w stężeniach 1µg / ml. Według naszej wiedzy, jest to pierwsze badanie, które próbowało ustalić związek między kinetyką zabijania a eksperymentalną skutecznością AFG i FLC in vivo przeciwko izolatom klinicznym C. guilliermondii. Istnieją tylko wcześniejsze badania nad echinokandynami, w szczególności nad kaspofunginą (CFG) w zakażeniu rozsianym przez C. guilliermondii. CFG w dawce 1 mg / kg był skuteczny w zmniejszaniu obciążenia grzybiczego nerek u myszy zakażonych jednym szczepem C. guilliermondii o MIC 8 µg/ml, podczas gdy zabijanie czasu wykazało, że nie uzyskano działania grzybobójczego przy stężeniach 64 µg / ml.4 z drugiej strony, nasze badanie wykazało zależną od stężenia aktywność AFG, która przy 32 µg/ml wywierała działanie grzybobójcze, jak wcześniej donoszono,17 w 24h i 8 µg/ml. W poprzednich badaniach stwierdzono, że stężenie AFG w surowicy i nerkach wynosiło około 13 µg/ml po 7 dniach leczenia dawkami 10 mg/kg mc.W tym przypadku AFG było w stanie jedynie w niewielkim stopniu zmniejszyć obciążenie grzybicze nerek myszy z neutropenią zakażonych jednym z dwóch badanych szczepów, co nie wydaje się być związane z małą różnicą AFG MICs między dwoma testowanymi szczepami (1 rozcieńczenie), co sugeruje, że odpowiedź na leczenie AFG jest zależna od szczepu. Podobnie, FLC był również w stanie tylko nieznacznie zmniejszyć obciążenie grzybicze w nerkach myszy poddanych działaniu jednego z dwóch szczepów, pomimo podawanej dawki, która osiąga stężenia w surowicy powyżej Mic, 2 co również nie było zaskakujące ze względu na jego aktywność fungistatyczną.
podsumowując, nasze badania wykazały wyższą aktywność i skuteczność jagnięciny przeciwko dwóm szczepom C. guilliermondii, w przeciwieństwie do słabego działania FLC i AFG. Należy jednak przeprowadzić dalsze badania z większą liczbą izolatów C. guilliermondii reprezentujących szerszy zakres Mic AFG w celu oceny, czy istnieje jakikolwiek związek między wartościami MIC a skutecznością AFG.
konflikt interesów
Brak do zgłoszenia.
