CRBN jest skutecznie degradowany przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN. A) schemat PROTAC zawierający pomalidomid i ligand VHL (VH032). (B) struktura TD-158, TD-165, TD-343 i TD-487. (C) komórki HEK293T traktowano TD-158, TD-165, TD-343 lub td-487 (0,1, 1 i 10 µM) przez 24 godziny, a poziomy białka VHL analizowano przez immunoblotting. L. E. wskazuje na długą ekspozycję Western blot. D) Wykres DC50 związków TD-158 i td – 165 (TD-165, DC50 = 20,4 nM; TD-158, DC50 = 44,5 nM). E) HA-CRBN i Flag-VHL wyrażono w komórkach HEK293T. Po 24 godzinach komórki leczono TD-158 (500 nM) przez 24 godziny. Lizaty całych komórek analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. (F) komórki HEK293T traktowano 500 nM TD-158 w różnych punktach czasowych, a poziomy CRBN analizowano przez immunoblotting. L. E. wskazuje na długą ekspozycję Western blot.

po obróbce tymi związkami zbadaliśmy poziomy VHL i CRBN za pomocą analizy Western blot. Leczenie TD-158, TD-165 lub TD-343 spowodowało zależne od stężenia obniżenie poziomu białek CRBN (Fig. 1C, górny panel). Jednak poziomy zarówno długiej, jak i krótkiej formy VHL wzrosły, prawdopodobnie dzięki stabilizacji przez interakcję chemiczno-białkową (Fig. 1C, panele górny-środkowy i dolny-środkowy) 34. W przypadku leczenia 10 µM TD-158 poziomy CRBN zostały przywrócone; ten efekt „haka” jest typową cechą występującą w kontekście degradacji białek indukowanych PROTAKIEM w wysokich dawkach9,35,36,37. Jednak TD-487, stereoizomer TD-165, nie wywołał degradacji CRBN (Fig. 1C). TD-343 miał stosunkowo słabą aktywność, co sugeruje, że włączenie tlenu do łącznika hamuje aktywność PROTAC. Ilościowa analiza łańcuchowej reakcji odwrotnej transkrypcji-polimerazy (RT-PCR) wykazała, że obniżenie poziomu CRBN wywołane przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN nie wynikało ze zmian mRNA (Fig. S1B). Dla wszystkich zsyntetyzowanych związków zmierzono wartości 50% stężenia degradacji (DC50) i maksymalnej degradacji (DMAX). Obliczone wartości DC50 i Dmax dla TD-158 wynosiły 44,5 nM i 97.Odpowiednio 1%, A odpowiednie wartości dla TD-165 wynosiły 20,4 nM i 99,6% (Fig. 1D i dodatkowe rys. S1D). Krótszy rozkładacz TD-156 zawierający łączniki (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) wykazywał słabszą aktywność w porównaniu z TD-165 (dodatkowe rys. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), z zawartym w łączniku tlenem, doprowadził do nieefektywnej degradacji CRBN. Aby sprawdzić wpływ połączenia z talidomidem, zbadaliśmy degradację CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN z innym połączeniem. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), Z Wiązaniem glikolowym, i TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), z wiązaniem amidowym, wykazywały zmniejszoną degradację CRBN, podczas gdy TD-759 (DC50 = 28,8 nM), z wiązaniem glicyny, wykazywały siłę podobną do TD-165. Aby ustalić, czy względne poziomy białka mogą przyczynić się do tej tendencyjnej degradacji białek, potraktowaliśmy komórki nadekspresją VHL, CRBN lub obu z TD-158 i przeanalizowaliśmy poziomy CRBN i VHL. We wszystkich przypadkach poziomy CRBN były zmniejszone, podczas gdy poziomy VHL pozostały podobne lub zwiększone (rys. 1e). W doświadczeniach z czasem TD-158 zdegradował CRBN o ponad 80% w ciągu 3 godzin i całkowicie zdegradował go po 12 godzinach (rys. 1F). Indukowana przez TD-158 degradacja CRBN była również obserwowana w różnych liniach komórkowych człowieka (Fig. S2A-D).

