ze względu na znaczenie P-TEFb, należy zachować regulację, aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie. Fosforylacja i defosforylacja określonych miejsc na CDK9 musi następować przez cały proces transkrypcji i musi być ściśle kontrolowana. Niniejszy przegląd koncentruje się na regulacji CDK9 poprzez modyfikacje fosforylacji.

3. Skład P-TEFb i jego rola w aktywacji transkrypcji HIV-1

P-TEFb jest heterodimerem składającym się z zależnej od cyklin kinazy 9 (CDK9) i jednej z cyklin Typu C T1, T2a lub T2b, której cyklina T1 jest najliczniejszym partnerem . Cyklina K, która pierwotnie była uważana za niewielką cyklinę cdk9, jest obecnie uznawana za partnera cyklin dla CDK12 i CDK13 . Tylko białko cykliny T1 skutecznie tworzy kompleks z Tat HIV-1 związany ze smołowym RNA . Wynika to z obecności pozostałości cysteiny w cyklinie T1 w pozycji 261, a nie asparaginy znajdującej się w białkach cykliny T2A i T2B. Cyklina T1 z zmutowanym Cys-261 wiąże się z Tat, ale nie jest w stanie zrekrutować Tat do TAR RNA. Interakcja Tat z TAR RNA i cykliną T1 jest zależna od jonów cynku, co ponownie wymaga obecności Cys-261 .

istnieją dwie funkcjonalne izoformy CDK9: forma 42 kDa wyrażana głównie w śledzionie, grasicy i jądrach oraz forma 55 kDa wyrażana w różnych tkankach, ale na znacznie niższych poziomach, czyli izoforma 42 Kd . Wszystkie cykliny wiążą się z obydwoma izoformami CDK9 i wykazują aktywność kinazy w kierunku CTD w RNAPII . Mniej więcej połowa P-TEFb znajduje się w nieaktywnym dużym kompleksie związanym przez 7SK snRNA i kilka dodatkowych białek , w tym białko indukowane heksametyleno-bisacetamidem 1 (HEXIM1), białko LARP7 związane z La i enzym mepce zamykający metylofosfatazę . Postać P-tefb o niższej masie cząsteczkowej składa się z CDK9 i cykliny T1 i jest aktywna enzymatycznie . P – tefb o dużej masie cząsteczkowej jest nieaktywny z powodu HEKSYM1, który wprowadza swoją hamującą sekwencję PYNT do aktywnego miejsca CDK9 .

Kompleks P-tefb o dużej masie cząsteczkowej służy jako źródło CDK9 / cyklina T1 do rekrutacji przez HIV-1 Tat . W komórkach wywołanych stresem kompleks CDK9/cyklina T1 dysocjuje z białka 7 SK RNA / HEKSYM1, a następnie wiąże się z BRD4 i tworzy aktywny transkrypcyjnie mały kompleks, który jest rekrutowany do różnych promotorów komórkowych . Pomimo braku aktywności dużego kompleksu P-TEFb in vitro, duży kompleks, a nie mały kompleks, jest ważny dla aktywacji transkrypcji HIV-1 jako HIV-1. Tat konkuruje z HEKSYM1 o wiązanie z cykliną T1, promując dysocjację P-TEFb z dużego kompleksu . Wykazano również, że białko TAT HIV-1 rekrutuje duży kompleks P-TEFb do promotora HIV-1, Gdzie TAR RNA był w stanie wyprzeć 7 SK RNA i aktywować P-TEFb .

Tat ułatwia również tworzenie kompleksu Super elongacyjnego (sec) zawierającego aktywny P-TEFb oraz dodatkowe czynniki elongacyjne i koaktywatory transkrypcji . Czynniki te obejmują AFF4, ENL, AF9 i współczynnik wydłużenia ELL2 . Białko AFF4 wyłania się jako centralne rusztowanie, które rekrutuje inne czynniki poprzez bezpośrednie interakcje. AFF4 wiąże cyklinę T1, ELL2 i ENL lub AF9 działając jako most łączący ten kompleks z P-TEFb . Poprzez funkcje pomostowe Tat i AFF4, P-TEFb i ELL2 łączą się tworząc dwufunkcyjny kompleks elongacyjny, który znacznie aktywuje transkrypcję HIV – 1 . Bez Tat, AFF4 może pośredniczyć w interakcji ELL2-P-TEFb, choć nieefektywnie. Tat pokonuje to ograniczenie, wprowadzając więcej ELL2 do P-TEFb i stabilizując ELL2 w procesie, który wymaga aktywnego P-TEFb .

