Kapsazepina (CPZ) aktywuje heterologicznie wyrażony ludzki TRPA1.

(a) CPZ (10 µM) wywołuje prądy zależne od hTRPA1 w transfekowanych komórkach HEK293t. Należy zwrócić uwagę na całkowite hamowanie prądów przez selektywnego antagonistę TRPA1 HC030031 (HC, 10 µM). (B) reprezentatywne prądy rampowe wywołane w komórce hek293 transfekowanej hTRPA1 przez rampy napięciowe 400 ms od -100 do +100 mV stosowane co 4 s. każdy symbol reprezentuje amplitudę prądu przy -80 mV (kwadraty) i +80 mV (okręgi). Prąd indukowany CPZ był silnie hamowany przez HC. (C) przykłady poszczególnych prądów rampowych odpowiadających wypełnionym symbolom i liczbom w B. (D) CPZ (50 µM, 10 s) wywołuje duże transienty wapnia w komórkach hTRPA1-HEK293 (czarny ślad, N = 128). HC (20 µM; czerwony ślad, n = 209) i A-967079 (10 µM; niebieski ślad, N = 140) całkowicie hamowały odpowiedź na CPZ. Dane reprezentują średnie (linie proste) ± SEMs (linie przerywane). E) aktywacja hTRPA1 przez CPZ (10 µM) zależy od stężenia. Czarny ślad: komórki hTRPA1-HEK293 (N = 52) były stymulowane przez zwiększenie stężenia CPZ przez 20 s w odstępach 3 min. Szary ślad: niezakażone komórki HEK293 (N = 101) poddano tym samym stężeniom CPZ. (F) Aktywacja hTRPA1 przez CPZ (1 µM) obejmuje trzy krytyczne cysteiny w n-końcu kanału. Czarny ślad: odpowiedź N = 123 komórek HEK293 wyrażających wt hTRPA1 na kolejne zastosowania CPZ (1 µM), karwakrolu (100 µM) i izotiocyjanianu allilu (aitc, 50 µM). Szary ślad: odpowiedź N = 165 komórek HEK293 wyrażających zmutowaną hTRPA1-3C na tę samą sekwencję bodźców. Zwróć uwagę na znaczne zmniejszenie odpowiedzi mutanta hTRPA1 – 3C na CPZ i aitc, ale nie na karwakrol. G) różnica w czułości CPZ między genotypami została zniesiona przy 100 µM CPZ. (H) aktywacji hTRPA1 przez CPZ można zapobiec za pomocą zmiatacza N-acetylo-cysteiny (NAC). Czarny ślad: w eksperymentach kontrolnych komórki hTRPA1-HEK293 poddano prowokacji CPZ (50 µM; 60 s; n = 74). Czerwony ślad: w oddzielnym eksperymencie komórki wystawiono najpierw przez 30 s na działanie kombinacji CPZ (50 µM) i NAC (15 mM), a następnie natychmiast po tym samym CPZ przez kolejne 30 s (n = 83).

