kompartment mieloidalny wrodzonego układu odpornościowego składa się z wielu typów komórek, których funkcje obejmują usuwanie uszkodzonych i apoptotycznych komórek, prezentację antygenu, immunosupresję i ochronę gospodarza przed obcymi mikroorganizmami.

monocyty stanowią wysoce plastyczny podzbiór komórek, które tworzą wrodzony układ odpornościowy. Komórki te są zdolne do trawersowania naczyń krwionośnych i, po wystawieniu na działanie określonych cytokin, ulegają różnicowaniu w różne typy komórek. Monocyty krążące są klasyfikowane jako nieklasyczne lub klasyczne i można je odróżnić na podstawie wzorca ekspresji receptora na powierzchni komórki. Klasyczne monocyty w układzie krążenia wykazują CD14+++Hi/CD16−/lo i są obecne zwłaszcza w miejscach zakażenia lub choroby (1,2).

Ludzkie nieklasyczne monocyty w układzie krążenia wykazują ekspresję powierzchniową CD16+++Hi/CD14+/lo (1). Po aktywacji monocyty przechodzą kilka morfologicznych i biochemicznych zmian czynnościowych, w wyniku czego monocyty różnicują się w nowe typy komórek, takie jak makrofagi (3).

w paradygmacie określanym jako aktywacja klasyczna, ludzkie monocyty wykazują plastyczność fenotypową, która może być inicjowana przez ekspozycję na cytokinę interferon—γ (IFN-γ) promującą odpowiedź th1 lub czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), a także lipopolisacharyd endotoksyny (LPS) (4,5). Ten mechanizm klasycznej aktywacji generuje makrofagi M1, które działają w celu wytworzenia mediatorów prozapalnych, które zapewniają ochronę gospodarza przed bakteriami i wirusami (6). Ludzkie monocyty można również odróżnić od makrofagów M2 poprzez ekspozycję na cytokiny promujące odpowiedź Th2, takie jak interleukina-10 (IL-10) i transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) (4,7). Makrofagi M2 wyrażają wysokie poziomy CD206 (receptor mannozy) i CD163, wytwarzają niskie poziomy cytokin prozapalnych i promują gojenie się ran i przebudowę matrycy.

komórki dendrytyczne (DCs) są kolejnym zestawem komórek odpornościowych pochodzących z monocytów, których funkcją jest prezentowanie antygenów komórkom T w celu zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej opartej na komórkach T. DCs można podzielić głównie na trzy podgrupy: Klasyczne (cDCs), plazmacytoid (pDCs) i pochodzące z monocytów (moDCs). cDCs zazwyczaj znajdują się w tkance limfatycznej, śledziona, węzły chłonne, i szpiku kostnego. PDC przypominają komórki plazmatyczne i zazwyczaj znajdują się w krążeniu krwi (8). Po ekspozycji na czynnik stymulujący kolonie makrofagów granulocytów (GM-CSF) i IL-4 (9,10) monocyty można różnicować w DCs, które są często określane jako DCS pochodzące z monocytów (moDCs). stwierdzono, że modc wykazują ekspresję markerów powierzchni komórek CD80, CD83, CD86 i CD1a in vitro (11-13). Podczas gdy modc różnią się od makrofagów kształtem i funkcją komórki, mają wspólną ekspresję kilku antygenów powierzchni komórki, w tym CD11c, CD206 i CD1a (14).

kilka grup zgłosiło skuteczne różnicowanie ludzkich monocytów CD14+ w makrofagi; jednak wiele z tych opublikowanych protokołów jest odmiennych. Powszechną odmianą tych metod jest włączenie (15) lub pominięcie (16) IL-6. Inną różnicą między protokołami jest czas leczenia. Ten brak spójności między protokołami jest problematyczny.