4. Fosforylacja CDK9

aktywność P-TEFb jest zależna od fosforylacji kilku reszt seryny i treoniny i omówimy to poniżej i które są pokazane w modelu CDK9/cyklina T1 / Tat na fig.2.

Rysunek 2

struktura kompleksu CDK9/cyclin T1/Tat (model oparty na PDB 3MIA). Reprezentacja szkieletowa reszt CDK9 obecnych w pierwotnej strukturze PDB jest pokazana w kolorze zielonym, cyklina T1—w Kolorze Fioletowym, a tat-w kolorze czerwonym. Pozycja klastra Thr-29, Ser-175, Thr-186 I C-terminal Ser/Thr jest wskazana. Wykazano również miejsce wiązania ATP i jony ZN, które ułatwiają interakcję Tat-cyklina T1.

4.1. Fosforylacja C-końcowego CDK9

klaster C-końcowych reszt CDK9 (Ser-347, Ser-353 i Ser-357; Thr-350 i Thr-354) jest autofosforylowany i fosforylacja ta jest ważna dla wiązania CDK9/cyklina T1 do TAR RNA . Udowodniono to niezdolnością enzymatycznie aktywnego C-terminalnie ściętego CDK9 do wiązania TAR RNA . Rekombinowana CDK9 / cyklina T1, która była autofosforylowana in vitro, była skutecznie dephoshorylowana przez białkową fosfatazę 2A (PP2A), ale nie przez białkową fosfatazę-1 (PP1). Również leczenie PP2A zapobiegało wiązaniu CDK9 / cyklina T1 z Tat i smołowym RNA in vitro . Obserwacje te sugerowały, że PP2A może celować w C-koniec CDK9 i potencjalnie kontrolować interakcję P-TEFb z TAR RNA. Autofosforylacja CDK9 związana z kompleksem preinicjacyjnym in vitro była hamowana przez TFIIH . PP2A został później uznany za niezbędny do podstawnej transkrypcji HIV-1 in vitro, ponieważ zubożenie PP2A hamowało podstawną transkrypcję HIV-1, A dodanie PP2A do zubożonych ekstraktów przywróciło transkrypcję . Uważano, że celem PP2A jest Thr-29 (patrz poniżej), ale nie udowodniono tego z całą pewnością i efekt nie został odtworzony in vivo. We wczesnym badaniu obserwowaliśmy łagodną indukcję podstawowej, ale nie indukowanej Tat transkrypcji HIV-1 przez hamujące PP2A niskie stężenia kwasu okadainowego . Zaobserwowaliśmy również indukcję podstawowej, a nie aktywowanej Tat transkrypcji HIV-1 z nadekspresją białka LIS1, które wiązało się i hamowało PP2A in vitro i wchodziło w interakcje z białkiem TAT HIV-1 . Łącznie badania te wskazują, że PP2A może regulować podstawową transkrypcję HIV-1, a także kontrolować interakcję P-TEFb z TAR RNA przez defosforylację C-końca CDK9.

4.2. Wykazano, że N-końcowa fosforylacja Thr-29

fosforylacja THR-29 CDK9 jest indukowana przez białko podatkowe HTLV-1 . CDK9 / cyklina T1 jest rekrutowana do chromatynizowanego HIV-1 LTR i innych promotorów przez BRD4 . Ta Rekrutacja BRD4 była związana z fosforylacją CDK9 Thr-29 i wymogiem defosforylacji PP2A przez grupę Johna Brady ’ ego . Jednak Grupa Qiang Zhou poinformowała , że CDK9 musi być fosforylowany na Ser-175 w celu związania się z BRD4, co zostało niedawno potwierdzone przez grupę Jonathana Karna (patrz szczegółowa dyskusja poniżej). THR-29 CDK9 jest homologiczny do Thr-15 na CDK2, w którym fosforylacja hamuje aktywność CDK2 . Wykazano, że fosforylacja Thr-29 hamuje aktywność CDK9 i transkrypcję HIV-1 . Nie udało się jednak wykryć fosforylacji CDK9 Thr-29 w komórkach leczonych kwasem okadainowym, który hamował zarówno PP2A, jak i PP1, stosując kombinację elektroforezy cienkowarstwowej Hunter 2D i spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości, która wykazała tylko fosforylację C-końcowego klastra Ser/Thr i Ser-175, z których tylko fosforylację Ser-175 indukowano kwasem okadainowym . Tak więc fosforylacja CDK9 Thr-29 może nie być kontrolowana przez PP2A i wymaga dalszej walidacji w celu wyjaśnienia jej roli podczas transkrypcji HIV-1.

