przygotowanie składników białkowych do rekonstytucji

składniki aparatu translacyjnego E. coli, w tym czynniki translacyjne i AAR, przygotowano jak poprzednio opisane46. Wytworzono również składniki RNaseP, RNA M1 i białko C5, jak opisano poprzednio29. Zmodyfikowaliśmy protokół dla białka C5, wytrącając je 80% nasyconym siarczanem amonu i rozpuszczając przez dializę z buforem a (50 mM octanu sodu pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl i 7 mM 2-merkaptoetanolu). Otrzymany osad odzyskano przez odwirowanie i rozpuszczono przez dializę w stosunku do buforu B zawierającego 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M mocznika i 10 mM ditiotreitolu (DTT). Rozpuszczone białka nanoszono na 5 mL kolumnę HiTrap SP HP (#17115101, GE Healthcare, USA), przemyto buforem B zawierającym 7 mM 2-merkaptoetanolu jako substytut 10 mM DTT i eluowano liniowym gradientem od 100 mM do 2 m NH4Cl w buforze B. frakcje zawierające białko C5 analizowano za pomocą SDS-PAGE, odzyskiwano, dializowano przeciwko buforowi D (50 mm HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 m NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 m mocznika, 7 mm 2-merkaptoetanolu), następnie dalej dializuje z buforem D bez mocznika. Otrzymane roztwory zatężono stosując Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) i dializowano przeciw buforowi D bez mocznika zawierającego 50% glicerolu. Oczyszczone białko C5 przechowywano w temperaturze -30 °C. zauważamy, że możemy dzielić wszystkie plazmidy na żądanie.

