związki

inhibitory ALDH1A130. Inhibitory LDHA zostały wcześniej opisane w Rai i wsp.29. Inhibitory IDH1 zostały wcześniej opisane w Urban et al. i Davis et al.24,36. Innymi związkami stosowanymi w badaniu były metotreksat (MedChem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Izofagomina (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) i LY2857785 (Medchem Express, HY12293). W przypadku qHTS związki w mechanizmie MIPE testowano w 11 punktach (intraplate, współczynnik rozcieńczenia 1: 3). Zbiór inhibitorów kinazy zawierający 977 inhibitorów kinazy testowano w dawkach 7-punktowych (interplan, współczynnik rozcieńczenia 1: 5). We wszystkich przypadkach DMSO był używany jako pojazd.

klonowanie

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Otwarte ramki odczytu (ORF) genów będących przedmiotem zainteresowania klonowano do tylnych kości akceptora za pomocą miejsc BamHI/EcoRI (N-końcowy) lub Nhei/BamHI (C-końcowy) przez amplifikację PCR regionu kodującego oligonukleotydami zgodnymi z infuzją, zdefiniowanymi szczegółowo w dodatkowej tabeli S1. Konstrukty IDH1, LDHA, DHFR, GC i ALDH1A1 zostały wytworzone metodą syntezy genu GeneArt (ThermoFisher) w pcDNA3.1 (+). Dla klonowania Bramy (Tylko konstrukcje IDH2), wektor docelowy zawierający znacznik 86B został utworzony przez zastąpienie znacznika V5 w pcDNA3.2-V5/dest. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal 'scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes „LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

hodowle komórek

hek293t, LN18, OV-90, HeLa, 22rv1, MDA-MB-468 i HT-29 uzyskano z ATCC (odpowiednio CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 i HTB-38). HuCC-T1 i CC-LP-1 były życzliwym darem Dr n. Bardeesy ’ ego (Massachusetts General Hospital, Boston). Komórki HEK293T hodowano w DMEM (4,5 g / L glukozy) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 6 mM L-glutaminą, 1 mM pirogronianem sodu, 50 J./mL penicyliny i 50 µg/mL streptomycyny. Komórki ln18, HT-29, CC-LP-1 i HeLa hodowano w powyższym ośrodku, bez pirogronianu sodu. Komórki OV – 90 hodowano w mieszaninie 1: 1 pożywki MCDB 105 (Cell Applications Inc.) i medium M199 (HyClone, GE), uzupełnione 15% FBS, 1% penicyliną-streptomycyną (Life Technologies) i końcowym stężeniem 1,85 g/L wodorowęglanu sodu (HyClone, GE). Komórki 22rv1, HuCC-T1 i MDA-MB-468 hodowano w RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS, 6 mM L-glutaminy, 100 jednostek/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny. Wszystkie komórki hodowano w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 5% CO2 i testowano na obecność mykoplazmy z wynikiem ujemnym przy użyciu zestawu do wykrywania MycoAlert (Lonza).

wytwarzanie i oczyszczanie rekombinowanych białek i peptydów

białka 11s i 86B zostały wytworzone przez GenScript. W przypadku rekombinowanego fragmentu 11S kodującą sekwencję DNA połączono z znacznikiem 6x His w celu ułatwienia dalszego oczyszczania, a sekwencję subklonowano do wektora ekspresyjnego E. coli. Komórki Gwiazdy BL21 (DE3) przekształcono rekombinowanymi plazmidami i zaszczepiono pojedynczą kolonię do podłoża lb zawierającego IPTG w celu indukcji ekspresji białka. Do monitorowania ekspresji i wyboru optymalnego czasu zbiorów wykorzystano analizę SDS-PAGE i Western blot. Komórki zbierano przez odwirowanie, a granulki lizowano przez sonikację. Po oczyszczeniu metodą his-tag frakcje sterylizowano za pomocą filtra 0,22 µm. Białka były analizowane przez SDS-PAGE i Western blot przy użyciu standardowych protokołów i mysi anty-His mAb (GenScript, Nr kat. A00186). stężenie oczyszczonego białka oznaczano za pomocą testu białka Bradforda z BSA jako standardem. Białko przechowywano w 1X PBS, 10% glicerolu, pH 7,4, a czystość wynosiła około 90%, jak oszacowano na podstawie analizy densytometrycznej żelu SDS-PAGE z niebieskim zabarwieniem Coomassie w Warunkach redukcji. 15-aminokwasowy peptyd 86B przechowywano w ultraczystym dH2O i był w 99,9% czysty przez HPLC.