4.3.

Pętla T CDK9 zawiera kilka miejsc fosforylacji, w tym Ser-175 i Thr-186 (fig.2). Fosforylacja konserwowanego Thr-186 jest niezbędna do aktywności enzymatycznej CDK9 . Również skojarzenie CDK9 / cyklina T1 z 7SK RNA snRNP wymaga fosforylacji CDK9 Thr – 186 . W CDKs fosforylacja pętli T wyzwala główne zmiany konformacyjne, które otwierają kieszeń wiążącą ATP i miejsce wiązania substratu, dzięki czemu CDKs jest w pełni aktywna jako kinaza .

Ostatnio, analiza chemiczno-genetyczna z wykorzystaniem selektywnego chemicznego hamowania CDK7 wykazała, że jest on wyłącznie odpowiedzialny za fosforylację CDK9 Thr-186 i zależną od P-TEFb fosforylację CTD Ser-2 i ubikwitylację histonu H2B in vivo . Tak więc CDK7 / cyklina H, która wcześniej została zidentyfikowana jako kinaza aktywująca CDK (Cak) dla CDK zaangażowanych w cykl komórkowy, takich jak CDK1, 2 i 4, działa również jako CAK dla CDK zaangażowanych w regulację transkrypcji, które obejmują CDK8, 9, 12 i 13 (recenzja w ). Global analysis of kinases that may phosphorylate CDK9 t-loop using siRNA identified Ca (2+) / calmodulin-dependent kinase 1D (CaMK1D) knock down by siRNA decreased thr-186 phosphorylation . W związku z tym, małocząsteczkowe hamowanie szlaku sygnałowego Ca(2+) zmniejszało fosforylację Thr-186 i hamowało indukowaną Tat transkrypcję HIV-1, ale nie transkrypcję HTLV-1 . Ponieważ transkrypcja zależna od podatku jest napędzana przez P-TEFb, pozostaje do dalszego zbadania, dlaczego tylko transkrypcja HIV-1 została naruszona.

