Systemic agonistic cancer immunotherapy induces differential expansion of CD4 i CD8 limfocyty T w limfoidach i narządach obwodowych

wykazano, że połączenie anty-CD40 z IL-2 indukuje opóźniony wzrost i regresję na kilku mysich modele nowotworów . Podobnie jak w przypadku opublikowanych danych wykorzystujących modele guza linii komórkowej, leczenie śródnabłonkowej neoplazji sutka-przerost (MIN-O), linii przeszczepu tkanki, z zastosowaniem immunoterapii anty-CD40 i IL-2 (it) doprowadziło do znaczącej odpowiedzi przeciwnowotworowej (P = 0,0057), w tym regresji u >50% leczonych myszy (dodatkowy plik 1: Rysunek S1A). Wcześniejsze badania wykazały, że te odpowiedzi przeciwnowotworowe są spowodowane komórkami T CD8, dlatego oceniliśmy fenotyp komórek T w śledzionie, a także w obrębie guza i płuc (wspólne miejsce przerzutów dla wielu różnych modeli nowotworów). Podczas gdy zauważyliśmy, że terapia zazwyczaj indukuje ekspansję CD8 we wszystkich narządach, zauważyliśmy pewne różnice w fenotypie pamięci limfocytów T CD8 w różnych miejscach narządowych (dodatkowy plik 1: Rysunek S1B-C).

my i inni wcześniej wykazaliśmy, że silne terapie immunostymulujące raka indukują silną proliferację komórek T pamięci (CD44high) CD4 i CD8 w śledzionie i węzłach chłonnych . Zaobserwowano również, że limfocyty T CD4, ale nie CD8, również ulegają aktywacji wywołanej śmiercią komórek w sposób zależny od interferonu (IFN) – γ, co prowadzi do nieznacznej ogólnej ekspansji limfocytów T CD4 o liczbę w tych samych narządach w porównaniu do wartości wyjściowych . Dane te zostały wygenerowane za pomocą odczytów narządów limfatycznych. Jednakże, w świetle fenotypów obserwowanych w łożysku MIN-O, myszy leczonych immunoterapią, ekspansja, aktywacja i apoptoza aktywowanych komórek T mogą mieć różny wpływ w tkankach obwodowych. W związku z tym staraliśmy się dalej scharakteryzować i porównać aktywację limfocytów T w narządach obwodowych (gdzie może znajdować się pierwotny guz i/lub zmiany przerzutowe) i drugorzędowych narządach limfatycznych (które są często badane podczas badań immunoterapeutycznych w celu oceny mechanizmów działania). Oceniano częstość występowania, ekspansję i apoptozę limfocytów T CD8 i CD4 (Foxp3neg) w układzie limfatycznym i obwodowym. Zgodne z wcześniejszymi raportami naszej grupy, nie zmieniając jednak znacząco ich ogólnej częstotliwości (rys. 1A), immunoterapia anty-CD40 / IL-2 powodowała znaczne rozszerzenie całkowitej liczby limfocytów T CD8 w śledzionach i węzłach chłonnych (Fig. 1B). W związku ze zwiększeniem całkowitej liczby CD8, częstość występowania limfocytów T CD8 zawierających bromodeoksyurydynę (BrdU) in vivo była znacząco rozszerzona, a odsetek komórek apoptotycznych ocenianych za pomocą zewnątrzkomórkowej ekspresji Aneksyny V nie różnił się znacząco od grupy kontrolnej (Fig. Natomiast całkowita częstość limfocytów T CD4 zmniejszyła się, a ich liczba nie zmieniła się znacząco w porównaniu z grupami kontrolnymi w obrębie tych samych narządów (Fig. 1a-b). Podczas gdy limfocyty T CD4 rozwijały się, jak oceniano przez włączenie BrdU, znaczna część z nich również przechodziła apoptozę (Fig. 1c-d) powodujące nieznaczną zmianę liczby całkowitej netto. Dane te były zgodne z obserwowanymi wcześniej . Kiedy ocenialiśmy nie-limfatyczne narządy, w tym płuca i wątrobę, widzieliśmy podobne tendencje zarówno w limfocytach T CD4, jak i CD8, a mianowicie, że limfocyty T CD8 rozszerzały się i przeżywały we wszystkich następujących po nich organach (Fig. 2A-b) podczas gdy komórki T CD4 (Foxp3neg) rozszerzały się i jednocześnie w podobnym stopniu przechodziły apoptozę, powodując nieznaczne zmiany zarówno częstości, jak i liczby (Fig. 2c-d) na peryferiach.