Test uzupełniania CETSA o niskiej przepustowości (96-studzienkowe płytki lub paski PCR)

komórki transfekowano w 6-studzienkowych naczyniach stosując procedurę odwrotnej transfekcji, gdzie 1,25 ml kompleksów (6,25 µL Lipofektaminy 2000 i 3 µg DNA na studzienkę) połączono z 1,25 ml zawiesiny komórkowej HEK293T (1 × 106 / mL, łącznie 1,25 × 106 komórek). Dla CDK9 użyto 2 µg DNA na studzienkę. Po 24 godzinach (48 godzin dla CDK9) komórki pobrano przez trypsynizację i zawieszono w buforze CETSA zawierającym DPBS (z CaCl2 i MgCl2) plus 1 g/L glukozy, 1x koktajl inhibitora proteazy Halt (ThermoFisher) i 0,5% DMSO (DMSO nie zostało dodane w przypadku eksperymentów, w których stosowano związek i nośnik). W przypadku eksperymentów w zakresie temperatur (bez związku lub pojedynczej dawki) próbki podzielono na paski PCR w ilości 30 µL na probówkę. Dodano związek i komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. próbki następnie ogrzewano przez 3.5 minut przy użyciu wstępnie podgrzanego cyklera termicznego, pozostawiono do zrównoważenia do temperatury pokojowej i dodano 6 µL 6% NP40 do każdej studzienki. W przypadku eksperymentów z zamrażaniem i rozmrażaniem probówki umieszczano w aluminiowym bloku PCR na łaźni z suchym lodem / etanolem przez 3 minuty, a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C przez 3 minuty, wirowano przez 3 sekundy i powtarzano te kroki jeszcze trzy razy. Dodano 11S (GenScript) i substrat furimazyny (z systemu oznaczania Nano-Glo Lucyferazy Promega) w końcowych stężeniach 100 nM i 0.Odpowiednio 5X, a Próbki analizowano pod kątem natężenia luminescencji przy użyciu wysokoprzepustowego przetwornika CCD VIEWLUX (Perkin Elmer)wyposażonego w filtry clear.

384-dobrze test CETSA

komórki transfekowano w kolbach T75 stosując procedurę odwrotnej transfekcji, gdzie 9 mL kompleksów (45 µL Lipofektaminy 2000 i 22,5 µg DNA) połączono z 10 mL zawiesiny komórek HEK293T (1 × 106 komórek / mL, łącznie 10 milionów komórek). Po 24 godzinach pobrano komórki przez trypsynizację, zawieszono je w ilości 1 × 106 komórek / ml, jak opisano powyżej i dozowano (15 µL komórek/studzienkę) do 384-studzienkowych płytek PCR (Roche) za pomocą Multidrop Combi (ThermoFisher). Związki (63 nL) lub DMSO vehicle control (63 nL) następnie przypinano za pomocą narzędzia pinowego (GNF) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. płyty uszczelniono i ogrzewano we wskazanej temperaturze przez 3,5 min i ochłodzono do 25 °c za pomocą maszyny AB qPCR (Roche) z prędkością rampową 1,5 °C/S dla fazy grzewczej i maksymalną prędkością rampową dla fazy chłodzenia. Dodano trzy µL 6% NP40 na studzienkę i inkubowano przez 30 minut, aby umożliwić lizę komórek, a następnie dodano 11S i substrat furimazyny (w końcowych stężeniach odpowiednio 100 nM i 0,5 X). Próbki analizowano pod kątem natężenia luminescencji za pomocą czytnika ViewLux.