fosforylacja CDK9 Thr-186 może być również kontrolowana przez fosfatazy komórkowe. Nasze badania przez ostatnią dekadę koncentrowały się na PP1, który początkowo obserwowaliśmy w celu stymulowania zależnej od Tat transkrypcji HIV – 1 in vitro . Kiedy nadekspresowaliśmy jedną z głównych jądrowych podjednostek regulacyjnych PP1, nipp1 (nuklearny inhibitor PP1), zaobserwowaliśmy specyficzne dla PP1 hamowanie transkrypcji HIV-1 i replikacji wirusa . Zauważyliśmy, że Tat zawiera sekwencję podobną do zachowanego motywu RVxF wiążącego PP1 i wykazaliśmy, że motyw ten pośredniczy w wiązaniu TAT z PP1 in vitro i In vivo oraz że mutacja reszt w motywie wiążącym PP1 (V36A i F38A) uniemożliwiła Tat indukowanie transkrypcji HIV-1 . CDK9, który został fosforylowany w hodowanych komórkach z dodatkiem ortofosforanu (32P) i potraktowany kwasem okadainowym, był skutecznie depofosforylowany in vitro przez PP1, ale nie przez PP2A, w przeciwieństwie do autofosforylowanego in vitro CDK9, który był defosforylowany przez PP2A, a nie przez PP1 . Wyniki te sugerują, że PP1 może kontrolować fosforylację CDK9 podczas transkrypcji HIV-1. Rzeczywiście, Wykazano, że podjednostka Alfa katalityczna PP1, PP1a, działa wspólnie i sekwencyjnie z fosfatazą białkową (Ca2+)-kalmoduliną 2B (PP2B) w komórkach napromieniowanych promieniowaniem UV lub leczonych heksametylenobisacetamidem (HMBA), w których P-TEFb jest uwalniany z kompleksu 7SK snRNP . Podczas gdy PP2B indukuje zmianę konformacyjną w 7SK snRNP, PP1a defosforyluje CDK9 Thr-186 i ułatwia uwalnianie P-TEFb z 7SK snRNP . CDK9 pozostał defosforylowany podczas skojarzonego z BRD4 i został zrekrutowany do kompleksu preinicjacyjnego, gdzie może być reaktywowany przez związany z TFIIH CDK7. Zgodnie z tym badaniem obserwowaliśmy zwiększoną fosforylację CDK9 Thr – 186 w komórkach, które stabilnie wyrażały peptyd hamujący PP1, centralną domenę NIPP1, a także obserwowaliśmy zwiększony związek CDK9/cyklina T1 z 7SK RNA . Stabilna ekspresja cdNIPP1 zakłóciła interakcję między Tat i PP1 i hamowała transkrypcję HIV-1, co sugeruje, że należy zachować równowagę między fosforylacją a defosforylacją CDK9 Thr-186 i że przesunięcie tej równowagi w kierunku fosforylacji jest hamujące transkrypcję HIV-1. Ekspresja cdNIPP1 w fizjologicznie istotny sposób jako część genomu HIV-1 zamiast NEF silnie hamującej replikację HIV-1 , co dodatkowo sugeruje, że inhibitory ukierunkowane na PP1 mogą być stosowane jako potencjalne leki anty-HIV-1. Podczas gdy PP1 jest kandydatem do defosforylacji Thr-186, odkryliśmy również, że defosforyluje Cdk9 Ser-175 (patrz poniżej). Dodatkową fosfatazę CDK9 Thr-186, zależną od magnezu białkową fosfatazę 1A (dawniej 2C) (PPM1A) zidentyfikowano za pomocą biblioteki ekspresji fosfatazy i przeciwciał thr-186-fosfospecyficznych . Nadekspresja PPM1A zmniejszyła fosforylację Thr – 186, a zubożenie za pośrednictwem siRNA zwiększyło ją, a p-TEFb i PPM1A również współwystępowały razem, co sugeruje, że CDK9 może być fizjologicznym substratem dla PPM1A . Nowsze badanie wykazało, że fosforylacja CDK9 Thr-186 zmniejsza się w spoczynkowych limfocytach T CD4 (+), które nie dopuszczają do replikacji HIV-1 i że spadek ten koreluje z obfitością PPM1A i ograniczoną rekrutacją CDK9 do dużego kompleksu P-TEFb . To odkrycie dodatkowo potwierdza konieczność dużego kompleksu dla transkrypcji HIV-1 i krytyczną rolę PPM1A w supresji HIV-1 w spoczynkowych komórkach T. Ponieważ ekspresja PPM1A nie została zmieniona po aktywacji komórek T, jeszcze nieznane czynniki regulacyjne mogą być zaangażowane w regulację aktywności PPM1A.

