wyniki i dyskusja

w systemach ssaków aktywność Cdc42 okazała się ważna w regulacji różnicowania komórek macierzystych/progenitorowych skóry w komórki mieszków włosowych, kontrolowaniu biegunowości neuroepitelialnej pnia/progenitora i rozwidleniu półkuli mózgowej oraz regulacji liczby komórek i wzrostu w okresie rozwoju okołoporodowego (6-9). Co ciekawe, badanie aktywności Cdc42 u dorosłych myszy WT w różnym wieku ujawnia, że względny poziom Cdc42-GTP u starszych zwierząt jest znacznie wyższy niż u młodszych w różnych tkankach, w tym w sercu, mózgu, płucach, wątrobie, szpiku kostnym, śledzionie i nerkach (Fig. 1 A i dane nie pokazane), podnosząc możliwość, że zwiększona aktywność Cdc42 bierze udział w normalnym procesie starzenia.

aby ustalić, czy zwiększona aktywność Cdc42 związana z naturalnym starzeniem może mieć znaczenie fizjologiczne, zbadaliśmy ujemny regulator Cdc42, Cdc42GAP, u myszy ukierunkowanych na geny po osiągnięciu dorosłości. Wcześniejsze badania homozygotycznych myszy znokautowanych Cdc42GAP w okresie okołoporodowym wykazały, że różne tkanki / komórki zawierały podwyższony poziom Cdc42-GTP, a zarodki/nowo narodzone szczenięta genotypu Cdc42GAP −/− wykazywały zmniejszoną wielkość narządu/organizmu, co jest związane ze zwiększoną samoistną apoptozą w różnych typach komórek (6). U dorosłych myszy Cdc42GAP−/− aktywność Cdc42 była konstytutywnie wyższa w wielu typach tkanek / komórek niż u pasujących myszy WT, podczas gdy poziom RhoA – GTP lub Rac1-GTP pozostał podobny do poziomu WT (Fig . 1 B; brak danych), co sugeruje specyficzny wzrost aktywności Cdc42 u dorosłych zwierząt podobny do tego w okresie okołoporodowym. Większość myszy Cdc42GAP – / – zmarła w okresie noworodkowym z powodu ich mniejszych rozmiarów i słabej budowy ciała (6). Jednak część z nich (≈7%) może przetrwać okres noworodkowy pod opieką zastępczą przez niezwiązane z opieką matki. Pomimo regularnego przyjmowania mleka i prawidłowego stężenia glukozy i insuliny w surowicy krwi u homozygotycznych myszy w okresie poporodowym, zwiększenie masy ciała myszy Cdc42GAP – / – zaczęło zwalniać w ≈3 miesiącu życia w porównaniu z ≈5 miesiącem życia u myszy WT lub heterozygotycznych, a Dojrzałe homozygoty były ≈30% zmniejszone w masie ciała z powodu zmniejszenia ogólnej celulozy (Fig . 1 C i nie pokazano danych). Mediana życia myszy Cdc42GAP – / – wynosiła ≈12 miesięcy, podczas gdy myszy kontrolne (WT lub heterozygotyczne) pozostawały żywotne do mediany wieku ≈27 miesięcy (Fig. 1 D). Krzywa przeżycia homozygotycznych myszy różni się nieco od typowej krzywej Gompertza, ale jest podobna do tej opisanej dla bubr1 (mitotyczny regulator punktu kontrolnego) knockout (10) lub p44 (krótka izoforma supresora guza p53) transgenicznych zwierząt (11). Kifoza i brak wigoru u myszy Cdc42GAP – / – stały się widoczne w wieku ≈12 miesięcy (Fig. 1 E). Skórne myszy Cdc42GAP−/− w wieku 15 miesięcy wykazywały wyraźne zmniejszenie masy ciała, znaczną utratę podskórnej tkanki tłuszczowej, ciężką lordokyphosis i zanik mięśni (dane nie pokazane). Badanie rentgenowskie wykazało znaczący fenotyp kifozy i zmniejszoną gęstość mineralną kości (BMD) u myszy Cdc42GAP−/− w wieku 15 miesięcy (Fig. 1 F). Dalsze oznaczanie wyciętych kości myszy Cdc42GAP – / – wykazało 3-i 2,6-krotne zmniejszenie BMD odpowiednio w kości piszczelowej i udowej (SI Fig. 7). Ponadto, zarówno samce, jak i samice myszy Cdc42GAP−/− utraciły płodność we wcześniejszym wieku w porównaniu z wiekiem WT. W kryciu pomiędzy samicami Cdc42GAP−/− a samcami WT, homozygoty stały się bezpłodne w wieku 26 tygodni w porównaniu z 48 tygodniami w WT (Fig. 1 G). Obserwacje te wskazują, że niedobór Cdc42GAP skutkuje konstytutywnie podwyższonym poziomem Cdc42-GTP, zmniejszoną wielkością ciała, wczesną kifozą, zmniejszoną BMD, skróconym okresem płodności i zmniejszoną długością życia u dorosłych myszy.

