w ostatniej dekadzie odnotowano niezwykłe postępy w dziedzinie proteomiki i genomiki. Oprócz podstawowych osiągnięć technicznych, które doprowadziły do zwiększenia ilości wysokiej jakości danych, ta rewolucja „-omics ” również zaczęła dostarczać ciekawych wglądów w różnorodność procesów, które regulują tumorigenezę w wielu różnych typach ludzkich nowotworów. Duże mapy drogowe ekspresji genów i białek wytwarzane tymi metodami często mogą być wykorzystywane do klasyfikacji nowotworów lub przewidywania odpowiedzi na niektóre rodzaje terapii. Jednak często nie udaje im się wskazać specyficznych regulatorów, które mogą służyć jako obiecujące cele dla następnej generacji leków przeciwnowotworowych, głównie dlatego, że wiele z głównych klas białek „lekowalnych” to enzymy, które są ściśle regulowane zarówno na poziomie transkrypcji i translacji, jak i na poziomie aktywności enzymatycznej. Tak więc wiele obecnie popularnych metod „- omic ” nie dostarcza informacji na temat dynamicznej regulacji danego enzymu lub rodziny enzymów w wielu stadiach rozwoju raka. W tym wydaniu PNAS, Shields et al. (1) Wykorzystaj stosunkowo nową metodę określaną jako „proteomika oparta na aktywności” w celu identyfikacji białka z aktywnością hydrolazy serynowej, która jest niezbędnym regulatorem wzrostu komórek nowotworowych. Dzięki zastosowaniu tego funkcjonalnego podejścia autorzy byli w stanie zidentyfikować konkretny cel enzymatyczny, który może służyć jako cenny cel dla rozwoju leków przeciwnowotworowych.
dziedzina proteomiki opartej na aktywności lub proteomiki chemicznej stała się alternatywą dla standardowych metod proteomicznych, które przede wszystkim dostarczają informacji na temat ogólnej obfitości białek (recenzje, patrz refs. 2–4). Podejście proteomiczne oparte na aktywności wykorzystuje sondy o małych cząsteczkach, które wiążą się z enzymami w sposób zależny od aktywności, umożliwiając w ten sposób zarówno kwantyfikację dynamiki regulacji enzymów, jak i bezpośrednią izolację i identyfikację interesujących celów (Fig. 1). Wraz z rozwojem wielu nowych klas sond (2), a także nowych klas powinowactwa i znaczników fluorescencyjnych (5), profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP) znalazło coraz większe zastosowanie w identyfikacji kluczowych regulatorów chorób ludzkich. W szczególności, szereg ostatnich eleganckich przykładów pokazuje wartość ABPP w identyfikacji interesujących regulatorów progresji raka (4, 6-8).
proteomika oparta na aktywności lub profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP). W tym przykładzie próbki tkanek nowotworowych są znakowane za pomocą sondy opartej na aktywności (ABP), która zawiera reaktywną grupę fluorofosfonianów. Po oznaczeniu docelowych enzymów (w tym przypadku hydrolaz serynowych) znakowane białka są oddzielane przez SDS/PAGE, a względne poziomy aktywności są określane przez intensywność znakowania sondy. Potencjalnie interesujące cele są identyfikowane jako mające zwiększony lub zmniejszony poziom aktywności w próbkach nowotworowych. Znakowane cele są izolowane przez oczyszczanie powinowactwa za pomocą znacznika sondy i identyfikowane za pomocą spektrometrii masowej.
w badaniu Shields et al. (1) w tym wydaniu autorzy wykorzystali sondę hydrolazy serynowej o szerokim spektrum działania do profilowania ludzkich tkanek raka trzustki. Wysiłki te doprowadziły do identyfikacji białka określanego jako białko wiążące siatkówczak 9 (rbbp9), które miało zwiększoną aktywność hydrolazy w 40% analizowanych tkanek nowotworowych. Co ciekawe, białko to zostało wcześniej zidentyfikowane jako białko wiążące siatkówczak (RB) i nie miało znanej aktywności enzymatycznej (9). Wcześniejsze badania funkcji tego białka sugerowały, że jego nadekspresja nadaje oporność na działanie TGFß w hamowaniu wzrostu komórek. Uważa się jednak, że wpływ ten na sygnalizację TGFß jest bezpośrednim wynikiem wiązania RBBP9 z Rb, co prowadzi do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 1 (EFI-1). W ich obecnym badaniu Shields et al. wykazać, że RBBP9 ma aktywność hydrolazy serynowej i, co ważniejsze, że aktywność tego enzymu jest wymagana do przekształcania działania tego białka w komórkach nowotworowych. Utrata aktywności hydrolazy przez mutację seryny w miejscu aktywnym (zidentyfikowanej przez homologię do innych hydrolaz serynowych) lub niszczenie białka za pośrednictwem RNAi prowadzi do zwiększenia fosforylacji Smad 2/3, zmniejszenia ekspresji cząsteczek adhezyjnych, takich jak e-cadherin, a następnie zmniejszenia wzrostu guza. Ponadto autorzy stwierdzają, że poziomy aktywności RBPP9 są podwyższone w wielu innych ludzkich nowotworach, co sugeruje, że hamowanie tej aktywności hydrolazy może mieć szerokie działanie hamujące nowotwór, co czyni go potencjalnie cennym celem rozwoju leków przeciwnowotworowych.
na wielu poziomach, badanie przeprowadzone przez Shields et al. demonstruje siłę podejścia ABPP. Po pierwsze, takie podejście pozwoliło na identyfikację aktywności enzymu w białku, który funkcjonuje w regulacji sygnalizacji wzrostu komórek. Dzięki zastosowaniu podejścia ABPP możliwe było monitorowanie dynamiki regulacji aktywności tego enzymu bez konieczności identyfikacji rodzimego substratu i ustanowienia testu in vitro. Po drugie, poziomy ekspresji RBBP9 były równoważne zarówno w tkankach prawidłowych, jak i nowotworowych, co sugeruje, że aktywność enzymu napędza czynnościowy udział tego białka w wzroście komórek nowotworowych. Tak więc żadna z obecnych metod genomicznych lub proteomicznych nie byłaby w stanie zidentyfikować tego celu jako kluczowego regulatora choroby.
oczywiście pozostaje wiele pytań dotyczących dokładnej mechanistycznej roli RBBP9. Co najważniejsze, jakie są rodzime substraty tego enzymu? Czy enzym rzeczywiście hydrolizuje swoje substraty? Jakie są konsekwencje hydrolizy substratów? W jaki sposób obróbka podłoża prowadzi do regulacji sygnalizacji Smad2 / 3? Interesujące będzie sprawdzenie, czy RBBP9 może być łatwo hamowany przez małe cząsteczki, aby można go zwalidować jako potencjalnie żywotny cel leku przy użyciu bardziej zaawansowanych mysich modeli raka u ludzi. Odpowiedzi na te pytania z pewnością pojawią się dzięki dostępności sond opartych na aktywności.