4.4. Fosforylacja Ser-175 W pętli T CDK9

Gdy CDK9/cyklina T1 dysocjuje z dużego kompleksu P-TEFb, CDK9 może zostać fosforylowany na Ser-175. Podczas gdy defosforylacja Thr – 186 całkowicie hamowała aktywność kinazy CDK9/cyklina T1, David Price i współpracownicy nie wykryli żadnej różnicy w aktywności kinazy mutantów CDK9 s175a i CDK9 S175D . Natomiast Qiang Zhou i jego grupa wykazali, że mutant CDK9 S175A był nieaktywny, podczas gdy mutant CDK9 s175d był aktywny jako kinaza . Wykazano również, że fosforylacja Ser-175 promuje wiązanie CDK9/cyklina T1 do Brd4 . Zasugerowano, że fosforylacja Ser-175 może spowodować zmianę konformacyjną w CDK9, umożliwiając brd4 związanie się z cykliną T1 . W naszych ostatnich badaniach odkryliśmy, że dynamiczne hamowanie PP1 doprowadziło do wyłącznej fosforylacji CDK9 Ser – 175, określonej przez kombinację mapowania peptydów Hunter 2D i analizy LC-MS in vivo. Hamowanie PP1 prowadziło do hamowania aktywności CDK9 i zmniejszenia fosforylacji RNAPII in vitro i In vivo . Odkryliśmy, że mutant CDK9 S175A był aktywny enzymatycznie i indukował transkrypcję HIV-1 . Co ciekawe, podczas gdy mutant CDK9 s175d był mniej aktywny jako kinaza, łatwiej tworzył mały kompleks P-TEFb, zwłaszcza gdy hamowano PP1. W ten sposób doszliśmy do wniosku, że PP1 aktywuje transkrypcję HIV-1 przez defosforylowanie reszty ser-175 CDK9. Zauważyliśmy również, że aktywność fosforylacji Ser-175 była znacznie bardziej obfita niż aktywność Thr-186 w ekstraktach komórkowych, co sugeruje, że aktywność CDK9 może być naturalnie tłumiona przez nadfosforylację Ser-175. Ostatnie badania przeprowadzone przez grupę Jonathana Karna wykazały, że aktywacja komórek T przez receptor komórek T (TCR) lub ester forbolu (PMA) sygnalizuje silnie indukowaną fosforylację Ser-175 CDK9 . W oparciu o modelowanie molekularne zaproponowano, że fosforylowany Ser-175 tworzy wiązanie wodorowe z Tat Lys-14 wzmacniając Wiązanie Tat z CDK9/cykliną T1 i promując aktywację transkrypcji HIV-1 . Również zgodnie z wczesnymi obserwacjami stwierdzono, że mutacja CDK9 S175A znosi wiązanie z BRD4 . Zgodnie z naszymi obserwacjami stwierdzono również, że mutant CDK9 S175A w znacznym stopniu indukuje zależną od Tat utajoną reaktywację HIV-1, którą Jonathan Karn i jego współpracownicy przypisali niezdolności tego mutanta do wiązania BRD4, będąc jednocześnie w stanie wiązać się z Tat . Odkryli również, że cdk9 fosforylowany w Ser-175 jest wykluczony z kompleksu 7SK RNP, co jest zbieżne z naszą wcześniejszą obserwacją, że Mutant fosfomimetyczny CDK9 S175D został znaleziony w małym kompleksie P-TEFb . Tak więc, to ostatnie badanie wskazuje Ser-175 jako ważny cel dla reaktywacji HIV-1 i potencjalnego rozwoju terapii małocząsteczkowych.

niedawno opracowaliśmy małe cząsteczki ukierunkowane na PP1, które zostały zaprojektowane tak, aby pasowały do wnęki mieszczącej rvxf na PP1 . Zbadaliśmy praktycznie około 300 000 związków, a następnie fizycznie około 1000 związków i zidentyfikowaliśmy jeden związek, 1H4, który hamował transkrypcję i replikację HIV-1 w stężeniach nietoksycznych . 1H4 zapobiegała defosforylacji peptydu substratowego zawierającego sekwencję rvxf w warunkach in vitro za pośrednictwem PP1, zakłócała skojarzenie PP1 z Tat w hodowanych komórkach i zapobiegała translokacji PP1 do jądra. Obecnie jesteśmy w trakcie rafinacji związku hit, a także opracowywania związków ukierunkowanych na PP1 do aktywacji utajonego prowirusa.

