wyniki

Identyfikacja łańcucha α receptora IL-7 (CD127) jako markera dla komórek T pamięci. Szukając nowych markerów do definiowania podzbiorów efektorowych i pamięciowych komórek T u myszy, analizowaliśmy ekspresję powierzchniową łańcucha α receptora IL-7 / CD127 (Fig. 1a). Podczas pierwotnej odpowiedzi na Lm można wyróżnić odrębne subpopulacje specyficznych dla antygenu populacji limfocytów T śledziony na podstawie poziomów ekspresji CD127. W ostrej fazie efektorowej dominują komórki o niskiej ekspresji CD127 (CD127low). Jednak podczas przechodzenia do fazy limfocytów T pamięci komórki CD127low stopniowo znikają, podczas gdy populacje wykazujące wysoki poziom ekspresji (CD127high) pozostają niezwykle stabilne pod względem wielkości w czasie (Fig. 1 a i c). Te różne wartości kinetyczne silnie sugerują, że ekspresja CD127 jest selektywną cechą komórek T pamięci długotrwałej. Podczas fazy efektorowej limfocyty T CD127low CD8 + migrują preferencyjnie do narządów niesymfoidalnych, podczas gdy w LN wykrywane są jedynie limfocyty T CD127high CD8+ (Fig. 1B). Śledziona stanowi „narząd pośredni”, w którym wszystkie różne subpopulacje znajdują się wcześnie po immunizacji (22, 23). Później w fazie pamięci, antygenowe komórki T we wszystkich narządach charakteryzują się fenotypem CD127high (Fig. 1 b I c). Porównanie zdolności CD127low i CD127high swoistych antygenowo komórek T do proliferacji w odpowiedzi na stymulację ujawniło uderzające różnice między tymi dwoma podzbiorami. Jak pokazano na Fig. 1D, oczyszczone, specyficzne dla Listerii limfocyty T CD127high namnażają się szybko po stymulacji anty-CD3, podczas gdy limfocyty T CD127low namnażają się słabo. Jest mało prawdopodobne, aby te różnice w proliferacji odzwierciedlały przewagę komórek CD127-dodatnich poprzez stymulację IL-7R za pośrednictwem Ab, ponieważ różne klony mAb o znanej aktywności aktywującej lub blokującej CD127 wykazywały ten sam efekt w krótkoterminowych testach stymulacji in vitro (dane nie pokazane).

aby bardziej bezpośrednio wykazać, że długo żyjące komórki T pamięci są obecne wyłącznie w komorze o wysokiej ekspresji CD127 na początku po szczepieniu in vivo, przeprowadziliśmy adoptywne badania transferu, stosując niedawno opracowaną odwracalną technikę multimerowego barwienia MHC (21) w celu funkcjonalnego wyizolowania komórek T specyficznych dla antygenu bezpośrednio ex vivo. Po adopcyjnym przeniesieniu komórek T specyficznych dla Cd127h91–99 od myszy zakażonych przez 10 dni Lm, przeniesione komórki były nadal wykrywalne kilka tygodni później w śledzionie myszy nieleczonych biorców (Fig. 2a), natomiast numery komórek po przeniesieniu komórek Cd127 były na granicy wykrywalności. Ta obserwacja nie była spowodowana różnicami w migracji in vivo przeniesionych komórek cd127 high I CD127low, ponieważ znaleźliśmy podobne różnice w płucach (Fig. 2a) i inne narządy (LN i wątroba, dane nie pokazane). Aby dalej wspierać interpretację, że komórki T CD127high utrzymują wyłącznie komórki pamięci specyficzne dla antygenu, myszy biorcze zostały zakwestionowane po przeniesieniu adopcyjnym z zakażeniem Listeria. Ponownie, tylko u myszy, które otrzymały limfocyty T CD127high przed zakażeniem, wykrywano szybką ekspansję przeniesionych limfocytów T specyficznych dla LLO91–99 (Fig. 2b). Ponownie, wynik ten nie był spowodowany różnicami w migracji, ponieważ utrzymanie lub ekspansja przeniesionych limfocytów T CD127low nie była wykrywalna w żadnym innym narządzie (Fig. 2b i nie pokazano danych). Chociaż te wyniki z adoptive transfer studies zdecydowanie popierają hipotezę, że komórki T pamięci długotrwałej są obecne wyłącznie w komorze limfocytów T CD127high, zaobserwowaliśmy również znaczne ograniczenia tego eksperymentalnego podejścia. W szczególności komórki T pamięci z natychmiastową funkcją efektorową wydają się być dość wrażliwe na adopcyjne eksperymenty transferowe i umierają szybko po oczyszczeniu i podaniu dożylnym; chociaż przeżywają miesiące do lat, jeśli pozostają nietknięte in vivo (11). Tak więc, chociaż nasze wyniki transferu adopcyjnego są zgodne z interpretacją, że CD127 jest markerem dla długo żyjących komórek T pamięci, nie możemy wykluczyć, że wewnętrzne problemy dotyczące przetrwania różnych subpopulacji komórek T również przyczyniają się do wyniku tych eksperymentów.