indukowany przez CPZ napływ wapnia przez hTRPA1

selektywne działanie CPZ na TRPA1 zostało potwierdzone przez zastosowanie techniki mikrofluorymetrii wapnia. komórki hTRPA1-HEK293 były stymulowane przez dwa zastosowania CPZ (50 µM) przez 10 s w odstępach 5-minutowych (Fig. 2D). Selektywni antagoniści HC (20 µM) i A-967079 (10 µM) nanoszono przez 1 min przed i podczas pierwszego wyzwania CPZ. Odpowiedź CPZ została całkowicie zniesiona przez obu antagonistów. Warto zauważyć, że usunięcie HC doprowadziło do napływu wapnia, prawdopodobnie z powodu resztkowego działania CPZ, podczas gdy ten efekt wyłączenia był nieobecny w przypadku a-967079, który może wolniej się odłączać (Fig. 2D). Następnie przeanalizowaliśmy zależność stężenia od efektów CPZ. Zwiększające się stężenia CPZ (100 nM, 500 nM, 5 µM i 50 µM) nanoszono na komórki hTRPA1-HEK293 przez 20 s każda w odstępach 3-minutowych. Począwszy od 100 nM, wszystkie stężenia CPZ wywoływały transienty wapnia o coraz większych amplitudach (Fig. 2E). Karwakrol (100 µM) został zastosowany pod koniec eksperymentu do kontroli funkcjonalnej ekspresji TRPA1, ale odpowiedź karwakrolu po 50 µM CPZ była wyraźnie mała, co sugeruje odczulanie krzyżowe. Niezakażone komórki HEK293 poddano tym samym aplikacjom CPZ i tylko najwyższe badane stężenie (50 µM) wywołało Minimalny wzrost wapnia. Spodziewaliśmy się, że CPZ będzie angażować trzy krytyczne reszty cysteiny w domenie N-końcowej kanału, ponieważ jest to związek elektrofilowy. Komórki hek293 wykazujące ekspresję wt hTRPA1 i komórki wykazujące ekspresję Triple cysteine mutant hTRPA1 – 3C (C621S, C641S, C665S) poddano zastosowaniu CPZ (1 µM, 20 s), a następnie nieelektrofilowym agonistą karwakrolu (100 µM, 20 s) i wysoce elektrofilowym aitc (50 µM, 30 s). Jonomycyna została zastosowana pod koniec eksperymentu jako kontrola pozytywna. Amplituda przemijania wapnia wywołanego przez 1 µM CPZ była znacznie zmniejszona (>80%) w komórkach wykazujących ekspresję hTRPA1-3C w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję wt hTRPA1 (Fig. 2F), podczas gdy różnica czułości CPZ pomiędzy genotypami została zniesiona przy stężeniu CPZ 100 µM (Fig. 2G). Odpowiedź AITC była zmniejszona w zmutowanych komórkach, podczas gdy karwakrol wywoływał Duże przejściowe jony wapnia zarówno w mutantach WT, jak i 3C. Łącznie te odpowiedzi komórkowe wskazują, że stosunkowo wysoka moc CPZ zależy od trzech krytycznych cystein. Jednakże, gdy stężenie CPZ jest 100 razy większe, inne miejsca wiązania przejmują aktywację hTRPA1. To wysokie stężenie lipofilowego CPZ może również wchodzić w interakcje z komórkową błoną lipidową, pośrednio aktywując TRPA1, jak wcześniej wykazano dla lipidowego składnika lipopolisacharydów16. Ponadto, w obecności elektrofilowego zmiatacza N-acetylo-cysteiny (NAC) w stężeniu nasycającym (15 mM) 50 µM CPZ nie był w stanie wywołać żadnej odpowiedzi. Po usunięciu NAC, CPZ wywołało duże transienty wapnia w komórkach hek293t transfekowanych hTRPA1 (Fig. 2H), co potwierdza, że CPZ działa jako agonista elektrofilowy dla hTRPA1.

CPZ aktywuje subpopulację neuronów zwoju korzeni grzbietowych (DRG) wrażliwych na AITC

neurony DRG były utrzymywane w hodowli pierwotnej i badane za pomocą mikrofluorymetrii wapnia. Komórki stymulowano CPZ (50 µM, 20 s), a następnie AITC (100 µM, 30 s), kapsaicyną (CAP, 1 µM, 10 s) i KCl (60 mM, 30 s). Rysunek 3A ilustruje przykłady neuronów DRG reagujących na wszystkie te cztery bodźce. Typowa frakcja neuronów DRG została aktywowana przez AITC (301 z 906 neuronów, 33%, N = 8 myszy), co wskazuje na funkcjonalną ekspresję TRPA1. Subpopulacja tych neuronów wrażliwych na AITC była również aktywowana przez CPZ (185 z 301 neuronów, 61%). Wrażliwość na CPZ była prawie całkowicie ograniczona do neuronów reagujących na AITC. Z 200 neuronów wrażliwych na CPZ, 185 (93%) było również aktywowanych przez AITC, co wskazuje na silną zgodność wrażliwości na CPZ i AITC (Fig. 3). Podobnie jak w przypadku komórek hek293 wyrażających hTRPA1, przemiany wapnia wywołane przez CPZ w neuronach DRG były zależne od stężenia z wartością EC50 szacowaną na 30 µM CPZ, a mała odpowiedź AITC po 100 µM CPZ ponownie sugerowała desensytyzację krzyżową (Fig. 3B, C). Rysunek 3D pokazuje nakładanie się odpowiedzi CPZ, CAP i aitc w neuronach WT DRG w podanych stężeniach: 14% neuronów DRG odpowiedziało na AITC, ale nie na CAP (125/906), 16% odpowiedziało na CAP, ale nie na AITC, podczas gdy CPZ indukowało przejściowe stężenia wapnia w 78% neuronów, które odpowiedziały zarówno na AITC, jak i CAP (137 z 176). W celu wykazania specyficzności obserwowanych efektów neurony TRPV1−/− i TRPA1−/− DRG zostały poddane powyższemu protokołowi. Około 90% neuronów DRG z niedoborem TRPV1, które były wrażliwe na AITC, również odpowiedziało na CPZ (komórki 509/572), podczas gdy żaden z 448 badanych neuronów DRG z niedoborem TRPA1 nie wykazywał napływu wapnia w odpowiedzi na CPZ (100 µM), jak pokazano na reprezentatywnych przykładach na Fig. 3E, F.