przygotowanie enzymów modyfikujących ivttrna

enzymy Modyfikujące ivttrna przygotowano w następujący sposób. Geny E. coli tsab, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE i GidA zostały amplifikowane z genomu E. coli A19 przy użyciu odpowiednich starterów (Dane dodatkowe 5). Amplifikowane geny dla TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE i GidA zostały sklonowane do pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) jako małe białka fuzyjne modyfikujące ubikwitynę (SUMO), gdzie enzymy his-tag, białko SUMO i Modyfikujące były ułożone tandemowo. Geny dla TsaB i TrmD zostały sklonowane do pET15b jako białka fuzyjnego his-tag. Wszystkie geny zostały sklonowane techniką Gibson assembly technique (#e2611, New England Biolabs, USA). Otrzymane plazmidy przekształcono w szczep E. coli BL21(DE3) i wyhodowano w pożywce 1 LB do OD660 0,6 – 1,0 w temperaturze 37 °C. Nadekspresję indukowano przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 mM dla TsaB, TsaC, TsaD, TsaE i TrmD, lub 0,1 mM dla GlyA, MnmC, MnmE i GidA. Po 3 h uprawy w temperaturze 37°C zebrano komórki. TsaB, TsaC, TsaE, TrmD i MnmE-nadekspresowane komórki zawieszono w 40 mL buforu Lizy (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 1 m NH4Cl, 10 mM MgCl2 i 7 mM 2-merkaptoetanolu) i przerwano przez sonikację. Otrzymany lizat odwirowano, a supernatant odzyskano i zmieszano z 5 mL kompletnej żywicy oczyszczającej his-tag (#05893801001, Roche, Szwajcaria)przez 1 godzinę z rotatorem. Żywicę przemyto 100 mL buforu do lizy, a następnie białko eluowano 25 mL buforu Elucyjnego (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mm imidazol i 7 mM 2-merkaptoetanol). TsaB i TrmD zostały zatężone przez Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA), a następnie poddane dializie przeciwko buforowi Stock (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoetanolu i 30% glicerolu). Zamrożono je błyskawicznie ciekłym azotem i przechowywano w temperaturze -80°C. W przypadku TsaC, TsaE i MnmE do odzyskanych frakcji dodano Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) w końcowym stężeniu 23 µg/ml w celu usunięcia białka SUMO oznaczonego His. Frakcje dializowano w stosunku do buforu rozszczepialnego (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl i 7 mM 2-merkaptoetanolu) przez noc, podczas gdy bufor rozszczepialny zawierał 500 mM KCl do przygotowania MnmE. Dializowane próbki ponownie zmieszano z 5 mL kompletnej żywicy oczyszczającej his-tag z rotatorem. Następnie zebrano frakcje przepływowe zawierające enzymy modyfikujące. Odzyskane próbki zatężono za pomocą Amicon Ultra 3 kDa dla TsaE lub Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) Dla TsaC i MnmE. Dializowano je w stosunku do buforu podstawowego, zamrożono ciekłym azotem i przechowywano w temperaturze -80 °C. W przypadku preparatu GlyA cały bufor zawierał 10% glicerolu, a inne procedury były takie same jak w przypadku preparatu MnmE. TsaD okazał się nierozpuszczalny po sonikacji. W związku z tym białko granulowano przez odwirowanie w temperaturze 20 400 × g w temperaturze 4 °C przez 45 minut i ponownie zawieszono w buforze do lizy uzupełnionym 4% Tritonem X-100. Zawiesinę ponownie granulowano przez odwirowanie w temperaturze 20 400 × g przez 45 minut. Osad rozpuszczono buforem do lizy uzupełnionym 6 M mocznikiem. Druga procedura była taka sama jak przygotowanie MnmE, z tą różnicą, że wszystkie bufory zawierały 2 M mocznika. W przypadku przygotowania MnmC wszystkie kroki do usunięcia oznaczonego przez niego białka SUMO były takie same jak w przypadku przygotowania GlyA. Ponieważ MnmC niespecyficznie wiąże się z żywicą oczyszczającą his-tag, wybrano oczyszczanie chromatografią anionowymienną. Roztwór po leczeniu Ulp1 poddano dializie przeciwko buforowi IEX (50 mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 i 7 mM 2-merkaptoetanolu), a następnie nałożono na kolumnę HiTrap Q HP o pojemności 5 mL (#17115401, GE Healthcare, USA). Kolumnę przemyto 25 mL buforu IEX, a następnie wymyto MnmC z gradientem liniowym od 100 mM do 1 m KCl w buforze IEX. Frakcje zawierające MnmC zatężono za pomocą Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dializowano w stosunku do bufora Stock, zamrożono w błysku ciekłym azotem i przechowywano w temperaturze -80°C. na żądanie możemy udostępnić wszystkie plazmidy.

wytwarzanie genów iVTtRNA

dla każdego iVTtRNA (dane uzupełniające 1) klonowano do wektora pGEMEX-1 (#P2211, Promega, USA) pomiędzy miejscami ograniczenia XbaI i BamHI. Stosując otrzymane plazmidy jako szablony, szablony DNA do transkrypcji in vitro Amplifikowano metodą PCR przy użyciu startera promotora T7 jako startera przedniego i odpowiednich starterów odwrotnych dla każdego iVTtRNA (dane uzupełniające 1). Każdy Starter odwrotny zawierał modyfikację 2 ’- metoksy w drugim nukleotydzie z końca 5′, aby zapobiec niezależnemu od szablonu dodaniu dodatkowego nukleotydu28. Produkty oczyszczano za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25: 24: 1), następnie wytrącano Etanol, a środki strącające rozpuszczono w wodzie. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Składniki RNazy P złożone z białka C5 i RNA M1 dodano następnie do mieszanin reakcyjnych przy 150 nM w celu usunięcia 27 dodatkowych nukleotydów i reakcje inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. transkrybowane ivttrna poddano następnie ekstrakcji fenolem kwasowym, a następnie ekstrakcji chloroformem/alkoholem izoamylowym (10:1), a następnie oczyszczeniu metodą chromatografii anionowymiennej. Próbki zawierające ivttrna załadowano na 10 mL kolumny HiTrap Q HP (#17115401, GE Healthcare, USA) i przemyto buforem Q (20 mm HEPES-Koh pH 7,6 i 200 mM KCl). ivttrna eluowano z liniowym gradientem od 200 mM do 1 m KCl w buforze Q. Frakcje zawierające docelowe ivttrna, oznaczane za pomocą mocznika-PAGE, odzyskiwano przez wytrącanie izopropanolu, a wytrącone ivttrna rozpuszczono w wodzie i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu użycia. Zauważamy, że możemy udostępnić wszystkie plazmidy na żądanie.