h&e zabarwione odcinki kręgów 8-miesięcznych samic myszy wykazały, że myszy Cdc42GAP- / − miały cieńszą, pochyloną korę i cieńsze beleczki w porównaniu z myszami WT (Fig. 2 A). Podobnie, odcinki długości geograficznej kości udowej myszy homozygotycznych wykazały zmniejszenie grubości kości korowej w porównaniu z myszami WT (dane nie zostały przedstawione). Obserwacje te są zgodne z wyglądem brutto i cechami klinicznymi osteoporozy. Śledziona, wątroba i nerki dorosłych myszy Cdc42GAP−/− zostały zmniejszone w masie z powodu zmniejszenia ogólnej celulozy, co było widoczne w zabarwionych sekcjach śledziony H&e, a białe obszary miazgi zawierające komórki T i B 12-miesięcznej śledziony Cdc42GAP-/-były znacznie zmniejszone w porównaniu z tymi u myszy WT dopasowanych do wieku (Fig. 2 B i nie przedstawiono danych), co sugeruje wyraźny zanik limfoidalny u homozygotów. Zgodnie z widocznym zmniejszeniem podskórnej tkanki tłuszczowej, analiza histologiczna przekrojów skóry grzbietowej wykazała prawie całkowity brak komórek tłuszczowych s. c. U 9-miesięcznych myszy Cdc42GAP − / – (Fig. 2 C). Ubytek masy mięśniowej i zanik mięśni potwierdzono również przez badanie H&e-barwionych fragmentów mięśni szkieletowych u 12-miesięcznych myszy Cdc42GAP-/− i myszy WT dopasowanych do wieku (Fig. 2 C). Myszy Cdc42GAP−/− wykazywały również znaczne zmniejszenie regeneracji włosów po usunięciu włosów grzbietowych przez golenie, podczas gdy dopasowany wiek i płeć WT wykazywał solidny odrost włosów (SI Fig. 8). Zdolność do tolerowania stresów, takich jak gojenie się ran, aktywność związana ze starzeniem (12) myszy Cdc42GAP -/−, była znacznie zmniejszona w porównaniu z WT (Fig. 2 D). Analiza histopatologiczna odcinków rany wykazała niewielką reepitelializację w krawędzi rany myszy Cdc42GAP−/−, podczas gdy całkowita reepitelializacja myszy WT była widoczna 4 dni po wprowadzeniu rany (Fig . 2 E). Oprócz tych obserwacji, szereg hematopoetycznych fenotypów homozygotycznych myszy, w tym niedokrwistość, zmniejszenie śledziony i komórek szpiku kostnego, defekty hematopoetycznych komórek macierzystych wszczepienia do szpiku kostnego i zwiększona wrażliwość hematopoetycznych komórek macierzystych na indukowaną mobilizację (13, 14) były zgodne z wczesnym starzeniem się w układzie krwiotwórczym. Co ważne, badanie młodych myszy homozygotycznych (<w wieku 4 miesięcy) przed przejawem oczywistych fenotypów nie wykazało większych nieprawidłowości w kości, skórze i śledzionie (SI Fig. 9 A i B oraz dane nie pokazane), co sugeruje, że starzejące się fenotypy myszy Cdc42GAP−/− nie są spowodowane wczesnym zaburzeniem rozwojowym. Ponadto wiele fenotypów myszy homozygotycznych, w tym zmniejszona grubość kości korowej, kifoza i utrata masy mięśniowej i tkanek naskórka, można znaleźć u starych (>2,5 roku) myszy WT (SI Fig. 9 C i D oraz brak danych). Jak podsumowano w tabeli SI 1, łącznie wyniki te dostarczają silnych dowodów na to, że niedobór Cdc42GAP powoduje przedwczesne fenotypy podobne do starzenia się u zwierząt.