Kapsazepina (CPZ) aktywuje mysi TRPA1 w neuronach zwojów korzeni grzbietowych.

(a) CPZ (50 µM) aktywuje subpopulację wrażliwych na aitc (100 µM) neuronów zwoju rdzeniowego myszy (DRG). Indywidualne odpowiedzi trzech różnych neuronów DRG wrażliwych na aitc i kapsaicynę (CAP, 1 µM), które były aktywowane przez CPZ. CPZ był stosowany przez 20 s, AITC przez 30 s, A CAP przez 10 s w odstępach 4 min pozwalających na odzyskanie. KCl (60 mM) zastosowano pod koniec eksperymentu, aby zapewnić żywotność hodowanych neuronów. (B) uśredniona odpowiedź N = 135 neuronów wrażliwych na AITC na trzy różne stężenia CPZ (25, 50, 100 µM, 20 s każdy). Zwróć uwagę na zależność amplitudy Ca2+ od stężenia. Proste ślady reprezentują średnie, a kropkowane ślady reprezentują SEMs. (C) zależny od stężenia wzrost indukowanego CPZ i w neuronach DRG wrażliwych na AITC znormalizowany do bodźca depolaryzującego KCl (60 mM). EC50 o wartości ∼30 µM obliczono przez dopasowanie do funkcji dawka-odpowiedź. Dane są reprezentatywne dla dwóch zestawów eksperymentów i pokazują średnie ± sem; dla CPZ 1, 10, 25 µM: n = 169, dla CPZ 25, 50, 100 µM: n = 138. (D) ilustrowanie populacji neuronów DRG wrażliwych na CPZ, AITC i CAP oraz ich nakładania się. W sumie 906 obrazowanych neuronów (wybranych przez ich odpowiedź na KCl), 200 (22%) aktywowano przez CPZ (50 µM), 301 (33%) przez AITC (100 µM) i 323 (36%) przez CAP (1 µM) (szczegółowa analiza frakcji, patrz Legenda SI Rysunek 3). (E) CPZ (100 µM, 20 s) aktywuje wrażliwe na AITC (100 µM, 20 s) neurony DRG myszy z niedoborem TRPV1. Indywidualne odpowiedzi różnych neuronów wrażliwych na AITC, które były aktywowane przez CPZ. Około 90% (509/572 komórek) neuronów DRG z niedoborem TRPV1, które były wrażliwe na AITC, reagowało na CPZ. CAP (1 µM, 10 s) nie indukuje zmian Ca2+ w neuronach TRPV1−/−. (F) brak wywołanego CPZ (100 µM) napływu Ca2+ w neuronach DRG z niedoborem TRPA1. Indywidualne odpowiedzi różnych neuronów DRG wrażliwych na CAP (1 µM) (spośród 448 badanych neuronów), które nie były aktywowane przez CPZ ani AITC (10 µM).