modyfikację iVTtRNA

modyfikację t6a37 przeprowadzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pirydoksal-5′-fosforan, 1 mm Ser, 1 mm Gly, 36,4 µM SAM, 0,1 jednostki/µL rekombinowanego inhibitora RNazy (#2313 a, TaKaRa, Japonia), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2,5 µM MnmC, 6 A260 jednostek/mL tRNAGluUUC lub tRNAGluCUC. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 2 godziny w przypadku modyfikacji t6a37 i m1g37 lub 4 godziny w przypadku modyfikacji mnm5U34, Trna poddano ekstrakcji fenolem kwaśnym, a następnie ekstrakcji chloroformem/alkoholem izoamylowym (10:1) i odzyskano przez wytrącanie izopropanolem. Wytrącone Trna rozpuszczono w wodzie i przechowywano w temperaturze -80 °C. W przypadku modyfikacji mnm5U34 reakcję ponownie przeprowadzono z odzyskanymi Trna. Poddano je ekstrakcji kwaśnym fenolem, a następnie ekstrakcji chloroformem / alkoholem izoamylowym (10: 1), odsalono kolumnami MicroSpin G-25 (#27532501, GE Healthcare, USA) i odzyskano przez wytrącanie izopropanolu. Wytrącone Trna rozpuszczono w wodzie i przechowywano w temperaturze -80 °C. w celu ilościowego określenia skuteczności modyfikacji zamiast 1 mM Thr zastosowano 57,1 µM Thr, a mieszaninę bez TsaD zastosowano jako kontrolę modyfikacji t6a37. 36.Zastosowano 4 µM S-adenozylo-metioninę i mieszaninę bez TrmD zastosowano jako kontrolę modyfikacji M1G, a bez GidA jako kontrolę modyfikacji mnm5U34. Po inkubacji w temperaturze 37 °C, aliquots (10 µL) zostały wycofane i zauważone na dyskach filtracyjnych Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). Dyski filtracyjne przemyto dwukrotnie 10% TCA, następnie etanolem, a następnie dokonano pomiaru radioaktywności za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego. W celu określenia ilościowego modyfikacji mnm5U, Trna oczyszczono jak powyżej, a następnie na dyskach filtracyjnych zauważono jednostkę 0,02 A260.

eksperymenty z Aminoacylacją

przeprowadzono zgodnie z poprzednim raportem47. Mieszaniny reakcyjne (10 µL) zawierały 100 mm HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 jednostkę/µL rekombinowanego inhibitora RNazy (#2313 a, TaKaRa, Japonia), 50 nM lub 1,5 µM AAR odpowiadające każdemu aminokwasowi, 20 µM-aminokwasowi lub 68 µM Asn dla aminoacylacji asparaginowej i 2 A260 jednostek/mL tRNA. Do pomiaru metylacji użyto zamiast tego mieszaniny 0,6 µM Met i 3,4 µM zimnej L-metioniny. Cys otrzymano przez redukcję cystyny z 50 mM DTT w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Do pomiaru cysteinylacji stężenie DTT wynosiło 5 mM. gdy zastosowano natywne mieszaniny tRNA, dodano 40 mieszanin tRNA A260 jednostek / mL (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 30 minut, aliquots (8 µL) zostały wycofane i zauważone na dyskach filtracyjnych Whatman 25 mm GF/C (#1822-025, GE Healthcare, USA). Dyski filtracyjne przemyto dwukrotnie 10% TCA, następnie etanolem, a następnie dokonano pomiaru radioaktywności za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego.