kosztowanie specyficznych dla antygenu populacji limfocytów T z CD127 i CD62L umożliwia dyskryminację subpopulacji komórek T pamięci. Dalsza charakterystyka populacji limfocytów T CD127high wykazała, że można ją podzielić na subpopulacje z ekspresją wysokiego i niskiego poziomu CD62L (Fig. 3). Bezpośrednia Analiza funkcjonalna ex vivo (21) oczyszczonych komórek T (10-12 dni po zakażeniu, gdy wszystkie subpopulacje są jednocześnie wykrywalne w śledzionie) ujawniła dalsze różnice funkcjonalne. Podczas gdy podgrupy limfocytów T CD62Llow wykazują energiczną i natychmiastową aktywność cytolityczną ex vivo, komórki T CD127high/ CD62Lhigh wykazują bardzo słabą lizę komórek docelowych pokrytych peptydem (Fig. 3). Wewnątrzkomórkowe zabarwienie cytokin w posortowanych subpopulacjach wykazało, że komórki T CD127high/CD62Llow, podobnie jak podgrupa CD127low/CD62Llow, wytwarzają efektorowe cytokiny INF-γ i czynnik martwicy nowotworu α; natomiast podgrupa CD127high/CD62Lhigh wytwarza IL-2, ale nie IFN-γ i czynnik martwicy nowotworu α. Zatem kombinacja markerów CD127 i CD62L umożliwia identyfikację subpopulacji limfocytów T o cechach bardzo podobnych do opisywanych wcześniej u ludzi. Limfocyty T CD127low/ CD62Llow wykazują wszystkie znane cechy rzeczywistej populacji limfocytów T efektorowych (TE, słaba aktywność proliferacyjna, ograniczone przeżycie in vivo i natychmiastowa funkcja efektorowa). Podzbiór CD127high / CD62Lhigh odpowiada charakterystyce TCM, a komórki T CD127high/CD62Llow pasują do opisu tem.

generowanie odrębnych subpopulacji komórek T pamięci zależy od pomocy komórek T pośredniczonych w CD40L. Ponieważ uznaliśmy, że problematyczne może być oparcie interpretacji, że ekspresja CD127 może być wykorzystana jako marker do rozróżnienia między efektorem a długowiecznymi komórkami T pamięci na doświadczeniach adoptywnego transferu komórek, postanowiliśmy przeanalizować zmutowane linie myszy z defektami w generowaniu pamięci komórek T. Jeśli CD127 jest rzeczywiście „wczesnym” markerem komórek T pamięci, powinniśmy być w stanie zidentyfikować różnice we wczesnych i późnych punktach czasowych w podgrupach cd127-dodatnich u myszy z wadami pamięci.

ponieważ ostatnie badania wykazały znaczenie pomocy limfocytów T dla generowania długotrwałych odpowiedzi pamięciowych (2-4), postanowiliśmy ustalić, czy obecność lub brak pomocy limfocytów T CD4+ podczas gruntowania limfocytów T CD8+ prowadzi do różnic w kompozycjach podgrup limfocytów T specyficznych dla antygenu wykrytych we wczesnej fazie posteffektorowej. Myszy z niedoborem MHC II, które nie mają konwencjonalnych komórek T CD4+, mają wadliwą odpowiedź pamięci CD8+, a jakość ochrony zmniejsza się z czasem (2-4). Barwienie subpopulacji komórek T 10 dni po pierwotnym zakażeniu wykazało, że podzbiór CD127high/CD62Llow jest prawie całkowicie nieobecny u myszy MHC II–/– (Fig. 4A ); Pozostałe subpopulacje występują z częstotliwością podobną do tej u myszy WT C57BL / 6. Dane te pokazują, że brak limfocytów T zapobiega efektywnemu wytwarzaniu podzbioru limfocytów T z fenotypem pamięci efektorowej, co wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla szybkiej ekspansji in vivo i funkcji efektorowej.

