studium przypadku: odkrywanie inhibitorów kanałów sodowych bramkowanych napięciem

jako sposób na zilustrowanie problemów związanych z odkryciem leków kanałów jonowych opisanych powyżej, pozostała część tego artykułu opisze studium przypadku koncentrujące się na identyfikacji inhibitorów kanałów sodowych bramkowanych napięciem w leczeniu przewlekłego bólu neuropatycznego. Leczenie bólu jest poważnym problemem medycznym i istnieje duży wysiłek w przemyśle farmaceutycznym, aby opracować nowe terapie dla tego stanu. W szczególności leczenie bólu neuropatycznego, zdefiniowanego jako” przewlekły ból wynikający z pierwotnej zmiany lub dysfunkcji obwodowego układu nerwowego ” przez Międzynarodowe Stowarzyszenie Badań nad bólem (IASP), pozostaje główną niezaspokojoną potrzebą medyczną.

oczywiste jest, że kanały sodowe bramkowane napięciem (Nav1) odgrywają kluczową rolę w powstawaniu i propagacji potencjałów działania nerwów czuciowych niezbędnych do sygnalizacji bólu. Lokalne zastosowania niesubtyp selektywnych blokerów kanałów sodowych, takich jak nowokaina, zapewniają całkowitą ulgę w bólu poprzez blok przewodzenia. Jednak to podejście do łagodzenia bólu jest ograniczone do bardzo niewielu zastosowań, takich jak procedury stomatologiczne, ponieważ kanały sodowe są również niezbędne do przewodzenia w sercu, OUN, mięśniach szkieletowych i nienocyceptywnych neuronach czuciowych. Rodzina Nav1 super składa się z 10 członków (Yu i Catterall, 2004). Siedem z tych podtypów, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 i Nav1.9, występuje w obwodowym układzie nerwowym (PNS). Spośród nich, Nav1.7, Nav1.8 i Nav1.9 są wyrażone głównie w neuronach nocyceptywnych i Nav1.3 jest głównie zarodkowy, ale jest regulowany u dorosłych PNS po urazie. Ten ograniczony wzór ekspresji sprawia, że te podtypy są atrakcyjnymi celami dla rozwoju nowych środków przeciwbólowych. Jednak ich względny udział w sygnalizowaniu bólu, a w szczególności w sygnalizowaniu bólu neuropatycznego, jest niejasny i może się różnić w zależności od różnych etiologii i cech sensorycznych bólu.

w przypadku braku selektywności molekularnej dla jednego podtypu Nav1, możliwe jest specyficzne ukierunkowanie kanałów Nav1 w danym stanie konformacyjnym przy zachowaniu przewodnictwa impulsowego zależnego od kanału sodowego. Ten rodzaj hamowania zależnego od stanu jest podstawą okna terapeutycznego obserwowanego w przypadku leków przeciwdrgawkowych i przeciwarytmicznych blokujących kanał sodowy, takich jak lamotrygina i lidokaina. Leki te mają większe powinowactwo do kanałów w Stanach otwartych i/lub inaktywowanych niż do spoczynkowych, zamkniętych kanałów. Ten mechanizm hamowania sprzyja wiązaniu się w szybko wypalanych lub częściowo depolaryzowanych tkankach. Ból neuropatyczny powinien być wrażliwy na ten mechanizm hamujący, ponieważ uważa się, że wynika on z indukowanych urazami obszarów depolaryzacji, hipotezy, która jest poparta kliniczną skutecznością lidokainy podawanej systemowo w dawkach subanestetycznych. Co więcej, niesubtyp-selektywny, zależny od stanu blok może pozwolić sobie na największą skuteczność, od indywidualnego nokautu Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 lub Nav1.9 nie dostarczyło przekonujących dowodów na dominującą rolę któregokolwiek z tych kanałów w neuropatycznym sygnalizowaniu bólu.

opierając się na tym uzasadnieniu, podjęto decyzję, aby początkowo stosować niesubtyp selektywne, zależne od stanu inhibitory Nav1, jednocześnie monitorując selektywność molekularną poprzez testowanie związków będących przedmiotem zainteresowania na Nav1.7, Nav1.5 (główny kanał sodowy serca) i Nav1.8 równolegle.