degradacja CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN jest zależna od CRL2VHL

aby sprawdzić, czy degradacja CRBN przez TD-158 była zależna od UPS lub Ligaz ubikwityny z pierścieniem Cullinowym (CRL), przetestowaliśmy Bortezomib, inhibitor proteasomu i MLN4924, inhibitor neddylacji. Jednoczesne leczenie TD – 158 i bortezomibem lub MLN4924 zapobiegało degradacji CRBN (rys. 2a i dodatkowe rys. S3A). Zgodnie z oczekiwaniami, tworzenie łańcucha Poli-ubikwityny znacznie wzrosło w obecności TD-158 (Fig . 2b). Ponadto, niszczenie VHL przez małe interferujące RNA (siRNA) atenuowało indukowaną przez TD-158 degradację CRBN w komórkach HEK293T (Fig. 2C). Natomiast ekspresja VHL w komórkach 786-O, linii komórek raka nerki z niedoborem VHL, przywróciła indukowaną przez TD-158 degradację CRBN (Fig. 2D). Zgodnie z tymi wynikami, pośredniczone przez siRNA knockdown Cullin2, białka rusztowania kompleksu CRL2VHL, zapobiegło degradacji crbn wywołanej przez TD-158 (Fig. 2E). Łącznie wyniki te wskazują, że degradacja CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN jest zależna od kompleksu CRL2VHL.

degradacja CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN zależy od CRL2VHL. (A) komórki HEK293T traktowano TD-165 (1 µM) przez 12 godzin, a następnie dodano Bortezomib (20 nM) lub DMSO przez 8 godzin. lizaty pełnokomórkowe poddano analizie immunoblotowej dla wskazanych białek. B) oznaczony flagą CRBN (Crbn-Flag) i oznaczony Ha Ubikwityną (HA-Ub) wyrażono w komórkach HEK293T. Po 24 godzinach komórki leczono TD-158 (500 nM) i bortezomibem (20 nM) lub DMSO i bortezomibem (20 nM), przez 12 godzin. lizaty Pełnokomórkowe i białka immunoprecypitowane za pomocą kulek magnetycznych FLAG m2 analizowano przez immunoblotting dla wskazanych białek. C) komórki HEK293T transfekowano siRNA swoistym dla VHL lub mieszanym (kontrolnym) siRNA. Po 24 godzinach komórki leczono TD-158 (500 nM) przez 24 godziny. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. (D) komórki 786-O i komórki 786-o z ekspresją VHL (786-o + VHL) traktowano TD-158 (500 nM) przez 24 godziny. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. E) komórki hek293t i CUL2 – knockdone hek293t traktowano TD-165 (1 µM) lub td-487 (1 µM) przez 24 godziny, a lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting. F) Flaga CRBN została wyrażona w komórkach HEK293T. Po 36 godzinach komórki leczono TD-158 (1 µM) i bortezomibem (20 nM) lub DMSO i bortezomibem (20 nM) przez 12 godzin. lizaty Pełnokomórkowe i białka immunoprecypitowane za pomocą kulek magnetycznych FLAG m2 analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. G) oczyszczone białka złożone CRBN i VHL/ELOB/ELOC zmieszano i podzielono na cztery probówki. TD-158 i kulki Glutationowe dodano zgodnie ze wskazaniami i inkubowano przez 3 godziny. po inkubacji kulki Glutationowe przemyto i przeanalizowano przez immunoblotting i niebieskie zabarwienie Coomassie.

skuteczna degradacja przez Protaki wymaga utworzenia trójskładnikowego kompleksu z docelowym białkiem i ligazą E39,38. Aby to przetestować, przeprowadziliśmy eksperymenty z immunoprecypitacją. Odkryliśmy, że egzogennie wyrażony znacznik Flag crbn Ko-immunoprecypitował endogenny VHL w obecności TD-158, ale nie w jego braku (Fig. 2F). Eksperymenty GST pull-down z wykorzystaniem oczyszczonych białek wykazały, że CRBN bezpośrednio oddziaływał z kompleksem VHL-Elongina B / C w obecności TD-158 (Fig . 2G). Ponadto dodanie nadmiaru pomalidomidu lub ligandu VHL hamowało degradację crbn wywołaną przez TD-158 (Fig. S3B, C). Egzogennie wyrażony CRBN Y384/W386A (AA), Mutant wadliwy w wiązaniu pomalidomidu16, nie został zdegradowany przez TD-158 (dodatkowe rys. S3D). Tak więc dane te sugerują, że tworzenie trójskładnikowego kompleksu wśród CRBN, VHL i TD-158 jest warunkiem wstępnym degradacji CRBN.