syntezę Oktapeptydu z czystym systemem

szablony DNA kodujące oktapeptydy Amplifikowano PCR za pomocą odpowiednich starterów (dane uzupełniające 2) przy użyciu wektora pURE1 (#PUREV001, BioComber, Japonia) zawierającego sekwencję promotora T7 i miejsce wiązania rybosomu (Sekwencja Shine-Dalgarno) jako szablon. Amplifikowane szablony DNA oczyszczono za pomocą zestawu do oczyszczania QIAQUICK PCR (#28104, QIAGEN, Niemcy). Reakcje syntezy oktapeptydów zawierały 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM glutaminian potasu, 13 mM octan magnezu, 2 mM spermidyna, 1 mM DTT, 2 mm ATP, 2 mM GTP, 1 mm UTP, 1 mM CTP, 20 mM fosforan kreatyny, 10 µg/mL 10-formylo-5,6,7,8-tetrahydrofoliowy kwas, 0,2 µM rybosom, szablon DNA 4 nM, białkowe czyste składniki systemu, w tym czynniki translacyjne i enzymy, aminokwasy i Trna. Stężenia białek czystych składników układu były opisane w poprzednim protokole46. Zauważamy, że wszystkie 20 aaRSs zostały uwzględnione w tym eksperymencie, niezależnie od szablonów DNA i kodonów testowych. Skład i stężenie aminokwasów, które zależą od kodonów testowych, są wymienione w danych uzupełniających 2. Skład ivttrna zależy od szablonu i reakcje przeprowadzono stosując podstawowe ivttrna (dane uzupełniające 2) w obecności lub bez testowego ivttrna (dane uzupełniające 2). Stężenie każdego iVTtRNA ustalono na 6 µM. Gdy stosowano natywne mieszaniny tRNA, dodano 56 mieszanin tRNA A260 jednostek / mL (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA). Reakcje przeprowadzono przez 60 minut w temperaturze 37 °C i wycofano alikwoty, nakrapiano na papier filtracyjny Whatman 3 MM (#1822-025, GE Healthcare, USA), gotowano w 10% TCA w temperaturze 90 °C przez 30 minut do odkwaszania aminoacylo-RNA. Radioaktywność w nierozpuszczalnej frakcji 10% TCA mierzono za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego.

synteza białek z systemem PURE

eksperymenty z syntezą białek przeprowadzono z zestawem PUREfrex 2.0 (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japonia) bez mieszanin tRNA w roztworze I (mieszanka buforowa). Dodaliśmy dodatkowo 0.2 µM Met, 4 nM amplifikowany PCR szablon DNA do ekspresji DHFR lub sfGFP (dane uzupełniające 3) oraz określona ilość mieszaniny iVTtRNA lub natywnej mieszaniny tRNA. Reakcje prowadzono w temperaturze 30 lub 37 °C przez 12 godzin i analizowano zsyntetyzowane białka.

Analiza zsyntetyzowanych białek

zsyntetyzowanych DHFR i sfGFP zawierających radioaktywne Met analizowano za pomocą 15% SDS-PAGE, a obraz żelu wizualizowano za pomocą analizatora bio-obrazowania BAS-5000 (GE Healthcare, USA). Analiza przebiegu czasowego ekspresji sfGFP została przeprowadzona przez pomiar fluorescencji sfGFP co 3 minuty przy użyciu systemu StepOne qRT-PCR (#4376373, Applied Biosystems, USA). Obrazy fluorescencyjne zsyntetyzowanego sfGFP w mieszaninach reakcyjnych uzyskano przy użyciu instrumentu LAS-4000 (GE Healthcare, USA). Aktywność zsyntetyzowanego DHFR mierzono w sposób opisany poprzednio 44. Mieszaniny reakcyjne (2 mL) zawierały 50 mM mes-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM etanoloaminę, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0.1 mM EDTA, 100 µM kwasu dihydrofolowego i 10 µL porcji czystej mieszaniny reakcyjnej i inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie dodano 20 mM NADPH do końcowego stężenia 200 µM, a spadek absorbancji przy 340 nm mierzono w okresie 10 minut spektrofotometrem V-550 (Jasco, Japonia). Jedną jednostkę DHFR zdefiniowano jako ilość enzymu potrzebną do przetworzenia 1 µmol kwasu dihydrofolowego w ciągu 1 minuty w temperaturze 37 °C.