systemowa odczulanie przez TRPA1 łagodzi ból

po odkryciu, że CPZ jest silnym agonistą TRPA1, zrozumieliśmy, dlaczego pierwsze lewatywy CPZ (dwa razy na dobę) były oczywiście bolesne u myszy WT. Następnie określiliśmy ilościowo nocyfenywne zachowanie wywołane lewatywą CPZ (531 µM) u zdrowych zwierząt (każde N = 6), licząc reakcje wijące się i rejestrując reakcje odruchowe trzewno-motoryczne (VMRs) za pomocą zintegrowanej elektromiografii (EMG) ściany mięśni brzucha (Fig. 4A,B). Podczas powtarzania terapii CPZ dwa razy na dobę zauważyliśmy, że nokauty TRPA1 w żadnym momencie nie wykazywały zachowań związanych z bólem. Ponadto, myszy WT wykazywały progresywny spadek początkowo silnych odpowiedzi bólowych ze stromym spadkiem około 3 dnia, co doprowadziło do całkowitego odczulenia obu parametrów nocyfenyny. Ta utrata percepcji bólu okrężnicy u zdrowych myszy wzbudziła oczekiwanie, że lewatywy mogły dostarczyć CPZ Farmakodynamiczną ilość wystarczającą do wywołania ogólnoustrojowej hipoalgii. Aby przetestować tę hipotezę, zastosowaliśmy test ściereczki do oczu przy użyciu AITC (100 µM) i nasadki (1 mM) (rys. 4C, D) (n = 6). Oba testy wykazały wyraźne tłumienie liczby wycierania oczu u myszy WT, które były leczone lewatywami CPZ (do 12-16 godzin przed testem). Efekty te najprawdopodobniej były spowodowane odczulaniem TRPA1, a nie blokiem TRPV1, ponieważ myszy z niedoborem TRPV1 były niewrażliwe na wkraplanie oleju musztardowego (Aitc, 100 µM) do oka w tym samym stopniu, co myszy WT (Fig. 4C). Odwrotnie, lewatywy CPZ były nieskuteczne u myszy TRPA1−/−, gdy myszy te były kwestionowane przez zakraplanie nakrętki do oka (Fig . 4D).

lewatywy Kapsazepinowe odczulają miejscowe i odległe reakcje bólowe.

(a) ostre reakcje wicia w odpowiedzi na lewatywy CPZ (531 µM) podczas pierwszych 5 minut po aplikacji. Powtarzane lewatywy CPZ (dwa razy na dobę) prowadziły do stopniowego zmniejszania odpowiedzi wijących się. Dramatyczne stopniowe zmniejszenie obserwowano po 5 lewatywach u myszy WT. Natomiast myszy TRPA1−/− leczone CPZ (531 µM) lub myszy WT leczone lewatywami nośnikowymi (PBS) wykazywały tylko kilka wić, które wystąpiły w ciągu pierwszych 30 s (każda N = 6). B) reakcje Trzewno-motoryczne (Vmrs) na lewatywy CPZ. Lewatywy CPZ dwa razy na dobę prowadziły do ciągłego spadku VMRs u myszy WT, podobnie jak przebieg reakcji wicia. VMRs w odpowiedzi na nośnik nie różniły się znacząco od lewatyw CPZ w TRPA1−/− (obie wartości n = 6). A, B) Grupa WT CPZ w porównaniu do grupy pojazdów. (C) powtarzane lewatywy CPZ osłabiają zachowanie ściereczki do oczu do AITC (100 µM). Zarówno myszy WT, jak i TRPV1−/− leczone lewatywami CPZ wykazały Głębokie zmniejszenie liczby wycieraczek oka w porównaniu z nośnikiem (obie n = 6). Kontrolnymi były myszy WT bez kropli nośnika lewatywy (PBS) do oka. (D) lewatywy CPZ łagodzą zachowanie ściereczki do oczu do nasadki (1 mM). Myszy WT, którym podawano nośnik i myszy TRPA1−/−, którym podawano lewatywy CPZ dwa razy na dobę przez 7 d, wykazywały liczne reakcje wytarcia oka na zakroplenie nakrętki do oka, testowane 12 godzin po ostatniej lewatywie CPZ (obie n = 6). Myszy WT leczone lewatywami CPZ wykazały głęboką redukcję liczby wycieraczek do oczu. E) termiczne i F) mechaniczne progi odstawienia obu pił tylnych podczas podawania doustnego leku CPZ (531 µM) lub aitc (500 µM) przez wodę pitną. (E) CPZ i AITC powyżej 10 d w porównaniu do grupy leczonej nośnikiem wywołały progresywny wzrost w czasie 3-5 d w opóźnieniach odstawienia do stymulacji promieniowaniem cieplnym, które normalizowały się w ciągu 2 tygodni od wypłukania (każdy n = 6). (F) mechaniczne progi stymulacji elektrodynamicznym włóknem von Freya nie wykazały systematycznego trendu w przypadku obu związków (każdy N = 6). Wszystkie powtarzane pomiary ANOVA i Dunnetta po teście, z wyjątkiem (C, D) testu U Manna Whitneya.

