Streszczenie
izolowane napięciem kanały wapniowe typu L Cav1.2 łączą depolaryzację błonową z przejściowym wzrostem cytoplazmatycznego stężenia wolnego Ca2+, które inicjuje szereg podstawowych funkcji komórkowych, w tym skurcz mięśnia sercowego i naczyniowego, ekspresję genów, plastyczność neuronów i egzocytozę. Inaktywacja lub samoistne zakończenie prądu wapniowego przez Cav1. 2 jest kluczowym etapem regulacji tych procesów. Patofizjologiczne znaczenie tego procesu przejawia się w nadciśnieniu tętniczym, niewydolności serca, arytmii i wielu innych chorobach, w których przyspieszenie rozpadu prądu wapnia powinno stanowić korzystną funkcję. Głównym zagadnieniem pracy jest inaktywacja kanału wapniowego Cav1.2, za pośrednictwem wielu determinantów.
1. Wprowadzenie
prąd wejściowy Ca2+ () jest częstym mechanizmem przejściowego wzrostu stężenia wolnego Ca2+ w cytoplazmie wywołanego depolaryzacją komórek. Ta forma sygnalizacji Ca2+ aktywuje podstawowe procesy komórkowe, w tym skurcz serca , regulację napięcia mięśni gładkich , ekspresję genów , plastyczność synaptyczną i egzocytozę . Całkowite i szybkie zakończenie napływu Ca2+ jest pośredniczone przez skomplikowany mechanizm spontanicznej inaktywacji kanału wapniowego, który jest kluczowy dla zapobiegania przeciążeniu komórki Ca2+ podczas potencjałów działania i przywrócenia spoczynkowego sub-µM wolnego od cytoplazmy stężenia Ca2+. Artykuł skupi się na podstawach molekularnych i wielu determinantach inaktywacji kanału wapniowego Cav1.2.
2. Cav1.2: wyzwania i rozwiązania
2.1. Złożoność molekularna
kanał wapniowy Cav1.2 jest kompleksem oligomerycznym złożonym z podjednostek A1C, α2δ i β. Porów kanału jonowego tworzy peptyd A1C (Fig. 1), który jest kodowany przez gen CACNA1C. Pomocnicze podjednostki β i α2δ są niezbędne do ekspresji funkcjonalnej i kierowania błoną plazmatyczną (PM) do kanału . Występują w wielu genomowych izoformach generowanych przez cztery geny CACNB (CACNB1–4) i trzy geny cacna2d (CACNA2D1–3). Wszystkie trzy podjednostki podlegają alternatywnemu splicingowi. Dodając do złożoności organizacji molekularnej Cav1. 2, podjednostki β mają tendencję do oligomeryzacji . W sumie, zmienność genomowa, alternatywne splicing i hetero-oligomeryzacja generują mnóstwo wariantów splicingu Cav1 .2, które są wyrażone w komórkach w sposób zależny od gatunku, tkanki i rozwoju, podczas gdy zmiana ich drobnej równowagi może mieć znaczące konsekwencje patofizjologiczne.
Topologia Transbłonowa podjednostki α 1C. Aby zilustrować miejsca różnorodności molekularnej, Sekwencja polipeptydu jest schematycznie segmentowana zgodnie z mapą genomową CACNA1C, a odpowiadające im egzony niezmiennicze (Czarne) i alternatywne (niebieskie) są nakreślone czarnymi paskami i ponumerowane (1-50). Uważa się, że cztery regiony homologii (I–IV), każdy złożony z 6 segmentów transmembrany (numerowanych), są złożone wokół centralnego poru. domena interakcji α (AID) konstytutywnego miejsca wiązania β jest pokazana na Zielono. Motywy LA i IQ (czerwony) stanowią domenę wiążącą kalmodulinę (CBD).