ponieważ ważne mechanizmy limfocytów T CD4+ wspomagają interakcję CD40 i CD40L (24-26), zbadaliśmy, czy myszy CD40L–/– wykazują fenotyp podobny do fenotypu myszy MHC II–/–. Zgodnie z innymi ostatnimi badaniami (27), myszy CD40L–/– nie wykazują różnic w obciążeniu bakteryjnym lub klirensie bakteryjnym po pierwotnym zakażeniu Listeria (dane nie pokazane) i mają prawidłową pierwotną odpowiedź limfocytów T CD8+ na subletalną dawkę Lm (Fig. 4c). Jednak ich zdolność do szybkiego oczyszczenia reinfekcji z większą dawką lm (≈10 × LD50) jest zmniejszona (rys. 4b), korelujące z zaburzeniami odpowiedzi limfocytów T pamięci CD8+ (Fig. 4C ) i znacznie zredukowany podzbiór CD127high/CD62Llow (rys. 4 e i f) we wczesnej fazie posteffektorowej. Podczas reinfekcji z listerią, proliferacja odpowiadających komórek T u myszy CD40L–/– jest równoważna z populacją komórek u myszy WT, co wskazuje, że fenotyp nie jest spowodowany ogólnym defektem zdolności proliferacyjnej komórek T pamięci (Fig. 4d), ale raczej do zmniejszonej liczby komórek T pamięci zdolnych do natychmiastowej reakcji na reencounter antygenu. Ten fenotyp został wykazany w eksperymentach znakowania in vivo, w których BrdUrd został włączony podczas całej fazy ekspansji (Fig. 4d) oraz w badaniach in vivo BrdUrd pulse–chase monitorujących utratę etykiety proliferacji (dane nie zostały przedstawione).

zmniejszona generacja podzbiorów limfocytów T z fenotypem pamięci Efektorowej wcześnie po zagruntowaniu jest przekazywana do puli limfocytów T późnej pamięci. Nasze dane pokazują, że w przypadku braku komórek T CD4+ lub CD40L, podzbiór komórek T CD127high/CD62Llow jest znacznie zredukowany wcześnie po gruntowaniu. Ponadto my (rys. 4B) i inni (3-5) wykazali, że upośledzona pomoc limfocytów T podczas gruntowania limfocytów T prowadzi do zmian w jakości odporności ochronnej w kierunku reinfekcji wirusem lm lub limfocytowego zapalenia choriomeningitis. Aby wyraźniej powiązać zaobserwowany defekt we wczesnej generacji komórek T CD127high/ CD62Llow z jakością późniejszej pamięci komórek T u tych myszy, przeanalizowaliśmy bardziej szczegółowo populacje komórek T specyficzne dla antygenu podczas fazy pamięci (5 wk po pierwotnej infekcji Listeria). W tym momencie analiza specyficznych dla antygenu komórek T musi być przeprowadzona na komórkach pochodzących z różnych tkanek ze względu na ich odmienne zachowania migracyjne. Oprócz śledziony, wybraliśmy LN jako reprezentatywną tkankę dla narządów limfatycznych i płuca jako typowy obwodowy, niesymfoidalny przedział. W tym momencie, antygen specyficzne komórki T w tych organach są prawie wszystkie CD127high (Fig . 1b); komórki w płucach to CD62Llow (dane nie pokazane), podczas gdy większość komórek T pamięci specyficznych dla antygenu w LN to CD62Lhigh (Fig. 5b). Aby określić liczbę komórek T pamięci specyficznych dla antygenu z wyraźną natychmiastową funkcją efektorową w różnych narządach, wykonaliśmy wewnątrzkomórkowe zabarwienie cytokin dla IFN-γ. Jak pokazano na Fig. 5A, myszy CD40L–/– charakteryzują się znacznie zmniejszoną liczbą limfocytów T pamięci specyficznych dla antygenu z natychmiastową funkcją efektorową w porównaniu z myszami WT. Wynik ten jest prawdziwy na poziomie częstotliwości (procent) w przedziale limfocytów T CD8+ i w liczbach bezwzględnych (rys. 5A). Jednak TETRAMEROWE barwienie MHC limfocytów pochodzących z LN (rys. 5B) ujawnił prawie identyczną liczbę swoistych antygenowo komórek T O WYSOKIM fenotypie CD62Lhigh. Niektóre limfocyty T specyficzne dla antygenu CD62Llow są również wykrywalne w LNS myszy WT, korelując z częstotliwością komórek wytwarzających IFN-γ (Fig. 5A). Populacja ta jest zasadniczo nieobecna w LNS myszy CD40L–/–; cały podzbiór CD8+/ CD62Llow jest zredukowany u myszy CD40L -/ -, co sugeruje ogólny defekt w generowaniu tego podzbioru limfocytów T. Podsumowując, nasze dane pokazują, że brak zależnych od CD40L limfocytów T pomaga w okresie gruntowania powoduje różnice ilościowe w subpopulacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu, przy znacznie zmniejszonej liczbie komórek wykazujących fenotyp pamięci efektorowej (CD127high/CD62Llow). Te ilościowe różnice w komórkach z natychmiastową wczesną funkcją efektorową są przenoszone do fazy pamięci i wpływają na jakość odporności ochronnej.