aby rozwiązać te problemy, zbadaliśmy i porównaliśmy włączenie I pominięcie IL-6 w leczeniu cytokin stosowanym w typowych metodach różnicowania monocytów u ludzi. Odkryliśmy, że przy braku IL-6 strategie te wytwarzają komórki o niskim stopniu jednorodności, co może dać niejednoznaczne wyniki eksperymentalne. Po drugie, aby jeszcze bardziej rozwiązać ten problem, opracowaliśmy nową fazową strategię in vitro z włączeniem IL-6. Odkryliśmy, że ta strategia znacznie poprawiła homogeniczność komórkową makrofagów M1 I m2, a także modc, które były zróżnicowane od ludzkich monocytów CD14+. Ta poprawa metodologii zapewni naukowcom lepsze modele do badania układu odpornościowego i stanów chorobowych.

materiały i metody

preparaty komórkowe

Pobrano z pełnej krwi pięciu lub więcej zdrowych dawców płci męskiej, które zebrano. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) otrzymano z powłok buffy metodą ficoll-Paque (gęstość 1,077 g/mL) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) wirowanie gradientem gęstości w 400 × g w 18°C przez 35 minut w celu oddzielenia składników krwi. Komórki przemyto kilka razy za pomocą 1× PBS i policzono za pomocą licznika komórek Nexcelom Auto T4 plus (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Po policzeniu monocyty CD14 + wyizolowano z PBMC za pomocą znakowania magnetycznego za pomocą sprzężonych mikrogranulek MAB CD14 (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA), po którym następuje separacja przy użyciu kolumn magnetycznych (130-042-401 i 130-042-302; Miltenyl Biotec) zgodnie z instrukcją producenta, z jednym wyjątkiem: podczas pobierania komórek CD14+ z kolumny magnetycznej komórki wypłukiwano początkowo przy użyciu buforu 5 mL, opierając się wyłącznie na grawitacji (bez użycia dostarczonego tłoka). Po początkowym płukaniu 5 mL dodano dodatkowy bufor o pojemności 5 mL i delikatnie przepłukano za pomocą dołączonego tłoka.

hodowla komórkowa

ludzkie monocyty CD14+ wysiewano przy gęstości komórek 2,0–3.0 × 105 komórek / mL w pożywce RPMI 1640 z 2 mM / L L-glutaminą (Life Technologies, Frederick, MD) uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicyliną (Life Technologies) i 100 mg/mL streptomycyną (Life Technologies) w 37°C w nawilżonym 5% inkubatorze CO2. W celu różnicowania komórek w makrofagi M1 zastosowano cytokiny: GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) i endotoksyna LPS (20 ng/mL). Do różnicowania makrofagów M2 stosowano cytokiny: czynnik stymulujący kolonie makrofagów (m-CSF), IL-4, IL-6 i IL-13 w stężeniu 20 ng/mL (PeproTech). modc generowano przez dodanie GM-CSF (100 ng/mL) i IL-4 (20 ng/mL). Harmonogram każdej strategii jest dalej opisany na rysunku 1.

cytometria przepływowa

makrofagi spolaryzowane i DCs hodowano przez 9 dni na naczyniach o powierzchni 10 cm2 (BD Falcon, Billerica, MA). W dniu 9 zebrano media i nieadhermetyczne komórki; komórki adhermetyczne przemyto za pomocą 1× PBS, usunięto za pomocą bufora dysocjacji komórek (technologie życia), a następnie dodano do zebranych mediów/nieadhermetycznych komórek do przemywania. Zawieszone komórki odwirowano i przemyto dwukrotnie (1× PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA), policzono, a następnie inkubowano z pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem przeciwko CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), e-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE) i cd64 (FITC) w ciemności przez 45 minut w temperaturze 4°C. fluorescencję wykryto przez sorter komórek S3TM (Bio-Rad, Hercules, ca).