barwienie tkanek 9-miesięcznych dorosłych, w tym wątroby, nerek i śledziony, dla β-galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA-β-gal) ujawniło silną aktywność tego markera starzenia się u homozygotycznych myszy, która nie była wykrywalna w tkankach myszy WT dopasowanych do wieku i płci (Fig. 3 A I SI rys. 10), wskazując, że tkanki cdc42gap – / – dorosłych mogą ulegać przedwczesnemu starzeniu. Co ciekawe, wzrost apoptozy tkanek homozygotycznych obserwowany w okresie okołoporodowym był nieobecny u dorosłych homozygotów, gdy stwierdzono podwyższoną aktywność SA-β-gal (ref. 6 i nie pokazano danych). Komórki zarodkowego fibroblastu (MEF) cdc42gap−/− myszy, które zawierają ≈3-krotnie większą zawartość Cdc42-GTP, ale normalną zawartość Rac1-GTP lub Rhoa-GTP w porównaniu z komórkami WT MEF (6), wykazywały znacznie zwiększoną aktywność SA-β-gal i gromadziły spłaszczoną i powiększoną morfologię starzenia, począwszy od pasażu 6, gdy komórki WT MEF były ujemne dla aktywności SA-β-gal i były umowne w morfologii (Fig. 3 B I SI rys. 11). Komórki Cdc42GAP – / – MEF zaczęły zwalniać wzrost w pasażach 5-7, gdy dopasowane komórki WT MEF rosły wykładniczo (Fig. 3 C) (6) i przeszły masywny replikacyjny starzenie po przejściu 7, podczas gdy większość komórek WT MEF nie osiągnęła starzenia do przejścia 13 (SI Fig. 11 i nie pokazano danych). Ponadto znacznie wyższy odsetek komórek Cdc42GAP – / – MEF w przejściu 7 utworzył większe ogniska w jądrze niż komórki WT(si Fig. 12). Wyniki te wskazują, że niedobór Cdc42GAP indukuje wczesne starzenie tkanek / komórek.

jednym z dobrze rozpoznawanych czynników przyczyniających się do przedwczesnego starzenia się ssaków i starzenia komórek jest zwiększona niestabilność genomu (15). Analiza rozprzestrzeniania się metafazy wykazała, że>30% pierwotnych splenocytów od 8-miesięcznych homozygotycznych myszy było aneuploidami, podczas gdy splenocyty WT dopasowane do wieku i płci nie miały wykrywalnej aneuploidii (Fig. 3 D), co wskazuje, że tkanka Cdc42GAP−/− cierpiała na niestabilność genomową. Na poparcie tego odkrycia, komórki Cdc42GAP – / – MEF wykazały znaczny wzrost komórek podwójnych jąder w barwieniu DAPI w porównaniu z komórkami WT w przejściu 7 (SI Fig. 12). Analiza kariotypu późniejszych fragmentów komórek MEF (Przejście 6-7) wykazała ponadto, że chociaż większość chromosomów z komórek WT (≈80%) pozostała nienaruszona, 42% komórek Cdc42GAP−/− zawierało co najmniej jedną aberrację chromosomową, 20% zawierało dwie lub więcej aberracji, a 14% zawierało trzy lub więcej aberracji (Fig. 3 E). Odsetek i stopień aneuploidy również znacząco wzrosły w komórkach Cdc42GAP – / – MEF, przy >32% komórek wykazujących nieprawidłową liczbę chromosomów w zakresie od 72 do 102, podczas gdy większość komórek WT była diploidalna (Fig. 3 E I SI rys. 13). Analiza kariotypu uszkodzeń chromosomalnych wskazuje, że aberracje homozygotycznych komórek MEF były zróżnicowane, w tym przerwa chromatyd, przedwczesna separacja chromatyd siostrzanych (cecha wadliwego punktu kontrolnego montażu wrzeciona), translokacja, przerwy chromosomowe, chromosom dicentryczny i fragmentacja chromosomu (Fig. 3 F I SI Tabela 2), co sugeruje, że mechanizm naprawy uszkodzeń DNA jest zagrożony w komórkach Cdc42GAP−/−. Immunofluorescencyjne barwienie fosfo-H2 AX w jądrze komórkowym, marker odpowiedzi na uszkodzenie DNA (16), pokazuje, że chociaż 10% komórek cdc42gap−/− MEF passage 7 było dodatnich dla markera uszkodzenia DNA, <1% komórek WT było dodatnich (Fig. 3 G). Korelacja pomiędzy początkiem i progresją fenotypów podobnych do starzenia się myszy Cdc42GAP−/− a obserwowanym stopniem i nasileniem aberracji genomowych w komórkach Cdc42GAP – / – wspiera rolę Cdc42 w rozwoju cech progeroidowych.