2.2. Wyzwania w wyborze komórki gospodarza
naturalnie występująca różnorodność Cav1.2 komplikuje interpretację danych uzyskanych z komórek natywnych, nie mówiąc już o danych jednokanałowych. Leży to u podstaw znaczenia badań Cav1.2 w rekombinowanych systemach ekspresji, w których wstępnie zdefiniowano skład cząsteczkowy kanału i strukturę jego składników. Jednak to eksperymentalne podejście napotkało poważny problem wyboru odpowiedniej komórki gospodarza.
większość badań kanałów wapniowych przeprowadzono z wykorzystaniem komórek HEK293. Komórki te zapewniają wysoką wydajność ekspresji rekombinowanych kanałów Ca2+, ale niestety zawierają endogenne kanały wapniowe wykazujące prądy Ca2+ do 3 pA / pF . Tak więc komórki HEK293 pozwalają na odpowiednie badanie rekombinowanych kanałów Ca2+ tylko wtedy, gdy amplituda prądu jest wystarczająco duża, aby zignorować udział kanałów endogennych. Prawidłowa ocena czynnościowych determinantów kanałów Ca2+ wymaga jednak użycia komórek gospodarza, które są całkowicie wolne od endogennych podjednostek kanału Ca2+. Komórki COS1 lub COS7 dobrze pasują do tego wymogu, ponieważ nie generują znaczącego prądu wapniowego, nie zawierają endogennych podjednostek kanału Ca2+ ani ich prekursorów i nie wykazują indukcji endogennych podjednostek Cav1.2 w odpowiedzi na ekspresję rekombinowanych . Parametry kinetyki i zależność napięciowa aktywacji i inaktywacji prądów kanału Cav1.2 mierzonych w komórkach COS1 są zgodne z danymi uzyskanymi w innych układach ekspresji. Istotną zaletą komórek COS jest ich stosunkowo wolna szybkość podziału, która pozwala na lepszą kontrolę nad efektywnością ekspresji i montażu podjednostek kanału Cav1. 2 o różnej wielkości.
2.3. Problems of Fluorescent Labeling and Measurement
fuzja fluoroforów podobnych do GFP do n-i / lub C – końca rekombinowanego A1C lub do n-końca β nie zmienia znacząco właściwości elektrofizjologicznych wyrażonych kanałów, umożliwia zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej i FRET (fluorescencyjny transfer energii rezonansowej) do badania dystrybucji subkomórkowej i montażu Cav1.2, jak również skomplikowanych aspektów architektury molekularnej i dynamiki kanału. Kanał zachowuje główne właściwości elektrofizjologiczne bez zmian, gdy sekwencja C-końcowa A1C zakodowana przez eksony dystalne 46-50 (Fig.1,reszt 1833-2138 w a1C, 77) zostaje zastąpiona przez ECFP. Jednak a1C skondensowany przez N-lub / I C-termini z EYFP jest bardzo wrażliwy na fotobluszczanie, które nieodwracalnie go dezaktywuje. Znany jako fluorophore-assisted Light inactivation (fala), ta interesująca właściwość ogranicza zastosowanie fotobleachingu akceptora do pomiarów progu w Cav1.2 z powodu niepewności w stanie funkcjonalnym kanału . Jednak analiza ratiometryczna skorygowanego progu między fluoroforami, połączonymi z ogonami podjednostek A1C i / lub β, odzwierciedla odwracalne zależne od stanu strukturalne przearanżowania kanału wywołane zmianami napięcia przezbłonowego pod zaciskiem łaty .
2.4. Rekombinowany Cav1. 2: czego potrzebuje do ekspresji funkcjonalnej i jak się pojawia?
Typowe właściwości rekombinowanego Cav1.2 typu „dzikiego” przedstawiono na fig.2(a) na przykładzie wszechobecnej ludzkiej izoformy A1C,77 (GenBank no. z34815). Gdy znakowany EYFP A1C ulegał ekspresji w samych komórkach COS1, znakowane fluorescencyjnie białko kanału rozprowadzano dyfuzyjnie po cytoplazmie i nie generowało mierzalnego prądu wapniowego (fig. 2 (a), panel a). Analiza ilościowa rozkładu A1C między PM a cytoplazmą (fig. 2(B)) potwierdziła brak znaczącego PM ukierunkowanego przez A1C niezależnie od obecności α2δ (bars a i b). Ekspresja Cavß w przypadku braku α2δ stymulowała PM ukierunkowanie na a1C, ale kanał pozostawał cichy (Rys. 2 (a), panel c), chyba że α2δ była współistniejąca (panel d). Tak więc podjednostki β i α2δ są wystarczające dla kanału funkcjonalnego; w tych warunkach doświadczalnych podjednostki β stymulują celowanie PM w kompleks kanałów i, w obecności α2δ, ułatwiają bramkowanie napięciowe kanału Cav1.2.