test endocytozy

Spolaryzowane ludzkie makrofagi umieszczono w 4-komorowych szkiełkach szklanych (MA Nunc Lab-tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) o gęstości 3.0 × 105 komórek / mL w dniu 7 i kontynuowano hodowlę odpowiednimi cytokinami przez pozostałe 2 dni. Bisimid perylenowy (PBI-12-Man) (17) był miłym prezentem od Ke-Rang Wanga na Uniwersytecie Hebei. Komórki hodowano 10 µg / mL PBI-12-Man przez 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie przemyto 1× PBS. Ogniwa mocowano przy użyciu 70% etanolu i montowano za pomocą DAPI (P36962; Life Technologies). Aby zobrazować endocytozę PBI-12 Man, slajdy były wzbudzane i emitowane przy 585 nm. Obrazy czerwonej fluorescencji oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do skanowania slajdów metafor (MetaSystems, Boston, MA). Testy statystyczne zostały utworzone za pomocą oprogramowania MATLAB R2015A (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Przeprowadzono testy sumy rankingowej w celu sprawdzenia jednorodnej istotności statystycznej między próbkami.

immunofluorescencję

makrofagi różnicowano za pomocą wcześniej opisanych metod przez 7 dni, a następnie przenoszono do szkiełek Nunc Lab-tek II z 4-studzienkowymi szkłami szklanymi z odpowiednimi cytokinami. Komórki pozostawiono do wzrostu przez następne 7 dni; 14 dni po początkowym poszyciu, komórki mocowano za pomocą 70% etanolu i montowano za pomocą przedłużającego diamentowego środka zapobiegającego blaknięciu z DAPI. Komórki wizualizowano za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji na EVOS FL Auto (Life Technologies).

wyniki i dyskusja

strategie i warunki różnicowania monocytów CD14+ u ludzi

zaczęliśmy od oceny, które strategie były najbardziej skuteczne w produkcji jednorodnych populacji ludzkich makrofagów M1 i m2, a także modc. Ludzkie monocyty CD14+ wyizolowano i zaszczepiono na płytkach do hodowli tkankowych w celu różnicowania w makrofagi lub modki in vitro. Następnie przetestowaliśmy trzy specyficzne warunki leczenia, aby określić metodę, która dała najbardziej jednolite populacje makrofagów i moDC. W pierwszym przypadku hodowaliśmy komórki z dodatkiem tylko GM-CSF lub M-CSF przez 9 dni (ryc. 1). Warunek ten jest określany jako „tylko” (rysunek 1). Druga strategia leczenia polegała na ciągłej ekspozycji komórek na odpowiednie środowisko cytokin w dniu 0, uzupełnianiu mediów, cytokin i LPS w dniu 5 i analizie komórek w dniu 9. Warunek ten jest określany jako „ciągły” (Rysunek 1). Trzecią strategią było stymulowanie monocytów CD14 + GM-CSF lub M-CSF przez 5 dni, po czym dodano świeże pożywki zawierające LPS dla ludzkich makrofagów M1 i wszystkie cytokiny stosowane w danej grupie leczonej (GM-CSF, IFN-γ i IL-6 dla makrofagów M1 lub M-CSF, IL-4, IL-13 i IL-6 dla makrofagów m2). Ta strategia leczenia została określona jako „etapowa”(rycina 1). Leczenie monocytami CD14 + 100 ng/mL GM-CSF i IL-4 przez 5 dni i zastąpienie nośników i wszystkich cytokin w dniu 5. wygenerowało modc. Następnie modc stymulowano IL-6 i LPS przez 24 godziny przed analizą (dzień 8) w celu promowania dojrzewania i aktywacji DC. Ta metoda hodowli została określona jako „stymulowana”(ryc. 1). Modc, które nigdy nie były narażone na IL-6 i LPS, określano jako „nie stymulowane”(ryc. 1). Po 9 dniach hodowli w określonych warunkach opisanych powyżej analizowano ekspresję receptora powierzchni komórki i funkcjonalność komórki.

ekspozycja na IL-6 zwiększa skuteczność polaryzacji M2 in vitro

poprzednie badania wykazały, że ekspozycja makrofagów na cytokinę IL-6 nie tylko zaburza różnicowanie monocytów z komórki dendrytycznej na fenotyp makrofagów, ale także zwiększa profil ekspresji mRNA związany z makrofagami M2 (15,18). W celu potwierdzenia tych wyników i przetestowania wpływu IL-6 na polaryzację M1 i M2, ludzkie monocyty CD14+ w warunkach hodowli ciągłej i fazowej poddano działaniu IL-6 lub bez. Badanie ekspresji markera powierzchniowego makrofagów m2 w zróżnicowanych komórkach M1 nie wykazało znaczących zmian podczas hodowli IL-6 (fig. 2), co sugeruje, że leczenie IL-6 nie powoduje przetoczenia makrofagów spolaryzowanych M1 w kierunku fenotypu m2.