w celu określenia możliwego mechanizmu skumulowanych uszkodzeń DNA w komórkach Cdc42GAP− / − porównaliśmy poziom endogennych reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach homozygotycznych z poziomem komórek WT, ponieważ Rac1 i Rac2, dwie blisko spokrewnione Rho Gtpazy, są znanymi regulatorami komórkowej ROS (17). SI Fig. 14 pokazuje, że komórki Cdc42GAP−/− wykazywały aktywność ROS podobną do aktywności komórek WT, co wskazuje, że Cdc42GAP reguluje stabilność genomu poprzez endogenny mechanizm niezależny od ROS. Z powodu podobieństwa wielu fenotypów myszy Cdc42GAP−/−do tych z wielu genów ukierunkowanych na mysie modele cząsteczek naprawy uszkodzeń DNA, w tym Brca1−/− p53+/−, Ku80−/−i MTR−/− Wrn mysie modele (12, 18, 19), zbadaliśmy reakcję wczesnych komórek cdc42gap – / – na różne czynniki uszkodzenia DNA. W teście wzrostu odpowiedzi na uszkodzenia DNA komórki z niedoborem Cdc42GAP wykazywały szeroki defekt aktywności naprawy uszkodzeń DNA (Fig. 4), co przejawia się znacznie wyższym odsetkiem śmierci komórki wśród komórek homozygotycznych w porównaniu z komórkami WT po leczeniu zwiększeniem dawek H 2O2, napromieniowaniem jonizującym, kamptotekiną, metylometanosulfonianem lub mitomycyną C. Tak więc nagromadzone różnorodne nieprawidłowości genomowe Znalezione w późniejszych fragmentach komórek Cdc42GAP – / – można przypisać, przynajmniej częściowo, zaburzonym czynnościom naprawczym uszkodzeń DNA.

konsekwencją trwałego uszkodzenia genomu w komórkach jest indukcja wielu genów odpowiedzi na uszkodzenie DNA i / lub genów starzenia (20, 21). Ekspresje p53, p21Cip1, p16Ink4a i phospho-P53 (Ser-15) w komórkach Cdc42GAP−/− MEF były znacznie wyższe niż w komórkach WT MEF po podobnych przejściach, podczas gdy p19ARF w komórkach homozygotycznych wykazywał podobną tendencję wzrostu z przejściami, jak w komórkach WT (Fig. 5 A). Poziomy białka p53, p21Cip1, p16ink4a, fosfo – P53 (Ser-15) i markera uszkodzenia DNA fosfo-H2 AX w tkankach Cdc42GAP- / – u 8-miesięcznych myszy były również znacząco wyższe niż w odpowiednich tkankach dopasowanych myszy WT (Fig . 5 B). Wyniki te dostarczają dowodów na to, że aktywacja szlaku regulowanego przez p53, w szczególności p21Cip1 i p16Ink4a, jest związana z wczesnym starzeniem się wywołanym niedoborem Cdc42GAP. Aby zbadać pytanie, czy podwyższona aktywność Cdc42 w komórkach z niedoborem Cdc42GAP jest wystarczająca do uwzględnienia fenotypu wczesnego starzenia, wyeksprymowaliśmy aktywujący mutant Cdc42, Cdc42F28L, w pierwotnych komórkach WT MEF i zbadaliśmy aktywność SA-β-gal komórek w porównaniu z aktywnością pasującą do komórek ekspresyjnych EGFP w różnych fragmentach. Ekspresja Cdc42F28L spowodowała znaczny wzrost populacji komórek SA-β-gal-dodatnich (35% w komórkach Cdc42F28L w porównaniu z 7% w komórkach ekspresji EGFP) we wczesnych komórkach MEF (Fig. 5 C), co wskazuje, że aktywacja Cdc42 jest wystarczająca do indukcji wczesnego starzenia się komórek.