kształt i wygląd szczytowego prądu wapnia pokazanego na fig.2(a) (panel d) jest dość typowy dla modulowanego β2 Cav1 .2. Jego główne cechy obejmują stosunkowo powolną szybkość rozpadu i dużą część utrzymującego się końca impulsu depolaryzującego . Oczywiste jest, że podczas długotrwałego działania takie właściwości mogą prowadzić do patogennego przeciążenia komórki wapniem, jeśli nie jest ona zrównoważona przez solidne mechanizmy kompensacyjne. Była to ostateczna rola Cav1.2 w określeniu czasu trwania potencjału czynnościowego w komórkach serca, który wywołał badania i rozwój blokerów kanału wapniowego, klasy leków, które do tej pory mają miliard dolarów rynku. To właśnie ta rola Cav1.2 stymuluje obecne zainteresowanie identyfikacją molekularnych determinantów inaktywacji Cav1.2 w nadziei na znalezienie bardziej specyficznych i skuteczniejszych leków.
2.5. Na koniec komplikacja: klastrowanie Cav1.2
miocyt jednokomorowy zawiera ~300 000 kanałów Cav1.2, ale tylko ~3% kanałów jest otwartych w szczycie . Wbrew powszechnemu przekonaniu, kanały Cav1. 2 nie są równomiernie rozmieszczone na błonie plazmowej. W macierzystych komórkach neuronalnych i mięśnia sercowego tworzą duże skupiska. Jednocząsteczkowe obrazowanie funkcjonalnych rekombinowanych kanałów eyfpn-A1C/ß2a/α2δ wyrażonych w komórkach HEK293 ujawniło skupiska złożone z ~40 kanałów, które były ruchome w błonie osocza . Zarówno spektroskopia korelacji fluorescencji, jak i odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach fotobleczniczych dały boczną stałą dyfuzji µm2/s. funkcjonalne znaczenie mobilności klastrów Cav1.2 nie jest jasne. Uważa się, że w komórkach mięśnia sercowego taka mobilność może być ograniczona przez interakcje z innymi białkami, na przykład receptorami ryanodine . Wielkość klastrów Cav1. 2 i ich Gęstość właściwa w błonie osocza zależą od rodzaju wyrażonej podjednostki β . Odległość między końcami sąsiednich podjednostek A1C waha się od 67 Å z neuronalnym/sercowym ß1b do 79 Å z naczyniowym β3. Największą gęstość klastrów Cav1.2 w błonie osocza i najmniejszą wielkość klastrów obserwowano przy obecności ß1b. Wgląd w mechanizmy molekularne definiujące architekturę i właściwości klastrów Cav1.2 jest ważny dla lepszego zrozumienia patofizjologii sprzężenia między aktywnością Cav1.2 a indukowanymi odpowiedziami w transdukcji sygnału Ca2+.
3. Inaktywacja zależna od napięcia i Ca2+kanału wapniowego Cav1.2
w przypadku kanałów wapniowych Cav1.2, dwa różne mechanizmy kontrolują aktualną inaktywację Ca2+. Jeden mechanizm jest napędzany przez jony Ca2+ po cytoplazmatycznej stronie błony plazmatycznej, podczas gdy drugi zależy od napięcia przezbłonowego. Eksperymentalnie, zastąpienie Ca2+ Ba2+ jako nośnika ładunku eliminuje inaktywację zależną od Ca2+(CDI), tak że przewodzące BA2+kanały wapniowe inaktywują się w sposób zależny od napięcia przez mechanizmy szybkie (FI) i wolne (SI). Te trzy mechanizmy inaktywacji, FI, SI i CDI, oraz ich główne determinanty przedstawiono na rysunku 3.