do przesiewania ∼200 000 związków na Nav1.8 w stabilnej ekspresji w rekombinowanej linii komórkowej zastosowano test oparty na potencjale membranowym. Ten test HTS został oparty na fluorescencyjnym rezonansowym przenoszeniu energii (FRET) między dwoma członkami membranowej czułej na potencjał pary barwników opracowanej przez Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Kanały Nav1. 8 inkubowano wstępnie Związkiem badanym i chemicznym agonistą deltametryną w przypadku braku zewnątrzkomórkowego sodu. Późniejsze dodanie sodu powodowało depolaryzację błonową, A Blok Nav1 oznaczano ilościowo jako interferencję z procesem depolaryzacji komórkowej.

chociaż początkowy ekran na Nav1.8 przyniosło wiele trafień, tylko jeden związek został uznany za realny ołów w wysiłkach Chemii Medycznej. Przed zaangażowaniem zasobów do tego ołowiu, związek, dipodstawiony sukcynimid zwany BPBTS(N-{ metylo }-n’-(2,2′-bithien-5-ylo metylo)sukcynimid), został szczegółowo zbadany za pomocą ręcznego zacisku napięcia całej komórki. Stwierdzono, że BPBT hamuje wszystkie podtypy Nav1 o podobnej sile działania, a hamowanie zależy od potencjału błony i częstotliwości stymulacji. Ten mechanizm hamujący był zgodny z większym powinowactwem związku do kanałów w stanie otwartym i inaktywowanym w porównaniu z kanałami w stanie spoczynku. Ponadto BPBTS był o dwa rzędy wielkości silniejszy niż klinicznie stosowane przeciwdrgawkowe i antyarytmiczne blokery Nav1, hamując stan inaktywowany Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 i Nav1.2, z wartościami Ki 0,09, 0,15, 0,08 i 0,14 µM oraz stan spoczynku z wartościami kr odpowiednio 1,5, 1,3, 0,3 i 1,2 µM (Priest i in., 2004).

jako taki, BPBTS był atrakcyjnym przewodnikiem dla chemii medycznej; jego głównym obowiązkiem jest niski profil farmakokinetyczny. W trakcie profilowania analogów BPBT, jak również opublikowanych inhibitorów Nav1, przy użyciu fluorescencyjnego testu przesiewowego opartego na potencjale membranowym, odnotowano rozbieżności w strukturze między mocą określoną w teście fluorescencyjnym i elektrofizjologią dla kilku związków. Rozbieżności te były związane z interakcją między tymi związkami a agonistą weratrydyną używaną do otwierania kanałów Nav1. 7. Następnie test fluorescencyjny zmodyfikowano w taki sposób, że kanały Nav1 wstępnie inkubowano badanym związkiem w fizjologicznych pozakomórkowych stężeniach sodu, a depolaryzację zależną od Nav1 inicjowano przez dodanie agonisty (Fig. 1). Działanie hamujące kanał mierzone w tym zmodyfikowanym teście bardzo dobrze korelowało z inaktywowanym hamowaniem stanu określonym przez elektrofizjologię w wielu klasach strukturalnych inhibitorów Nav1(Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).

chociaż analogi BPBT nie przekroczyły początkowego ołowiu w sile działania, Chemii Medycznej udało się poprawić profil farmakokinetyczny, ostatecznie wytwarzając trans-N-{metylo }-N-metylo-N’-cyklopentano-1,2-dikarboksamid (CDA54) o 44% biodostępności po podaniu doustnym, godzinnym okresie półtrwania i współczynniku klirensu 14 ml/min / kg, który był szeroko profilowany in vivo (Brochu i in., 2006). W dwóch szczurzych modelach bólu neuropatycznego, CDA54 (10 mg/kg mc., podawane doustnie) znacząco zmniejszał nadwrażliwość behawioralną wywołaną uszkodzeniem nerwów o 44-67%. Ta sama dawka CDA54/stężenie CDA54 w osoczu nie wpływała na ostry nocycepcja (badanie na płytce gorącej u szczurów), koordynację ruchową (badanie na rotorodzie u szczurów) ani na przewodzenie serca (parametry elektrofizjologiczne mierzone u psów z układem sercowo-naczyniowym). Właściwości te są w przeciwieństwie do obecnych blokerów kanałów sodowych stosowanych w klinice, które powodują zaburzenia koordynacji ruchowej u szczurów i działania niepożądane OUN u ludzi we wszystkich skutecznych dawkach. Co ciekawe, po podaniu doustnym stosunek mózgu do osocza dla CDA54 wynosił 0,03. W przeciwieństwie do tego, klinicznie stosowane blokery Nav1 gromadzą się w OUN, a stosunek mózgu do osocza jest większy niż 10 dla meksyletyny. Dane uzyskane z CDA54 silnie sugerują, że hamowanie samych kanałów sodowych PNS jest skuteczne w zwierzęcych modelach bólu neuropatycznego i że ograniczenie ekspozycji na inhibitory Nav1 w ośrodkowym układzie nerwowym jest realnym podejściem do opracowania inhibitorów Nav1 o poprawionym indeksie terapeutycznym.