aby dalej zbadać możliwość, że fenotyp starzenia komórek Cdc42GAP−/− może zostać uratowany przez defekt p53, wygenerowaliśmy myszy Cdc42GAP+/−p53+ / − i próbowaliśmy przygotować komórki MEF z krzyżówki. Spośród 44 zarodków uzyskano sześć z genotypem Cdc42GAP−/−p53+/−i żaden z genotypem Cdc42GAP−/− p53 -/ -. Komórki Cdc42GAP−/ – p53+ / – MEF rosły w tempie pomiędzy komórkami p53+ / – i WT i wykazywały podstawową populację starzejącą się porównywalną z populacją p53+/− lub WT w pasażu 7, podczas gdy komórki p53 – / – i Cdc42GAP – / – MEF rozmnażały się z krzywą liniową i krzywą podwajania populacji i były odporne na starzenie i podatne na starzenie w podobnych pasażach, odpowiednio (Fig. 5 D i E). Wyniki te wskazują, że przedwczesne starzenie wywołane aktywacją Cdc42 zależy od p53.

ograniczona długość życia komórek i zwierząt może wynikać z replikacyjnego starzenia w odpowiedzi na różne stresy, w tym uszkodzenie DNA (22), erozję telomerów (23), ROS (24) i / lub niewłaściwie aktywowane onkogeny (25). Myszy Cdc42GAP−/− prezentują model zwierzęcy o zwiększonej aktywności Cdc42, który naśladuje mitogenną aktywację cdc42 indukowaną sygnałem (6) i umożliwia ocenę możliwego wpływu aktywacji Cdc42 na fizjologię zwierząt i komórek. Wykazujemy, że niedobór Cdc42GAP powoduje wczesne wystąpienie starzenia w komórkach i przedwczesne fenotypy przypominające starzenie się u zwierzęcia. W szczególności, celowanie w Gen Cdc42GAP indukuje globalny wzrost aktywności Cdc42 i promuje niestabilność genomu komórki ze zmniejszoną zdolnością naprawy uszkodzeń DNA,co z kolei może aktywować p53 i P16 Ink4a, prowadząc do wczesnego starzenia (rys. 5 F). Wcześniej stwierdzono, że Cdc42 jest aktywowany w starszych komórkach w celu modulacji korekty morfologicznej (26). Zaproponowano również udział w zmianach morfologicznych komórek regulowanych przez p53, apoptozie i proliferacji (27-29) oraz w apoptozie kontrolowanej przez N-końcową kinazę C-Jun (30, 31), zdarzeniach związanych ze starzeniem się komórek i starzeniem się zwierząt (32, 33). Nasze odkrycia, że aktywacja Cdc42 jest związana z naturalnym starzeniem się i że niedobór Cdc42GAP powoduje defekt naprawczy uszkodzenia DNA, aby umożliwić komórkom gromadzenie nieprawidłowości genomowych, które prowadzą do wczesnego starzenia się, dodatkowo sugerują funkcjonalny związek między aktywnością Cdc42 a starzeniem się ssaków.

Aktywacja szlaku p53 lub zaburzenie genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA lub regulacji stabilności genomu indukuje wczesne starzenie się u myszy (11, 12, 33, 34). Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, że Cdc42 może nie być zaangażowany w regulację aktywności ponadtlenku komórkowego (17), odkryliśmy, że nagromadzone uszkodzenie DNA w komórkach Cdc42GAP−/− nie jest związane z aktywnością ROS, ponieważ komórki homozygotyczne nie wykazują zwiększonej aktywności ROS. Delecja Cdc42GAP powoduje znaczne zmniejszenie zdolności naprawy uszkodzeń DNA w szerokim spektrum, w tym odpowiedzi na czynnik sieciujący DNA i induktor przerwania dwuniciowego lub jednoniciowego, co sugeruje, że przedłużona aktywacja Cdc42 może tłumić zdolność naprawy uszkodzeń DNA. Różnorodność genomowych uszkodzeń znalezionych w komórkach Cdc42GAP−/− jest również zgodna z wpływem globalnej wady naprawy uszkodzeń DNA. Ważne pytania pozostające do rozwiązania obejmują, jakie konkretne determinanty molekularne są zaangażowane w naprawę uszkodzeń DNA regulowanych przez Cdc42GAP i jakie sygnały wyjściowe powodują wzrost Cdc42-GTP podczas normalnego procesu starzenia.