ponieważ powtarzające się lewatywy są nieprzyjemną drogą podawania, przetestowaliśmy możliwe działanie przeciwnocycepcyjne peroralnego CPZ (531 µM) w wodzie pitnej. Schemat spożywania alkoholu przez 10 dni był dobrze tolerowany, bez wyraźnych działań niepożądanych. Podczas ciągłego doustnego podawania CPZ opóźnienie odstawienia łapy do stymulacji ciepłem promieniowym (metoda Hargreavesa) stopniowo zwiększało się w obu tylnych łapach (rys. 4E). Czas tolerancji był około dwukrotnie w dniu 7 i pozostawał znacznie podwyższony od dnia 2 do 10. Po 2 tygodniach rekonwalescencji czystą wodą pitną, opóźnienia odstawienia powróciły do poziomu wyjściowego. Mechaniczna reakcja na stymulację liniowo rosnącą siłą elektrodynamicznego żarnika von Freya nie miała znaczącego wpływu podczas dziesięciu dni picia CPZ (Fig. 4F). Pojawiło się pytanie, czy hipoalgezja cieplna i chemiczna reprezentują efekt klasowy odczulania agonistów TRPA1, czy też jest specyficzna dla CPZ. W ten sposób podawaliśmy AITC w podobnym i dobrze tolerowanym stężeniu (500 µM) przez wodę pitną. Ten sam schemat dawkowania AITC, jak opisano dla CPZ, powodował stopniowe zwiększenie opóźnienia odstawienia łap do stymulacji promieniowaniem cieplnym, które było znacznie mniejsze niż indukowane przez CPZ (Fig. 4E). Reakcja mechaniczna nie uległa zmianie w schemacie picia AITC (ryc. 4F).

CPZ powoduje długotrwałe odczulanie peptydergicznych neuronów czuciowych z ekspresją TRPA1/TRPV1

następnie zadaliśmy pytanie, czy odczulanie całych zwierząt przez CPZ można odtworzyć na poziomie komórkowym. W tym celu przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania wapnia z izolowanymi neuronami DRG, które uzyskano od myszy kontrolnych i od zwierząt leczonych przez 7 dni dwa razy na dobę lewatywami CPZ. Neurony te były przechowywane w hodowli przez 16 do 24 godzin, w obecności NGF. Łącznie 399 neuronów z myszy kontrolnych i 584 neuronów z myszy leczonych lewatywą załadowano Fura-2 i zarejestrowano tranjenty wapnia wywołane przez AITC, karwakrol, CAP i roztwór bogaty w KCl. Odpowiedzi na te agonisty TRPA1 (aitc i karwakrol) i TRPV1 (CAP) nie różniły się znacząco w neuronach DRG od zwierząt kontrolnych i zwierząt leczonych lewatywą (Fig. S1). Jednakże ekspresja mRNA TRPA1 (qPCR) była około dwukrotnie większa w DRG lędźwiowo-krzyżowym przygotowanym bezpośrednio po ostatniej lewatywie CPZ (Fig. S2), podczas gdy nie stwierdzono zmian ekspresji TRPA1 po upłynięciu 24 godzin in vivo po ostatniej lewatywie. TRPV1 mRNA nie zmienił się w obu okolicznościach. Tak więc, transkrypcyjna regulacja ekspresji genu TRPA1 miała miejsce z powodu wielu lewatyw CPZ, ale została szybko cofnięta, gdy zaprzestano podawania CPZ. W warunkach hodowli DRG prawdopodobnie miało miejsce to samo odwrócenie epigenetyczne i wszystkie pozostałości CPZ prawdopodobnie zostały wyprane, tak że nie można było oczekiwać pozostałości odczulania. Ponieważ modele komórkowe nie odzwierciedlały długotrwałego odczulania całych zwierząt in vivo wywołanego CPZ, szukaliśmy innego silnego wskaźnika zaskakującego efektu systemowego. Większość neuronów nocyceptywnych ma charakter peptydergiczny, wyrażający głównie peptyd genowy kalcytoniny (CGRP)i substancję P (SP) 15,17. Po depolaryzacji, podobnie jak przez KCl i napływ wapnia, w wyniku aktywacji napięciowych kanałów wapniowych, neuropeptydy te są uwalniane z włókien nerwowych w funkcji quasi-eferentnej (zapalenie neurogenne). Z drugiej strony, aktywowane kanały TRP same w sobie są bardzo dobrymi przewodnikami wapnia i nie wymagają wsparcia przez żadne zamknięte napięciem kanały sodowe lub wapniowe w celu wywołania pęcherzykowej egzocytozy CGRP18. Tak więc stymulowane uwalnianie CGRP może służyć jako wskaźnik aktywacji nocyceptora (peptydergicznego). Z tego samego powodu neuropeptydy wazoaktywne mają różny wpływ na proces zapalny per se i wykazano,że wyczerpanie lub odczulanie peptydergicznej populacji neuronów czuciowych łagodzi zapalenie okrężnic19,20, 21. Aby ustalić, czy lewatywy CPZ (531 µM) odczulają się przez TRPA1, lokalnie i systemowo, zastosowaliśmy izolowane preparaty jelita grubego i skóry myszy. Dwukropki zdrowych myszy C57BL / 6 (n = 8) wystawiono na działanie CPZ (100 µM), które wywołało masowe uwalnianie CGRP (Fig. 5); kolejne zastosowania AITC (100 µM) 5 minut lub 15 minut po CPZ (rys. 5A, B) nie może już wywoływać uwalniania CGRP, co sugeruje Głębokie, funkcjonalne odczulanie krzyżowe agonisty TRPA1. Efekt ten nie może być spowodowany wyczerpaniem, ponieważ wynikająca z niego odpowiedź KCl (60 mM) była normalna. Dwukropki myszy, które były wielokrotnie leczone lewatywami CPZ (531 µM) in vivo, dwa razy dziennie przez 7 d, izolowano i testowano 12-16 godzin po ostatniej lewatywie. Ani CPZ (100 µM), ani AITC (100 µM) nie wywołały żadnego uwalniania CGRP w tym stanie (Fig. 5C, D); w szczególności, indukowane przez CAP (30 nM) uwalnianie CGRP zostało znacznie zmniejszone, ale nie zniesione (Fig. 5E). W przeciwieństwie do tego, indukowane przez KCl (60 mM) uwalnianie CGRP przez niespecyficzną depolaryzację nie tylko nie zostało ograniczone, ale faktycznie wzmocnione po lewatywach CPZ. Wskazywało to na to, że włókna nerwowe okrężnicy nie były wyczerpane CGRP, ale raczej przepełnione, ale zasadniczo odczulone w trwały sposób na aktywację chemiczną poprzez TRPA1, jak również TRPV1 (N = 6). Wreszcie, również preparat skóry, wyizolowany 12-16 godzin po ostatniej lewatywie CPZ, wykazał, że indukowane przez AITC (100 µM) i CAP (1 µM) uwalnianie CGRP było silnie zmniejszone zgodnie z odczulaniem całego ciała obserwowanym w testach behawioralnych (Fig. 5F, G, patrz Rys. 4A-F) (n = 6).