fenotypy pamięci limfatycznej różnią się między drugorzędowymi narządami limfatycznymi a obwodowymi tkankami nie-limfatycznymi w komórkach T CD8, ale nie w następujących po nich komórkach T CD4

u myszy komórki T CD4 i CD8 można dalej sklasyfikować do fenotypów pamięci i naiwnych na podstawie ekspresji CD62L (l-selektyny) i CD44 z populacją cd44lowcd62l+ uważaną za naiwną (TN), populacją cd44highcd62l+ za pamięć centralną (TCM), a populacją cd44highcd62lneg za pamięć efektorową i/lub efektorową (te/EM). Wiadomo, że limfocyty T CD4 i CD8 różnią się rozkładem tych podgrup w narządach limfatycznych i obwodowych. Podczas gdy dotychczas nieleczona częstość występowania w populacjach CD4 i CD8 pozostaje stosunkowo podobna, populacja CD44high jest bardziej zniekształcona w pamięci centralnej w komórkach T CD8 i zniekształcona w pamięci efektorowej w komórkach T CD4 w spoczynkowym organizmie . Jednakże w narządach obwodowych komórki T będące rezydentami tkanek w podgrupach limfocytów T CD4 i CD8 są głównie fenotypem pamięci efektorowej .

poprzednie badania wykazały, że komórki fenotypu pamięci (CD44high) są głównym typem komórek rozwijającym się po immunoterapii stymulacyjnej . Aby lepiej zrozumieć skład limfocytów T CD4 i CD8 w różnych narządach, oceniliśmy ich fenotyp pamięci w każdym kolejnym narządzie. W stanie spoczynku populacja CD44high z limfocytami T CD8 w narządach limfatycznych była głównie TCM (>90%), podczas gdy w narządach obwodowych była to kombinacja z ~60% TCM (Fig. 3a, c, e, – f). Ogólnie rzecz biorąc, powoduje to ogólną ekspansję w wysokiej częstotliwości CD44 we wszystkich narządach. Częstość występowania TCM była niezmieniona lub nieznacznie zwiększona, podczas gdy populacje TE / EM znacznie się rozszerzyły (Fig. 3e-f) od ~10% do 30% w narządach limfatycznych i, imponująco, od ~ 30-85% w narządach obwodowych.

w populacji CD44high komórek T CD4, spoczynkowe myszy były bardziej przekrzywione w kierunku fenotypu TE / EM z około 60-70% w limfoidach i 75-95% w tkankach obwodowych (Fig. 3b, d). Jak to miało miejsce w komórkach T CD8, po nim wysoki odsetek CD44 rozszerzał się, ale ze względu na fakt, że był tak mocno przekrzywiony do fenotypu TE/EM we wszystkich narządach u myszy spoczynkowych, częstotliwości CD4 TE/EM były w dużej mierze spójne we wszystkich narządach u myszy leczonych IT (Fig. 3e). Częstotliwości TCM CD4 pozostały stosunkowo niskie i spójne we wszystkich narządach, zarówno przed, jak i po nim (Fig. 3f).

ekspresja markerów aktywacyjnych w komórkach T CD4 i CD8 zależy od lokalizacji i fenotypu pamięci

oprócz różnic w proliferacji i apoptozie, rutynowo zauważyliśmy również, że komórki T CD4 i CD8 różnią się w górę regulują aktywację i cząsteczki hamujące po niej. Najbardziej godnym uwagi przykładem jest PD-1, który, w oparciu o badania skupiające się na drugorzędowych narządach limfatycznych (śledzionie i LN), był preferencyjnie regulowany na limfocytach T CD4, a nie CD8 i prawdopodobnie brał udział w preferencyjnym procesie AICD, który występował w limfocytach T CD4, ale nie CD8 po nim . Innym przykładem może być preferencyjna Regulacja nkg2d na limfocytach T CD8, ale nie na CD4 nadających zdolność lityczną wywołaną przez obserwatora po silnej ekspozycji cytokin na podzbiór pamięci CD8. Wcześniejsze badania naszego laboratorium oraz dane przedstawione na Rys. 3 wykazały, że zarówno wśród komórek T CD4, jak i CD8, głównymi komórkami, które aktywnie proliferują i reagują na nie, są komórki fenotypu pamięci CD44high. Dlatego następnie skupiliśmy się na tej populacji.