natomiast analiza ciągłych i fazowych grup hodowli makrofagów m2 wykazała, że leczenie IL-6 zwiększało ekspresję markerów powierzchni makrofagów m2. W populacjach makrofagów M2 zarówno ekspresja CD206, jak i CD36 pozostawała wysoka i wydawała się niezmieniona po wystawieniu na działanie IL-6 (fig. 2, A i B). CD163 i e-cadherin wykazały jednak znaczny wzrost poziomów ekspresji powierzchniowej i jednorodności populacji po potraktowaniu IL-6 (fig. 2, C I D). Świadczy o tym zmniejszenie pików CD163 i e-cadherin o niskiej ekspresji (czerwone strzałki na fig.2, C i D) i wynikające z tego przesunięcie w kierunku jednorodnie wysokiej ekspresji populacji.

IL-6 jest często stosowany do wywoływania dojrzewania moDC (18,19). W celu ustalenia, czy leczenie IL-6 może powodować niepożądane modc w populacjach spolaryzowanych makrofagami, badano ekspresję dojrzałego markera powierzchniowego DC (CD83). Analiza cytometryczna przepływu wykazała, że żaden z warunków hodowli M1 lub m2 nie sprzyjał znaczącemu wzrostowi ekspresji CD83 (Fig.2e). Sugeruje to, że nie było skażenia moDC w tych populacjach makrofagów lub że jakiekolwiek zanieczyszczające modc były niewrażliwe na IL-6.

stopniowa polaryzacja prowadzi do zwiększonej ekspresji kanonicznych markerów powierzchni komórek m1, m2 i moDC

aby potwierdzić, że ludzkie monocyty CD14+ zostały w pełni zróżnicowane na makrofagi lub modc do dnia 9, wykorzystano cytometrię przepływową do analizy markerów powierzchni komórek i oceny różnic morfologicznych (Fig.3, A-C). Ludzkie monocyty CD14+ różnicowano (Fig. 1) w celu oceny, która strategia daje wysoką ekspresję odpowiednich markerów powierzchniowych typu komórkowego. Badano panel markerów powierzchni komórek dla każdego z typów komórek. Nasz panel markerów powierzchni komórek M1 składał się z markerów kanonicznych CD86 i CD80 (Rysunek 3, A-C). W panelu makrofagów M2 użyliśmy CD206, CD163, CD124 (receptor IL-4-α), e-cadherin i CD36 (receptor zmiatacza klasy B) (ryc. Dla modc-ów zastosowano CD83, CD86 i CD1a. Poziomy ekspresji powierzchniowej dla wszystkich badanych markerów oznaczono dla wszystkich typów komórek (rysunek uzupełniający S1). Mediana intensywności fluorescencji (mfi) została obliczona i pokazana jako krotna zmiana w stosunku do odpowiedniej, nieutwardzonej kontroli (patrz tabele na rysunku 3).