analiza LC-MS zsyntetyzowanych białek

DHFR z sekwencją FLAG na jej końcu (Dane dodatkowe 3) zsyntetyzowano za pomocą PUREfrex 2.0 zestaw (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japonia) bez mieszanin tRNA w roztworze I (mieszanka buforowa). Dodatkowo dodaliśmy 4 nM amplifikowany PCR szablon DNA dla DHFR oznaczony sekwencją flagową na końcu C (Dane dodatkowe 3) i określoną ilość mieszaniny iVTtRNA lub natywnej mieszaniny tRNA. Reakcje przeprowadzono w temperaturze 30 °C przez 12 godzin. zsyntetyzowany DHFR oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych Anti-FLAG m2 (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Alikwoty (55 µL) mieszanin reakcyjnych zmieszano z 245 µL buforu do płukania flagowego (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg(oac)2), a następnie zmieszano z 30 µL perełek przez 1 godzinę. perełki przemyto 210 µL buforu do prania flagowego, a następnie dwukrotnie przemyto buforem bez Mg(oac)2 (210 µL i 180 µL). Następnie DHFR eluowano 50 µL buforu do płukania flagowego bez Mg (oac) 2, ale uzupełniono peptydem 3xflag 100 µg/mL (#f4799, Sigma-aldrich, USA) po delikatnym mieszaniu przez 1 godzinę. Przygotowanie próbek do analizy LC-MS przeprowadzono zgodnie z protokołem wspomaganym przez phase transfer surfactant (PTS) 48. 4 µL gęstego buforu PTS (100 mM dezoksycholanu sodu, 100 mM n-lauroilosarkozynianu sodu i 500 mM NH4HCO3) dodano do 40 µl eluowanych próbek. Zmniejszono je 10 mM TCEP w 37 °C przez 30 minut, alkilowano 20 mM jodoacetamidem w 37 °C przez 30 minut i hartowano 20 mM Cys. Każdy roztwór reakcyjny podzielono na dwie części. Jeden był trawiony przez 10 ng/µl Lys – C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) i 10 ng/µl trypsyny (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) w 37 °C przez noc. Drugi był trawiony przez 10 ng/µl Asp – N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) w 37 °C przez noc. Po wytrawieniu 10% kwasu trifluorooctowego (TFA) dodano do końcowego stężenia 1%, a roztwory reakcyjne wirowano w temperaturze 15 000 × g przez 5 minut w celu wytrącenia detergentów. Supernatanty odsalono za pomocą samodzielnie przygotowanych końcówek etapu49 i osuszono SpeedVac. Analiza LC-MS została wykonana przy użyciu spektrometru masowego Orbitrap (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) wyposażonego w źródło jonów nanospray (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) i system nano-LC (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). Wysuszone mieszaniny peptydów rozpuszczono w roztworze zawierającym 5% acetonitrylu i 0,1% TFA, a każdą próbkę nanoszono do układu nano-LC. Peptydy zatężono za pomocą kolumny pułapki (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA), a następnie oddzielone za pomocą nano-kapilarnej kolumny (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japonia) przy użyciu dwóch faz ruchomych a (0,1% kwasu mrówkowego) i B (acetonitryl i 0,1% kwasu mrówkowego) z gradientem (5% B przez 5 minut, 5-45% B przez 45 minut, 45-90% B przez 1 minutę i 90% B przez 4 minuty) przy natężeniu przepływu 500 nL/min. Elucja była bezpośrednio elektrosprayowana (2,2 kV)do MS (tryb dodatni, zakres skanowania 200-1500 m/z, rozdzielczość 60 000 FWHM)50.