kampania UHTS, przy użyciu testu opartego na potencjale membranowym opisanego w celu wykrycia inhibitorów Nav1.7, odkryła nowe inhibitory 1–benzazepin-2-one channel (Hoyt i wsp., 2007; Williams et al., 2007). Ta klasa inhibitorów wykazywała określony związek struktura–aktywność i, po ocenie in vivo, w modelach bólu neuropatycznego i padaczki u gryzoni, elementy tej serii były skuteczne doustnie. Co ważne, niektórzy członkowie tej klasy wykazywali selektywność molekularną dla kanałów Nav1. 7 (Williams et al., 2007). Na przykład związek 2 z Fig. 2 był wysoce zależny od stanu i 10-krotnie selektywny dla Nav1.7 przez Nav1.8 i Nav1.5. Najsilniejszy, choć nie selektywny Podtyp, członek tej klasy inhibitorów Nav1.7 (związek 1, Bnza; Fig. 2) został tritiowany. BNZA wiąże się z wysokim powinowactwem (KD 1,6 nM) do rekombinowanych kanałów Nav1. 7. Jest to pierwsza demonstracja wiązania ligandów o wysokim powinowactwie do Nav1. 7 i stanowi cenne narzędzie przesiewowe, za pomocą którego można wyszukiwać związki selektywne Nav1.7. Dane uzyskane z serii strukturalnej 1-benzazepin-2-on sugerują, że Nav1.7-selektywne analogi mogą być identyfikowane, a przy odpowiednich właściwościach farmakokinetycznych i metabolizmu leków, takie związki mogą być opracowane jako środki przeciwbólowe, potencjalnie wykazujące lepszą tolerancję w stosunku do istniejących leków stosowanych w leczeniu bólu neuropatycznego. Poparcie dla możliwości opracowania selektywnych inhibitorów kanału sodowego podtypu jako nowych leków przeciwbólowych pochodzi z niedawnego raportu o selektywnym środku Nav1.8 o wysokim powinowactwie, który podawany dootrzewnowo był skuteczny w szerokim zakresie modeli bólu u gryzoni (Jarvis et al., 2007).

potencjalnym alternatywnym podejściem do wyszukiwania selektywnych inhibitorów kanału sodowego podtypu byłoby poszukiwanie związków, które są ukierunkowane na mechanizmy bramkowania kanałów. Kilka peptydy poprzednio pokazywali modyfikować gatating sodium kanały, ale niewiele mały molekuła, zwłaszcza inhibitory, opisywali funkcjonować w ten sposób. Jednym z takich środków jest ProTx-II, 30-aminokwasowy peptyd oczyszczony z jadu tarantula; peptyd ten blokuje kanały sodowe i wykazuje selektywność dla Nav1.7 (Smith i wsp., 2007). ProTx-II wiąże się ze stanem spoczynkowym kanałów sodowych i przesuwa zależność napięciową aktywacji kanałów do bardziej zdepolaryzowanych potencjałów. Silne depolaryzacje pokonują hamowanie kanału, co jest cechą charakterystyczną tego typu peptydu modyfikującego bramkowanie. Jedną z możliwych strategii identyfikacji mimetyków małocząsteczkowych peptydu modyfikującego bramkowanie jest znakowanie radiologiczne ProTx-II w formie biologicznie aktywnej i opracowanie testu wiązania z kanałami Nav1. 7 heterologicznie wyrażonymi w linii komórkowej. Badanie przesiewowe pod kątem małych cząsteczek modulujących Wiązanie ProTx-II może ujawnić nowe klasy inhibitorów kanałów, które dzielą się na membranę i zakłócają ruch łopatki bramkowej, zapobiegając w ten sposób otwarciu kanału. Dodatkową zaletą tego typu UHTS jest to, że można zastosować wysokie stężenia badanych związków, sytuacja, która jest wykluczona w Przesiewaniu na bazie barwnika z powodu interferencji fluorescencji, która zwykle występuje przy wysokich stężeniach wielu małych cząsteczek organicznych. Biorąc pod uwagę, że niektóre peptydy modyfikujące bramkowanie wiążą się z regionami, które są unikalne dla określonych kanałów w super rodzinie, selektywne inhibitory podtypu mogą być zidentyfikowane za pomocą takiej strategii.