w populacji CD44high wykazano, że proliferacyjne limfocyty T CD8 nie regulują markerów zgodnych z aktywacją przez bodziec specyficzny dla antygenu, taki jak CD25 i PD-1, ale regulują markery, które pozwalają im na nabycie fenotypu obserwatora, a mianowicie NKG2D, nadając im zdolność do działania w bardziej podobny do NK, nieograniczony sposób antygenu. I odwrotnie, komórki T cd44high proliferujące (Foxp3neg) CD4 nieproporcjonalnie zwiększają PD-1 (w przeciwieństwie do komórek T CD8 i FOXP3+, regulatorowych komórek T CD4), które sugerowaliśmy, pozwala im być preferencyjnie ukierunkowane do indukcji apoptozy . Zgodnie z tymi wcześniejszymi doniesieniami, zaobserwowaliśmy podobne fenotypy wśród komórek T cd44highcd8 + leczonych śledzioną i węzłami chłonnymi, które znacznie zwiększyły nkg2d, ale nie PD-1 (Fig . 4A, c) i komórki T CD44highCD4+, które znacznie zwiększyły PD-1, ale nie NKG2D (rys. 4b, d). Gdy oceniliśmy te same markery fenotypowe w populacjach limfocytów T rezydujących w obwodowych, nie-limfatycznych narządach, fenotyp limfocytów CD44highCD8+ znacznie różnił się od fenotypu limfocytów cd44highcd8 + rezydujących w drugorzędowych narządach limfatycznych. Podczas gdy komórki CD44highCD8 + t rezydujące w płucach i wątrobie były nadal NKG2D+CD25neg (Fig. 4A, c), częstość występowania komórek NKG2D+ w tej populacji zwiększyła się z 20-30% w narządach limfatycznych do 40-50% w narządach obwodowych (Fig. 4a). Ponadto, w przeciwieństwie do narządów limfatycznych, w których ekspresja PD-1 Była niezmieniona, ekspresja PD-1 była znacznie zwiększona zarówno w płucach, jak i w wątrobie, po niej w populacji CD44highCD8+ (Fig. 4c). Natomiast fenotyp limfocytów T CD44highCD4 był niezwykle podobny do śledziony i limfocytów T CD4 we wszystkich narządach (Fig. 4B, d) z porównywalną ekspresją PD-1 i minimalnym zwiększeniem regulacji nkg2d. CD25 nie był zwiększany w limfocytach T CD4 lub CD8 w żadnym miejscu (DANE nie zostały przedstawione). Było to nieoczekiwane, ponieważ wcześniej sugerowaliśmy, że ekspresja różnicowa PD-1 była prawdopodobnie podstawowym mechanizmem różnicowej indukcji apoptozy między limfocytami T CD4 i CD8 po silnych, immunostymulujących schematach IT. Jednak w narządach obwodowych komórki T CD4 nadal pozostają nieproporcjonalnie dotknięte apoptozą, pomimo faktu, że ekspresja PD-1 jest porównywalna między komórkami T CD4 i CD8. Ten wzór, który się pojawił, był również interesujący, ponieważ zwiększona ekspresja markera aktywacji na obwodzie wydawała się bezpośrednio korelować z przewagą TE / EM, szczególnie w przypadku PD-1.