Co ciekawe, analiza markerów powierzchni komórek m2, CD36 i IL-4RA, w makrofagach spolaryzowanych tylko przez M1 GM-CSF wykazała dramatyczny wzrost (Fig.3A). Porównując komórki leczone tylko GM-CSF ze wszystkimi grupami leczonymi M1, Grupa tylko GM-CSF wykazywała znacznie większą ekspresję CD36. Te komórki tylko GM-CSF również wyrażały niskie poziomy markerów cd86 i CD80 związanych z M1. Podobnie, stan ciągły dawał komórki, które były nie tylko niskie w CD86 i CD80, ale były również wysokie w ekspresji CD36 i IL-4RA. Z drugiej strony, gdy ludzkie monocyty CD14+ były różnicowane w Warunkach fazy M1, CD86 i CD80 były wyraźnie regulowane w górę, podczas gdy ekspresja CD36 i IL-4RA pozostawała niska. Dalsza przepływowa analiza cytometryczna ekspresji markera powierzchni komórki wykazała, że makrofagi M1 wykazywały niższą ekspresję CD206, CD36 i CD163 w stosunku do makrofagów m2 pod ekspozycją zarówno fazową, jak i ciągłą (dodatkowe figury S1 i S4). Dodatkowo, te zróżnicowane warunki hodowli generują komórki o odrębnych cechach morfologicznych i strukturze (Fig.3A). Podczas gdy komórki leczone tylko GM-CSF wydają się być większe, dane dotyczące rozproszenia w przód (FSC) ujawniły minimalne różnice w wielkości między grupami (dodatkowe figury S2 i S3). Porównanie złożoności wewnętrznej (SSC) między Warunkami leczenia wykazało wzrost ziarnistości w GM-CSF i grupach fazowych (dodatkowa figura S2). Łącznie wyniki te pokazują, że tylko GM-CSF i ciągłe leczenie dają komórki, które wyrażają niski poziom markerów M1 i wysoki poziom niektórych markerów m2, a także wykazują zmiany morfologiczne.

warunki hodowli makrofagów m2 dały nieco bardziej niejednoznaczne wyniki niż te, które stwierdzono w warunkach hodowli makrofagów M1 (Fig. 3B). W porównaniu z grupą leczoną wyłącznie m-CSF, grupy fazowane i ciągłe wykazywały zwiększone poziomy ekspresji CD206. Natomiast poziomy IL-4RA na powierzchni były znacznie wyższe w Warunkach tylko M-CSF, zarówno w trybie ciągłym, jak i fazowym. Ekspresja E-kadheryny pozostała jednakowa w poszczególnych grupach, podczas gdy CD163 był znacząco wyższy zarówno w grupie otrzymującej tylko M-CSF, jak i w grupie fazowanej. Należy zauważyć, że grupa ekspozycji ciągłej była konsekwentnie znacznie mniej jednorodna w odniesieniu do ekspresji markera powierzchni komórki. Ilustruje to rozkład bimodalny i duża zmienność poziomów ekspresji na histogramie. Dodatkowo, dramatyczne różnice morfologiczne mogą być widoczne między grupami leczenia. Opierając się na obrazach kontrastu fazowego, Grupa tylko M-CSF wytworzyła komórki, które wydają się być mniejsze i wysoce ziarniste (Fig.3B). Analiza cytometryczna przepływowa wykazuje, że komórki te mają podobną wielkość (FSC), jednak w fazowych i ciągłych warunkach leczenia obserwuje się wzrost ziarnistości komórek (rysunek uzupełniający S2). Wreszcie, deprywacja glutaminy zmieniła polaryzację M2, wykazując, że produkty przemiany materii są niezbędne w ramach tej strategii (rysunek uzupełniający S5). W sumie dane te sugerują, że Warunki fazowe dają największą wydajność polaryzacji makrofagów m2.

następnie zbadaliśmy ekspresję markerów powierzchniowych modc, które nie były stymulowane lub stymulowane IL-6 i LPS 24 h przed analizą cytometryczną przepływową. Stymulacja IL-6 i LPS skutkowała zwiększeniem ekspresji CD80, CD83 i CD86 (Fig.3C). Ekspresja powierzchni komórki dojrzałego markera DC CD83 dramatycznie wzrosła po aktywacji przy użyciu IL-6 i LPS w dniu 8 w stosunku do grupy nie stymulowanej. Potwierdziło to, że IL-6 i LPS były w stanie promować dojrzewanie komórek dendrytycznych (rysunek uzupełniający S1L). Ekspresja CD1a pozostała jednakowa między grupami nie stymulowanymi i stymulowanymi. Co ciekawe, stymulowane DCs pozostały w zawieszeniu, jednak wydaje się, że zaczynają się agregować i przylegać do siebie (rysunek 3C). Wyniki te potwierdzają wcześniejsze ustalenia dotyczące polaryzacji moDC i zapewniają dodatkową kontrolę dla analizy markerów powierzchniowych w celu identyfikacji niepożądanych populacji moDC w różnych warunkach hodowli makrofagów.