globalna analiza proteomiczna ujawnia, że TD-158 indukuje degradację CRBN

aby zbadać degradację CRBN w bezstronny sposób, przeprowadziliśmy ilościową analizę proteomiczną. Aby zminimalizować wtórne skutki degradacji CRBN, potraktowaliśmy komórki Jurkata, które ulegały ekspresji substratów CRBN i IMiD neo, TD-158 lub DMSO (kontrola pojazdu) przez 12 godzin. białka z każdej próbki trawiono, a trawione peptydy oznaczono do znakowania izobarycznego połączonego z chromatografią cieczową-tandemową spektrometrią mas. W analizie tej zidentyfikowano 7148 białek zawierających więcej niż trzy zbędne, unikalne peptydy (tabela uzupełniająca S1). Tylko trzy białka—CRBN, CNIH1 i LMBRD2—spełniały kryteria wartości P = 0,05 i ponad 1,5-krotnej zmiany. Wśród nich CRBN był jedynym białkiem, które zmieniło się ponad 2-krotnie(rys. 3A). Jednak poziomy innych składników kompleksów CRL4CRBN (CUL4A, CUL4B, ddb1 i RBX1) i kompleksów CRL2VHL (elongina C , elongina B , CUL2 i RBX1) pozostały niezmienione (Fig. 3B, C). Co ciekawe, poziomy wcześniej zgłoszonych Neo-substratów IMiD, w tym IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 i ZNF653, nie uległy zmianie po leczeniu TD-158 (rys. 3B) 39,40,41. Wyniki te zostały potwierdzone przez immunoblotting w Jurkacie i różnych liniach komórkowych szpiczaka mnogiego (Fig. 3D i dodatkowe rys. S2A-D).

globalne zmiany proteomiczne po leczeniu TD-158. A) Wykres wulkanu białek zidentyfikowanych przez ilościowe analizy proteomiczne, porównujący lizaty z komórek Jurkata leczonych przez 12 h 1 µM TD-158 lub DMSO. Dane przedstawiają trzy biologiczne replikaty. Oś x reprezentuje fałdową zmianę poziomów białka w skali logarytmicznej, a oś y reprezentuje wartość p w skali logarytmicznej. B) względna obfitość kompleksu CRL4CRBN, kompleksu CRL2VHL i neo-substratu CRBN (*p < 0,05, **p < 0,1). Czerwona linia oznacza 1,5-krotną różnicę. (C) komórki Jurkata traktowano TD-158 (1 µM) lub DMSO przez 24 godziny. lizaty całych komórek analizowano przez immunoblotting dla białek złożonych CRL4CRBN. D) komórki Jurkata leczono DMSO, TD-158 (1 µM), pomalidomidem (1 µM) lub ligandem VHL (1 µM) przez 24 godziny. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek.

degradacja CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN rekapituluje niedobór CRBN

endogennym substratem CRL4CRBN jest syntetaza glutaminowa GLUL, która jest kluczowym enzymem w biogenezie glutaminy. Acetylotransferaza CBP / p300 acetyluje dwie N-końcowe reszty lizyny kleju w warunkach wysokiego poziomu glutaminy, a otrzymany acetylowany kleju jest wychwytywany i ubikwitynowany przez CRL4CRBN, a następnie usuwany przez proteasomy22. Aby zbadać wpływ TD-158 na poziom kleju, głodowaliśmy przez 48 godzin komórki Hep3B glutaminy, a następnie uzupełnialiśmy glutaminę w obecności lub braku TD-158. TD-158 powodował degradację CRBN niezależnie od statusu glutaminy, a poziom kleju zmniejszał się wolniej w czasie w obecności TD-158 niż w jego braku (Fig. 4A,B). Ponadto testy ubikwitynacji in vivo wykazały, że ubikwitynacja kleju zmniejszyła się w obecności TD-158 (Fig. 4C). Zbadaliśmy również, czy leczenie TD-165 nadaje oporność komórkową na IMiD. Dwie linie komórkowe wrażliwe na IMiD, WSU-DLCL2 i RPMI8226, były wstępnie leczone TD-165 lub DMSO przez 24 godziny, a następnie leczone pomalidomidem, TD-165, lub obie przez 3 d. wstępne leczenie TD-165 zmniejszało działanie antyproliferacyjne pomalidomidu w obu liniach komórkowych (Fig. 4D, E). Łącznie dane te wskazują, że degradacja CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN rekapituluje niedobór CRBN.