1,536-studzienkowy test CETSA

komórki transfekowano i zebrano jak wyżej (protokół 384-studzienkowy). Komórki dozowano (5 µL komórki/studzienkę) do 1536-studzienkowych białych płytek (Aurora, cykliczny polimer olefinowy, Nr kat. EWB041000A) przy użyciu Multidrop Combi. Związki (23 nL) następnie przypinano za pomocą narzędzia pinowego (Wako Automation) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. płytki ogrzewano we wskazanej temperaturze i czasie za pomocą bloku grzewczego (patrz poniżej) i ochładzano do 25 °C. na studzienkę dodawano jeden µL 6% NP40 i płytki inkubowano przez 30 minut, aby umożliwić lizę komórek, a następnie dodano 3 µL 11s (końcowe stężenie 100 nM) i substrat furimazyny. Płytki odwirowywano i analizowano pod kątem natężenia luminescencji za pomocą czytnika ViewLux. Dla ekranów LDHA i CDK9 stężenie końcowe 0,5 x I 0.Stosowano odpowiednio 25 razy furimazynę. Kontrola normalizacji obejmuje próbki poddane działaniu DMSO i GSK2837808A lub Próbki nieogrzewane odpowiednio dla LDHA i CDK9. Kontrpróbę CDK9 przeprowadzono jak powyżej, z następującymi różnicami: 5 µL nieprzetransfekowanych komórek HEK293T (1 × 106/mL w buforze CETSA) dozowano do 1536-studzienkowych płytek, a następnie dodawano związek, inkubowano w temperaturze 37 °C, ogrzewano i lizy, jak wyżej. Następnie do studzienek dodano 500 pM (końcowy) 86B, a następnie dodano 100 nM 11S i 0,25 x substrat furimazynowy (końcowy).

aluminiowy blok do ogrzewania płyty o studzience 1,536 został zaprojektowany przez pomiar płyty w celu określenia wymiarów obszaru graniczącego z formowanymi żebrami wzmacniającymi W X I Y oraz dolną powierzchnią czołową i dolną powierzchnią kołnierza w Z. następnie formowano blok, który ma być obrabiany z płyty aluminiowej 6061 T6, co byłoby swobodnym dopasowaniem z około 0,5 mm prześwitem dla Płyty we wszystkich osiach. Blok był obrabiany za pomocą ręcznej frezarki pionowej, frezów krańcowych i frezarki czołowej. W przypadku eksperymentów z ogrzewaniem pieca płyty umieszczano w środkowej szafie konwekcyjnego pieca laboratoryjnego (ThermoFisher) i przykrywano metalowymi pokrywami, aby zminimalizować parowanie.

CETSA w komórkowych lizatach

komórki zebrano w buforze CETSA w stężeniu 1,0 × 106 komórek / mL (jak opisano powyżej) i dodano NP40 do końcowego stężenia 0,4%. Po obracaniu próbek przez 30 minut (temperatura pokojowa) lizaty klarowano przez odwirowanie w temperaturze 20 000 × g przez 10 minut (4 oC). Do oczyszczonego lizatu dodano kofaktor (np. NAD+). W przypadku eksperymentów z reakcją temperaturową 25 µL lizatu przeniesiono do probówek PCR i ogrzewano przez 3,5 minuty do różnych temperatur. W przypadku eksperymentów izotermicznych dawka-odpowiedź, 5 µL sklarowanego lizatu dozowano do płyt 1536-studzienkowych za pomocą stacji roboczej Biorraptr FRD, a próbki ogrzewano na bloku aluminiowym. Próbki pozostawiono do równowagi do temperatury pokojowej i dodano substrat (stężenie końcowe: 100 nM 11S, 0,5 x furimazyna). Luminescencję zarejestrowano za pomocą imagera ViewLux, jak opisano powyżej.