makrofagi m2 generowane przez etapową ekspozycję na cytokiny posiadają funkcje związane z M2

receptor mannozy (CD206) jest receptorem endocytarnym i recyklingowym, który jest silnie wyrażony w naszych populacjach makrofagów m2 w fazowych warunkach leczenia. Następnie chcieliśmy ocenić wychwyt endocytarny za pośrednictwem CD206 w naszych makrofagach. Oznaczono to za pomocą PBI-12-Man, biokompatybilnego środka, który fluoryzuje po wiązaniu się z receptorem mannozy (17). Po 1-godzinnym leczeniu makrofagów M1 i M2 PBI-12-Man, czerwona fluorescencja PBI-12-Man była głównie wewnątrzkomórkowa w makrofagach m2 w fazowych i ciągłych warunkach leczenia (Fig.4, A i B). Odkrycie to sugeruje, że Wiązanie powierzchni komórki z CD206 i endocytozą prowadzi do lokalizacji pęcherzykowej. Jest to zgodne z wcześniejszymi danymi z cytometrii przepływowej, które wykazały, że w fazowych warunkach leczenia makrofagi M2 wykazywały większą ekspresję CD206 na powierzchni komórki w porównaniu z populacją makrofagów M1. Co ciekawe, odkryliśmy, że komórki GM-CSF-only wykazywały wysoki poziom endocytozy PBI-12-Man (rycina 4, A i B). Koreluje to z naszymi danymi cytometrycznymi przepływowymi (Rysunek 2), które wykazały, że warunki hodowli tylko GM-CSF wytwarzają komórki M1 z ekspresją markera powierzchniowego związanego z m2. W sumie wykazujemy, że komórki te posiadały normalne cechy makrofagów i że CD206 był funkcjonalny w populacji makrofagów M2.

po 14 dniach w hodowli makrofagi M2 wykazywały również zdolność do fuzji, osiągając rozmiar ponad 200 µm i zawierając wiele jąder na komórkę (rysunek 4C). Przypominały one wielojądrowe komórki olbrzymie (Mngc), o których donoszono, że posiadają zdolności fagocytarne i inne (20). Dodatkowo, MNGCs były związane z materiałem obcym w organizmie, gruźlicą i rakiem (20-23). Ta fuzja komórkowa została znaleziona wyłącznie w populacjach makrofagów M2 i była znacznie bardziej znacząca w stanie fazowym m2. Podczas gdy grupy tylko M-CSF miały kilka komórek wielojądrzastych (Fig. 4c), ich wielkość i liczba były znacznie niższe niż grupy fazowane. Biorąc pod uwagę zdolność tych komórek do wykonywania tej funkcji związanej z makrofagami, wyniki te wskazują ponadto, że fazowe warunki hodowli wytwarzają makrofagi o wysokim stopniu M2.

tutaj opisaliśmy nasz nowo opracowany protokół phased do polaryzacji makrofagów. Odkryliśmy, że włączenie IL-6 i fazowy czas leczenia polaryzacji są absolutnie krytyczne w generowaniu makrofagów podobnych do M1 i m2 in vitro. To odkrycie zostało rygorystycznie przetestowane w porównaniu z innymi metodami polaryzacji. Z tego powodu uważamy, że stopniowa metoda polaryzacji stanowi znaczący krok naprzód. Da to naukowcom ujednolicone standardy eksperymentalne do produkcji jednorodnych populacji makrofagów do stosowania in vitro i zdolność do porównywania ich wyników. Chociaż protokół ten oferuje szereg ulepszeń w porównaniu do obecnych strategii polaryzacji, uważamy, że dodatkowe badania i optymalizacja czasów ekspozycji i koktajlu cytokin byłyby przydatne. Pomoże nam to lepiej zrozumieć złożone role makrofagów M1 i m2 w różnych formach progresji choroby i przyspieszyć rozwój nowych metod terapeutycznych.