4.5. Fosforylacja Ser-90 CDK9

my i inni wykazaliśmy wcześniej, że transkrypcja HIV-1 jest aktywowana przez Tat w fazie G1, ale nie w fazie G2 . Dlatego postawiliśmy hipotezę, że Tat może angażować kinazę regulatorową cyklu komórkowego, którą wykazaliśmy jako CDK2 / cyklina E . HIV-1 jest hamowany w komórkach knockdown CDK2 , a także w różnicowaniu makrofagów z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi z knockdown CDK2, co sugeruje, że CDK2 jest ważny dla transkrypcji i replikacji HIV-1. Związek czynnościowy pomiędzy CDK2 i CDK9 stwierdzono podczas analizy hamowania HIV-1 przez chelatory żelaza. Transkrypcję HIV-1 hamowano w komórkach T leczonych chelatorami żelaza 311 i ICL670, co również hamowało aktywność komórkową CDK2 i CDK9 . Silniejsze chelatory żelaza tridentatu na bazie di-2-pirydyloketonu hamowały transkrypcję HIV-1 i replikację wirusa przy znacznie niższych stężeniach niż 311 lub ILC670, a także hamowały aktywność CDK2 i CDK9 . Chociaż mechanizm hamowania CDK2 nie został jeszcze wyjaśniony, prawdopodobnie obejmie on indukcję p21 poprzez zwiększenie regulacji czynnika 1 indukowanego hipoksją (HIF-1), ponieważ niedobór żelaza usuwa żelazo z hydroksylazy prolilowej i zwiększa poziomy białek HIF-1 i HIF-2 naśladując efekt niedotlenienia . Przeanalizowaliśmy fosforylację CDK9 przez CDK2 in vitro i zidentyfikowaliśmy motyw (90spynr94), który reprezentował miejsce fosforylacji cdk2 i który był skutecznie fosforylowany . Fosforylację CDK9 na Ser – 90 wykryto przeciwciałami fosfospecyficznymi i zmniejszono po odrzuceniu CDK2. Zmutowany związek CDK9 s90a z dużym kompleksem P-TEFb został zredukowany, a jego nadekspresja hamowała transkrypcję HIV-1. Natomiast mutant CDK9 s90d wykazywał niezmieniony związek z dużymi i małymi kompleksami P-TEFb i indukowaną zależną od Tat transkrypcją HIV-1. Jednakże fosfomimetyczny S90 wykazał ogólny spadek ekspresji CDK9, co sugeruje, że należy utrzymać równowagę fosforylacji/defosforylacji w celu utworzenia dużych i małych kompleksów P-TEFb. Modelowanie molekularne wykazało, że Ser-90 CDK9 znajduje się na elastycznej pętli wystawionej na działanie rozpuszczalnika, co sugeruje, że może być poddawany fosforylacji (również na fig. Tak więc nasze ostatnie badania zidentyfikowały nowe regulatorowe miejsce fosforylacji na CDK9, które może być ukierunkowane na aktywację lub hamowanie transkrypcji HIV-1.

5. Wniosek

fosforylacja i defosforylacja określonych miejsc na CDK9 zachodzi w całym procesie transkrypcji i musi być ściśle kontrolowana. Modyfikacje niektórych reszt treoniny / seryny określają, czy CDK9 wiąże się z dużym kompleksem P-TEFb, aby stać się dostępnym do rekrutacji i czy dysocjacja dużego kompleksu będzie efektywnie następować. Fosforylacja Thr – 186 w pętli T CDK9 i Ser-90, która znajduje się poza pętlą t, określa, czy CDK9 pozostaje sekwestrowany w nieaktywnym dużym kompleksie, a także czy kinaza jest aktywna enzymatycznie po dysocjacji z 7SK snRNP. Defosforylacja w którymś z tych miejsc prowadzi do destabilizacji dużego kompleksu i uwolnienia CDK9 / cykliny T1, ograniczając tym samym rekrutację Tat do HIV-1 LTR. Modyfikacje C-końca CDK9 pozwalają na Wiązanie cyklin T1: TAR, A defosforylacja w tych miejscach uniemożliwia Wiązanie toTAR RNA. Natomiast fosforylacja przy reszt Thr-29 lub Ser-175 hamuje CDK9. Tak więc pojawiający się obraz regulacji CDK9 przez fosforylację wydaje się być złożony i częściowo równoległy do tego, co jest znane dla innych CDK. Niedawno zidentyfikowane kinazy ukierunkowane na CDK9, CDK7, CDK2 i fosfatazy, PP1 i PPM1A prawdopodobnie pojawią się jako nowe cele dla anty-HIV-1 i leków przeciwnowotworowych.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

podziękowania

Ten projekt był wspierany przez District Of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2g12rr003048 z programu Research Centers in Minority Institutions (Rcmi) (Division of Research Infrastructure, National Center for Research Resources, NIH), rosyjską Fundację Badań Podstawowych (no. 12-04-91444-NIZ) oraz rosyjskie Ministerstwo Edukacji i Nauki (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). Autorzy chcieliby również podziękować członkom Nekhai lab za sugestie i przeprosić za tych, których praca nie została cytowana z powodu braku miejsca.