ostatnio wykazano, że krążące komórki te/EM wykazują podwyższony poziom PD-1 w spoczynku ludzi . Dlatego postawiliśmy hipotezę, że komórki CD8 + TE / EM mogą preferencyjnie wyrażać te markery aktywacji w stosunku do CD8 + TCM, co skutkuje różną częstotliwością komórek T CD44highCD8 + wyrażających markery aktywacji w drugorzędowych narządach limfatycznych i obwodowych po nich. Dlatego oceniliśmy ekspresję nkg2d i PD-1 na komórkach CD8 + CD44highCD25neg TE/EM i TCM we wszystkich narządach u myszy spoczynkowych i leczonych IT. W myszach kontrolnych zarówno NKG2D (rys. 5a) i PD – 1 (rys. 5c) wyrażano z większą częstotliwością w podgrupie TE / EM populacji CD8 + CD44highCD25. Jednak ogólna częstość występowania populacji TE / EM wśród limfocytów T CD8+ u myszy spoczynkowych jest stosunkowo niska w porównaniu z TCM (wykresy kołowe Fig. 5a), zatem ogólna ekspresja zarówno PD-1, jak i NKG2D jest przeważnie niska (Fig. 4) ponieważ TCM stanowi większość limfocytów T CD8+ w spoczynku. U myszy leczonych immunoterapią zarówno ekspresja NKG2D, jak i PD-1 była zwiększona we wszystkich narządach (Fig. 4). Po raz kolejny oba NKG2D (rys. 5b) i PD – 1 (rys. 5d) ulegały silniejszej ekspresji na komórkach T CD8 + TE/EM niż na komórkach TCM CD8+. W narządach limfatycznych, gdzie populacja TE/EM zwiększyła się w porównaniu z grupą kontrolną, była ona nadal znacznie mniejsza niż komórki TCM CD8+ (wykresy kołowe, Fig. 5B), co skutkuje mniej znaczącymi rozbudowami tych terenów. W przeciwieństwie do narządów limfatycznych, komórki CD8 + TE / EM stanowiły większość badanych narządów obwodowych (wykresy kołowe, Fig. 5b), dzięki czemu ogólna ekspresja NKG2D i PD-1 jest znacząco wyższa w tych miejscach. Ponownie ważne jest, aby zauważyć, że w narządach limfatycznych myszy leczonych immunoterapią ogólna ekspresja obu markerów aktywacji była znacznie niższa niż w narządach obwodowych ze względu na przekrzywianie TCM w limfatykach na obwodzie w populacji CD8. Poziomy ekspresji nie różniły się znacznie między TE / EM w różnych narządach (nie było znaczących różnic między narządami limfoidalnymi i obwodowymi)w ramach tych samych grup leczonych, ale ogólnie zwiększyły się w grupie leczonej IT w porównaniu z grupą kontrolną, tendencja, która była bardziej wyraźna w przypadku NKG2D niż PD – 1 (Fig . 5). Natomiast ekspresja markera aktywacji TCM pozostawała względnie stała nie tylko wśród narządów myszy w grupie leczonej, ale także pomiędzy grupą kontrolną a grupą leczoną IT (Fig. 5a-b). Łącznie dane te sugerują, że budowa puli pamięci/aktywowanej (TCM vs TE/EM) w dużym stopniu wpływa na fenotyp aktywowanej populacji limfocytów T, szczególnie w przypadku limfocytów T CD8, ponieważ ich budowa znacznie różni się między narządami limfoidalnymi i nie-limfoidalnymi.

ocena limfocytów T u pacjentów otrzymujących ogólnoustrojową terapię immunostymulacyjną w wysokich dawkach

następnie chcieliśmy ocenić, czy wyniki te przekładają się na leczenie immunostymulujące raka u ludzi. Obecnie nie ma badań oceniających połączenie agonistycznego anty-CD40 z rekombinowaną ludzką IL-2, jednak rutynowo porównywano naszą terapię skojarzoną z innymi układowymi lekami immunostymulującymi, w tym agonistami TLR w dużych dawkach i układowymi cytokinami w dużych dawkach, i wykazano podobne zmiany fenotypowe i funkcjonalne w komórkach T, jak obserwowane w naszym modelu przedklinicznym . Aby ocenić, czy pacjenci w klinice wykazywali podobne zmiany ekspresji markerów powierzchniowych, zebraliśmy jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) od pacjentów z przerzutowym czerniakiem poddawanych systemowej terapii IL-2 w wysokich dawkach. Pacjenci otrzymywali 6 x 10^5 J. M./Kg mc. co 8 godzin w planowanej sumie 14 dawek. W celu oceny fenotypu limfocytów T pobrano próbki PBMC jeden dzień przed rozpoczęciem leczenia (wartość wyjściowa) lub w 8.dniu pierwszego cyklu leczenia (dzień 8). Porównując próbki wyjściowe i próbki z dnia 8., stwierdzono znaczące zwiększenie liczby komórek pamięci PD-1+ (CD45RO+) w podgrupach limfocytów T CD4 i CD8 po zastosowaniu terapii IL-2 w dużych dawkach (Fig. 6a-c). Gdy populacja ta została dalej podzielona na pamięć centralną (CD62L+) i pamięć efektor/efektor (CD62L-) w punkcie czasowym dnia 8, podzbiór pamięci efektor/efektor wyrażał znacznie wyższą ekspresję PD-1 niż podzbiór pamięci centralnej (Fig. 6d-e). Łącznie dane te korelują z danymi obserwowanymi w badaniach na myszach, co sugeruje, że dane te mają zastosowanie do badań na ludziach i mogą być wskaźnikiem tego, co dzieje się lokalnie.