Western blots

próbki były przetwarzane zgodnie z opisem w sekcji testu uzupełniania o niskiej przepustowości, przy użyciu cykli zamrażania i rozmrażania do lizy. Lizaty odwirowywano w temperaturze 15,200 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. próbki prowadzono na 4-12% żelu bis-Tris NuPAGE (ThermoFisher) przy użyciu bufora MOPS i przenoszono na membranę PVDF przy użyciu systemu transferu iBlot 2 pod napięciem 25 V przez 7 minut. Błony Zablokowano 5% roztworem mleka (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20), a pierwotne przeciwciała inkubowano przez noc w temperaturze 4 °c w roztworze blokującym. Przeciwciała były: anty-IDH1 (, Sygnalizacja komórkowa #8137, 1:500), anty-IDH1(R132H) (Millipore #Mabc171, 1:500), anty-LDHA (, Sygnalizacja komórkowa #3582, 1:1000). Anty-królik / mysz-HRP (królik = sygnał komórkowy 7074; mysz = sygnał komórkowy # 7076) dodano w 1:2500 i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnał chemiluminescencyjny został wygenerowany za pomocą Supersignal west Dura solution (ThermoFisher) i przechwycony za pomocą systemu Biorad Chemidoc. Analiza densytometryczna została wykonana przy użyciu oprogramowania Photoshop (Adobe).

test 2-HG

komórki hek293t odwracają transfekowane w 24 studzienkach przez dodanie 2.5 × 105 komórek na kompleksy transfekcji (0,75 µg plazmidu DNA, 1,5 µL Lipofektaminy 2000 na studzienkę). Pożywkę do hodowli komórkowej zebrano po 72 godzinach i 15 µL przeniesiono do 384-studzienkowej nieprzezroczystej płytki. Do każdej studzienki dodano 1,5 µL 660 mM HCl i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Do każdej studzienki dodano 1,5 µL podstawy Tris-HCl 720 mM. Następnie 52 µL roztworu detekcji 2-HG (100 mM HEPES (pH 8,0), 100 µM NAD +, 1 µg/mL aktywnej rekombinowanej dehydrogenazy D-2-Hydroksyglutaranowej (D2hgdh; Biovision, Cat: P1001), 5 µM resazuryny, 0,03 mg/mL diaforazy (Sigma, Cat: D5540) dodano i płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej. Standardową krzywą 2-HG przygotowano w 100 mM HEPES (pH 8,0). Fluorescencję mierzono na czytniku ViewLux przy użyciu filtrów Ex: 525, Em: 598/25.

testy biochemiczne

test biochemiczny LDHA przeprowadzono zgodnie z opisem poprzednio opisanym29. Krótko mówiąc, 3 µL ludzkiej dehydrogenazy mleczanowej 5 (2 nM końcowy) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) w buforze testowym LDH (200 mM Tris HCl, pH 7,4, 100 µM EDTA i 0,01% Tween-20) dodano do czarnej, stałej płytki testowej z dna 1536 studzienek (Greiner Bio-One). Po przeniesieniu pin związku (23 nL) W celu rozpoczęcia reakcji dozowano 1 µL roztworu substratu zawierającego NADH (0,06 mm końcowy) i pirogronian sodu (0,2 mM końcowy) (Sigma-Aldrich) w buforze testowym LDH. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do każdej studzienki Dodano 1 µL odczynnika wykrywającego. Płytki natychmiast przeniesiono do czytnika ViewLux i zmierzono fluorescencję resorufin (ex 540 nm, em 590 nm) w czasie 0 i 10 min. Fluorescencję znormalizowano stosując wolne od enzymów i poddane działaniu DMSO studzienki kontrolne na każdej płytce.