miejscowe i systemowe odczulanie peptydowych nerwów czuciowych przez kapsazepinę (CPZ) wskazaną przez zmienione uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP).

(a) ostre uwalnianie CGRP z wyizolowanych preparatów jelita grubego myszy WT indukowane CPZ (100 µM); kolejne narażenie na olej gorczycowy (AITC, 100 µM) nie indukuje uwalniania CGRP, podczas gdy niespecyficzna depolaryzacja przez KCl (60 mM) jest skuteczna jak zwykle. Dane to średnia + SEMs (N = 8). (B–D) indukowane CPZ (100 µM) i aitc (100 µM) uwalnianie okrężnicy CGRP zostało zniesione u myszy wstępnie leczonych lewatywami CPZ dwa razy na dobę przez 7 d aż do dnia poprzedzającego eksperyment uwalniania, podczas gdy indukowane CGRP okrężnicy CGRP przez CAP (1 µM) zostało znacznie zmniejszone, ale nie zniesione u tych myszy w porównaniu z grupami kontrolnymi. (**P < 0,01, ***p < 0,001, każdy N = 6). (E) podobnie, indukowane przez AITC (100 µM) uwalnianie CGRP zostało zniesione w izolowanych preparatach skórnych z tylnych pazurów myszy wstępnie leczonych lewatywami CPZ. (F) w przeciwieństwie do tego, indukowane przez nasadkę (1 µM) uwalnianie CGRP było silnie zmniejszone ze skóry tych myszy w porównaniu z grupami kontrolnymi. (**P < 0,01, ***p < 0,001, każdy N = 6). Zauważ, że wszystkie odpowiedzi KCl (60 mM) po odczulonych odpowiedziach CPZ i aitc były normalne (B,C,E), podczas gdy odpowiedzi KCl niekompletnie odczulonej populacji neuronów stymulowanej czapką (D, F) były tak samo zmniejszone,jak we wszystkich eksperymentach kontrolnych, co sugeruje wyczerpanie zapasów CGRP, któremu zapobiega się poprzez skuteczne odczulanie subpopulacji neuronów wrażliwych CPZ/aitc.