degradacja CRBN przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN podsumowuje niedobór CRBN. A) komórki Hep3B poddawano głodowi glutaminy i traktowano TD-158 (500 nM) przez 48 godzin. następnie komórki traktowano glutaminą (4 mM) w różnych punktach czasowych. Degradację kłębuszków analizowano metodą immunoblottingu. B) wyniki ilościowe trzech niezależnych eksperymentów. C) GLUL-Myc i V5-Ub wyrażono w komórkach HEK293T. Po 24 godzinach komórki leczono TD-158 (500 nM) lub DMSO przez 12 godzin, a następnie traktowano bortezomibem (100 nM) lub DMSO przez 12 godzin. lizaty Pełnokomórkowe i białka immunoprecypitowane za pomocą kulek magnetycznych Myc analizowano przez immunoblotting dla wskazanych białek. (D,E) komórki WSU-DLCL2 (D) i rpmi8226 (E) poddano wstępnej obróbce TD-165 (1 µM) lub DMSO przez 24 godziny i po zebraniu podzielono na cztery grupy. Następnie każdą grupę leczono pomalidomidem (1 µM) i DMSO lub pomalidomidem (1 µM) i td-165 (1 µM) przez 3 d. Żywotność komórek mierzono stosując CellTiter-Glo (**p < 0,001, *p < 0,01).

aby zbadać efekty in vivo heterodimeryzujących PROTAKÓW VHL-CRBN, próbowaliśmy ustalić, czy TD-165 może wywoływać degradację CRBN w modelach zwierzęcych. Chociaż pozostałości aminokwasowe w mysim CRBN (mCRBN) ważne dla teratogenności nie są zachowane, mCRBN został wyraźnie zdegradowany, choć w nieco mniejszym stopniu, przez TD-165 w mysich fibroblastach zarodkowych (Fig. S4A). Następnie podawaliśmy TD-165 dootrzewnowo myszom w celu ustalenia, czy TD-165 indukuje degradację CRBN in vivo. Jednakże, poziom CRBN nie ulegał zmianie w śledzionie, komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) lub wątrobie (Fig. S4B). Biorąc pod uwagę, że farmakokinetyka TD-165 jest rozsądna (tabela uzupełniająca S2), brak tego efektu można przypisać wysokiemu wiązaniu TD-165 z białkami osocza (99, 9%) (tabela uzupełniająca S3).

N-terminalnie obcięty CRBN nie jest rozkładany przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN

aby określić, która domena CRBN jest ważna dla degradacji crbn za pośrednictwem TD-165, wygenerowaliśmy serię mutantów delecji CRBN (D1–D4), jak pokazano na Fig. 5A. komórki wykazujące pełną długość CRBN lub pojedyncze mutanty delecji traktowano DMSO lub TD-165, a lizaty komórek badano pod kątem degradacji po leczeniu TD-165. Co zaskakujące, żaden z czterech mutantów delecji CRBN nie został zdegradowany przez TD-165, podczas gdy crbn pełnej długości został skutecznie zdegradowany (Fig. 5b). Warto zauważyć, że poziomy VHL były nieznacznie podwyższone prawdopodobnie ze względu na stabilizację interakcji chemiczno-białkowej w obecności TD-165, ale nie zmieniane przez ekspresję obciętych mutantów CRBN w obecności TD-165 (Fig. 5b). Jednym z możliwych wyjaśnień jest niezdolność delecji mutantów do utworzenia trójskładnikowego kompleksu. Jednakże mutant D1 utworzył trójskładnikowy kompleks z TD-165 i VHL (Fig. 5c), a ubikwitynacja D1 wzrosła w obecności TD-165 (Fig . 5D). Następnie postawiliśmy hipotezę, że aminokwasowe reszty lizyny crbn są wymagane do ubikwitynacji. Aby przetestować ten pomysł, podstawiliśmy wszystkie trzy reszty lizyny w N-końcu CRBN (a. a.1-80) argininą, pojedynczo i łącznie, a następnie zbadaliśmy lizaty komórkowe pod kątem degradacji CRBN. TD-158 skutecznie rozkładał wszystkie mutanty w takim samym stopniu jak CRBN typu dzikiego (rys. 5E), wskazując, że trzy reszty lizyny na N-końcu CRBN nie są wymagane do degradacji indukowanej przez protaki heterodimeryzujące VHL-CRBN.