test biochemiczny ALDH1A1 z użyciem nietagowanego białka przeprowadzono tak,jak opisano poprzednio31, 37. Krótko, 3 µL 20 nM oczyszczonego ludzkiego ALDH1A1 w buforze testowym (100 mM HEPES pH 7,5 z 0,01% Tween 20) dozowano do czarnej płytki o stałym dnie 1,536 studzienki (Greiner Bio One). Za pomocą pinowego narzędzia (Wako Automation) przeniesiono 23 sztuki związków lub skrzynkę sterowniczą 11-7085. Próbki inkubowano (w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem) przez 15 minut, a następnie dodano 1 µL substratu NAD + i aldehyd propionowy (końcowe stężenia odpowiednio 1 mM i 80 µM). Płyty odwirowywano i odczytywano w trybie kinetycznym na imagerze ViewLux wyposażonym w filtry wzbudzenia 340 nm, emisji 450 nm przez 5 min. Zmiana intensywności fluorescencji w ciągu 5 minut została znormalizowana przy użyciu wolnych od enzymów i poddanych działaniu DMSO studzienek kontrolnych na każdej płytce.

test wiązania kinazy TR-FRET Lanthascreen Eu dla CDK9/cyclin K został zakupiony od ThermoFisher i wykonany zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, 4 µL mieszanki wzorcowej zawierającej 4 nM CDK9 / Cyklinę K (Invitrogen #PV4335), 2 nM biotyny anty-his Ab, 2 nM EU-streptawidyny i 10 nM roztworu znacznika kinazy 236 w buforze 1x kinazy dozowano do białych płytek wiążących Greiner 1,536-studzienki przy użyciu stacji roboczej BioRAPTR FRD. Dwadzieścia trzy nL związku i grupy kontrolnej (DMSO i LY2857785 w końcowym stężeniu 6 µM) natychmiast dostarczono do płytek testowych poprzez przeniesienie narzędzia pinowego. Płytki pozostawiono do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a fluorescencję TR-FRET mierzono następnie za pomocą czytnika wielowarstwowego PerkinElmer EnVision (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; czas opóźnienia 100 µs; czas integracji 200 µs).

oznaczenie produkcji mleczanów

komórki HEK293T hodowano w sposób opisany powyżej. Komórki przepłukano PBS, trypsynizowano i zawieszono w wolnym od czerwieni fenolowej DMEM (Life Technologies) bez suplementów. Komórki natychmiast powlekano do 1536-studzienkowych czarnych przezroczystych płyt dennych (Corning) przy 250 komórkach na studzienkę w objętości 4 µL. Do studzienek dodano kontrolę związku lub nośnika poprzez przeniesienie narzędzia pinowego i komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. do każdej studzienki dodano dwa µL mieszaniny reakcyjnej mleczanów (Biovision K607-100), a płytki przykrywano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Fluorescencję mierzono za pomocą imagera ViewLux microplate wyposażonego w filtry Ex/Em 528/598 nm.

test Aldefluoru

w celu wstępnego określenia aktywności aldh1a1 oznaczonej znakiem 86B, komórki transfekowano metodą odwrotnej transfekcji, w której 1 mL kompleksów (6 µL Lipofektaminy 2000 i 3 µg DNA) połączono z 1 mL zawiesiny ln18 (5 × 105/mL) i 100 µL / studzienkę mieszanki dozowano do czarnych, przezroczystych 96-studzienkowych płytek (Corning). Po 24 godzinach usunięto podłoże i zastąpiono 100 µL / studzienkę buforu Aldefluorowego (technologie STEMCELL) zawierającego substrat BAAA i Hoechst 33342 (ThermoFisher, końcowe stężenia odpowiednio 500 nM i 0,5 nM). Następnie dodano nośnik DMSO lub DEAB (końcowy 1 µM) i inkubowano płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić przekształcenie BAAA w BAA. Komórki przemyto i dozowano 100 µL/studzienkę buforu Aldefluorowego przed obrazowaniem na komórce IN 2200 (GE Healthcare). W przypadku testów o wysokiej przepustowości, komórki LN18 transfekowano w kolbach T75 stosując procedurę odwrotnej transfekcji, jak opisano powyżej dla testów cetsa o wysokiej przepustowości HEK293T. Po 16 godzinach komórki zebrano i platerowano (1000 komórek/studzienka/5 µL) do czarnego, optycznego przezroczystego DNA, poddano obróbce TC płytki 1536-studzienkowe (mikropłytki Aurora) za pomocą dozownika Multidrop Combi i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C. test Aldefluoru o wysokiej zawartości przeprowadzono następnie na transfekowanych komórkach LN18 lub nieprzetransfekowanym OV-90, jak opisano poprzednio31. Obrazy analizowano przy użyciu oprogramowania do analizy in Cell Investigator v1.6.2 canned Multi-Target Analysis algorithm (GE Healthcare) zgodnie z opisem.

test termicznej integralności membrany

30 000 komórek HEK293T przygotowano w 30 µL buforu CETSA zawierającego 1x koktajl inhibitora proteazy (ThermoFisher) uzupełniony 0,5% DMSO (1,5% DMSO ogółem). W przypadku eksperymentu tolerancji DMSO, DMSO dodano do DPB przy 0, 1, 2 lub 3%. Zawiesiny ogniw ogrzewano przez 3,5 minuty w temperaturze 42-74 °C, stosując 4-stopniowe odstępy, a następnie usuwano do bloku aluminiowego na mokrym lodzie. Zawiesiny komórek zmieszano z równymi częściami błękitu Trypanowego (LONZA) (=0,2% błękitu trypanowego) i policzono natychmiast za pomocą hemocytometru typu C (Incyto, Korea). Liczono trypany dodatnie (permeabilne) i ujemne (nienaruszone), przy czym N = 2 w każdej temperaturze. Dla dodatkowych linii komórkowych przygotowano milion komórek w 100 µL wolnego od czerwieni fenolowej DMEM zawierającego 1% DMSO. Komórki ogrzewano przez 3 minuty w temperaturze od 42 do 90 °C w odstępach 4 stopni, a następnie usuwano do bloku aluminiowego na mokrym lodzie. Integralność błony oceniano w sposób opisany powyżej.

PAMPA

opatentowana przez pION Inc.metoda mieszania dwuspadowego PAMPA. (Billerica, MA) użyto do pomiaru przepuszczalności związków, jak opisano poprzednio38. Związki rozcieńczono w roztworach dawcy i akceptora buforowanych do pH 7,4, a stężenie DMSO wynosiło 0,5%. Obliczenia przepuszczalności przeprowadzono przy użyciu Pion Inc. oprogramowanie.

analiza qHTS

dane z każdego testu zostały znormalizowane pod względem płytki do odpowiednich kontroli, jak opisano poprzednio39. Te same kontrole wykorzystano również do obliczenia współczynnika Z’ dla każdego testu. Procent aktywności został uzyskany przy użyciu oprogramowania wewnętrznego (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Dopasowano wszystkie krzywe stężenia-odpowiedzi i obliczono AC50 za pomocą oprogramowania GraphPad Prism; krzywe zostały sklasyfikowane zgodnie z opisem poprzednia27. Pole pod krzywą (AUC) obliczono przy użyciu reguły trapezoidalnej w celu przybliżenia pola między krzywą odpowiedzi a osią x w całym zakresie stężeń. Dla wszystkich związków w ramach eksperymentu zastosowano równoważne zakresy stężeń. Do klasyfikacji związków aktywnych wykorzystano odcięcia skuteczności wynoszące 3 σ od średniej (kontroli nośnika).