n-końcowy nieuporządkowany region CRBN jest niezbędny do degradacji, ale nie do ubikwitynacji, przez heterodimeryzację VHL-CRBN protacs. A) schemat obrazujący mutacje okrojenia CRBN. LON, domena proteazy Lon; TB, domena wiązania talidomidu. (B)w komórkach hek293t eksprymowano mutanty delecyjne o Pełnej długości oznaczane Xpress lub D1, D2, D3 lub D4. Po 24 godzinach komórki leczono TD-165 (3 µM) lub DMSO przez 24 godziny. Lizaty pełnokomórkowe analizowano metodą immunoblotting dla wskazanych białek. (C) plazmidy kodujące znakowane Xpress D1 i znakowane His-SBP VHL zostały przetransfekowane do komórek HEK293T. Po 48 godzinach komórki leczono TD-165 (1 µM) lub DMSO przez 24 godziny. lizaty Pełnokomórkowe i białka pobrane z paciorków streptawidyny analizowano przez immunoblotting dla wskazanych białek. D) plazmidy kodujące oznaczane Xpress mutanty CRBN, k39r, K42/43 R lub K39/42 / 43 r transfekowano do komórek HEK293T. Po 24 godzinach komórki leczono TD-158 (2 µM) lub DMSO przez 24 godziny. Lizaty pełnokomórkowe analizowano metodą immunoblotting dla wskazanych białek.

nieuporządkowany region docelowego białka jest wymagany do skutecznej degradacji wywołanej PROTAC

następnie staraliśmy się określić różnice strukturalne między pełnowymiarowym CRBN a mutantem delecji CRBN D1. Przewidywano, że N-KONIEC CRBN (a.a. 1-80) zawiera rozwinięty lub wewnętrznie nieuporządkowany region, na podstawie analizy IUPred2A (dodatkowe rys. S5A). Ten nieuporządkowany region (a.a. 1-48) był rzeczywiście nie do wykrycia w strukturze krystalicznej CRL4CRBN ze względu na jego elastyczność (wpis PDB; 6bn7). Wykazano, że samoistnie nieuporządkowany region jest jednym z głównych składników proteasomalnego degronu i działa jako inicjator proteolizy25. Alternatywnie, w przypadku białek kulistych bez nieuporządkowanego regionu, kompleks białka zawierającego P97/walosynę (P97/VCP) może rozwinąć strukturę drugorzędową, ułatwiając proteasomalną degradację białek. W celu zbadania związku między degradacją białka wywołaną PROTAKIEM a kompleksem p97 / VCP, zbadaliśmy wpływ inhibitora P97/VCP na degradację crbn wywołaną przez TD-165. Eksperymenty te wykazały, że na degradację CRBN nie miało wpływu leczenie DBeQ (Fig. 6a). Poziomy indukowanego uszkodzeniem DNA transkryptu 3 (DDIT-3; CHOP) i lipidowanego LC-3II, stosowanego jako kontrola pozytywna, były podwyższone po leczeniu DBeQ. Odrzucenie p97 przez leczenie siRNA lub DBeQ zaburzyło ścieżki ERAD i autofagii, prowadząc do upregulacji CHOP, dobrze ugruntowanego markera UPR i nagromadzenia odpowiednio LC-3II, reprezentatywnego markera autofagii (Fig. 6A) 42. W związku z tym, aby zbadać, czy nieuporządkowany region CRBN ułatwia degradację proteasomalną wywołaną przez PROTAK, przyłączyliśmy nieuporządkowany region (a.a. 1-80) CRBN do mutantów D2, D3 i D4 i zbadaliśmy białka chimeryczne pod kątem degradacji. Wszystkie białka chimeryczne, zwłaszcza chimera D4, zostały zdegradowane przez TD-165 w sposób zależny od stężenia (Fig. 6b). Jednak wprowadzenie nieuporządkowanego regionu CRBN do końca N lub C VHL nie wywołało degradacji białka fuzyjnego (Fig. 6C), wskazując, że przyłączenie regionu nieuporządkowanego nie jest wystarczające dla wszystkich białek docelowych. Aby rozszerzyć ten pomysł na degradację wywołaną przez inne Protaki, przetestowaliśmy ARCC4, wcześniej zgłoszony receptor androgenowy (AR) PROTAC43, ponieważ AR zawiera również rozwinięty region na N-końcu (a.a. 1-330), jak określono za pomocą narzędzia do analizy IUPred2A (dodatkowe rys. S5B). Po obróbce ARCC4, AR bez N-końcowego regionu nieuporządkowanego (ΔN330) ulegał degradacji mniej efektywnie niż AR pełnej długości. Co ciekawe, przyłączenie nieuporządkowanego obszaru CRBN (a. a. 1-80) do AR ΔN330 zwiększyło wydajność degradacji (rys. 6D i dodatkowe rys. S5C). Zgodnie z tym, przyłączenie regionu nieuporządkowanego AR (a.a. 1-170) do mutanta CRBN D1 również promowało proteolizę przez TD-165 (Fig. 6e i dodatkowe rys. S5D).

nieuporządkowany region docelowego białka jest wymagany do skutecznej degradacji przez Protaki. (A) komórki HEK293T traktowano TD-165 (1 µM), inhibitorem P97/VCP dbeq (10 µM), lub oba przez 6 godzin. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. (B) n – końcowy CRBN (a.a. 1-80) wstawiono do n-lub C-końca plazmidu VHL oznaczonego His–SBP, a plazmidy eksprymowano w komórkach HEK293T. Po 8 h komórki zebrano i podzielono na cztery grupy. Następnie każdą grupę leczono zwiększającym się stężeniem TD-165 przez 48 godzin. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. (C) plazmidy wyrażające N-KONIEC CRBN (a.a. 1-80) połączone z D2, D3 lub D4 transfekowano do komórek HEK293T. Po 8 h komórki zebrano i podzielono na cztery grupy. Następnie każdą grupę leczono zwiększającym się stężeniem TD-165 przez 48 godzin. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. (D) plazmidy wyrażające ar o Pełnej długości, N-KONIEC delecji AR (ΔN330) lub N-KONIEC CRBN (a.a. 1-80) połączone z ΔN330 (CRBN (a.a. 1-80) +ΔN330) transfekowano do komórek HEK293T. Po 8 h komórki zebrano i podzielono na cztery grupy. Każda grupa była następnie leczona zwiększającymi się stężeniami ARCC4 przez 24 godziny. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek. (E) plazmidy wyrażające CRBN o Pełnej długości, Mutant delecji D1 lub N-KONIEC AR (a.a. 1-170) połączone z D1 (AR (1-170) +D1) transfekowano do komórek HEK293T. Po 8 h komórki zebrano i podzielono na cztery grupy. Następnie każdą grupę leczono zwiększającym się stężeniem TD-165 przez 48 godzin. lizaty pełnokomórkowe analizowano immunoblotting dla wskazanych białek.

aby jeszcze bardziej wzmocnić te wyniki, wybraliśmy Protaki o wysokiej sile działania (DC50< 1 µM) na podstawie wyszukiwania literatury, a następnie przeanalizowaliśmy je pod kątem wewnętrznie nieuporządkowanego regionu za pomocą narzędzia IUPred2A. Co ciekawe, stwierdzono, że dwie trzecie wybranych białek ukierunkowanych PROTAC posiada nieuporządkowany region zawierający więcej niż 40 aminokwasów, albo na jednym z ich końców, albo wewnętrznie (Tabela 1)44, chociaż przewidywanie regionów nieuporządkowanych lub nieustrukturyzowanych na podstawie sekwencji aminokwasów nie bierze pod uwagę innych czynników, takich jak interakcja białko-białko lub modyfikacje potranslacyjne 44,45,46. Zgodnie z tym wykazano, że VHL-Homo-PROTAC indukuje degradację długiej formy VHL, która zawiera nieuporządkowany region na jej N-końcu, ale nie krótką formę vhl47. Tak więc, to potwierdza naszą ideę, że nieuporządkowany region białek docelowych jest wymagany do skutecznej degradacji przez Protaki.