3.1. Inaktywacja zależna od Ca2+i domena wiążąca Kalmodulinę a1C
istnieje kilka różnych determinantów CDI, ale dopiero w 1997 r.miejsce wykrywania Ca2+CDI zostało zawężone do odcinka 80-aminokwasowej C-końcowej sekwencji A1C kodowanej przez eksony 40-42 (fig. 2) oznaczonego czerwonym blokiem na fig. 3(a) (panel a). Naturalnie występująca zmiana splotu w tym regionie w a1C, 86(Fig.3 (B)) całkowicie hamowała CDI, jak wynika z braku opóźnienia prądu z Ba2+ jako nośnikiem ładunku (panel c, czarny ślad) w porównaniu z (czerwony ślad). Inną charakterystyczną cechą hamowanego CDI był brak zależności wielkości prądu od napięcia (Rysunek 3 (B), panel d, symbole otwarte), która pozostaje w przeciwieństwie do zależności kształtu U stałej czasowej szybkiej inaktywacji () od potencjału membrany w dzikim typie Cav1.2 (patrz rysunek 3(a), panel d). Dwie odrębne sekwencje, L I K, zidentyfikowano w tym 80-aminokwasowym odcinku, którego mutacje a1C,86-podobne do mutacji dzikiego typu A1C odpowiadają tym samym cechom charakterystycznym, co sugeruje istnienie dwóch sąsiednich czujników CDI. Jeden z nich został opisany w regionie K jako motyw IQ wiążący kalmodulinę (CaM -), a później związek motywu IQ z CDI jako funkcjonalne miejsce wiązania Ca2+-cam został potwierdzony w trzech niezależnych badaniach przez zastosowanie mutantów CaM pozbawionych powinowactwa do Ca2+. Odpowiednio motyw LA został połączony z CDI jako miejsce wiązania apo-CaM obdarzone stanem spoczynkowym kanału. Pojedyncza cząsteczka CaM przywiązana do tej zależnej od Ca2+domeny cam-binding (CBD )A1C jest głównym czujnikiem Ca2+ kanału.
zmiana splotu A1c w regionie CBD A1C,86 nie tylko całkowicie hamuje CDI, ale także usuwa SI (Fig.3(B), panel c) i pozbawia kanał różnej czułości na modulację podjednostek β (Fig. 3(B), panel e) pomimo faktu,że β pozostaje związane z a1C, 86 (Fig. 3(B), panel b). Oznacza to, że wszystkie trzy właściwości kanału—CDI, SI i β-subunit modulation—są ze sobą powiązane .
3.2. Powolna inaktywacja
przedstawiono szereg dowodów, że aminokwasy ograniczone do dystalnej części segmentów S6 w a1C odgrywają ważną rolę w SI . Systematyczne badania tego regionu nakreśliły „roczny wyznacznik powolnej inaktywacji” (ADSI)jako strukturę złożoną z czterech wysoce konserwowanych aminokwasów z czterech segmentów przezbłonowych S6, stanowiących cytoplazmatyczny koniec porów (Fig. 3 (a), panel a). Ich jednoczesna mutacja (S405I w IS6, A752T w IIS6, V1165T w IIIS6 i I1475T w IVS6) generuje kanał A1C, IS-IV. Analiza bieżącej kinetyki kanału A1C, IS-IV wykazała ogromne przyspieszenie składnika szybko dezaktywującego (≤10 ms), który stanowi około 50% całkowitej (lub ) amplitudy. Powolna inaktywacja zależna od napięcia a1C, IS-IV jest całkowicie zahamowana, a kanał pozostaje przewodzący przez czas depolaryzacji. Wymiana Ca2+ na Ba2+ jako nośnika ładunku (panel c) nie zmieniła znacząco tego wzorca inaktywacji, natomiast analiza zależności napięciowej dla składnika inaktywującego przez A1C,kanał IS-IV (panel d) potwierdziła brak CDI. Zastąpienie ß1a ß2a (panel e) nie zmieniło inaktywacji A1C,prąd kanału IS-IV sugeruje brak różnicowej modulacji podjednostek β, podczas gdy analiza koimmunoprecypitacji (panel b) dostarczyła bezpośrednich dowodów na związek między A1C,IS-IV i β.
łącznie, wyniki przedstawione na fig.3 sugerują, że istnieje krzyżowa rozmowa między ADSI, CBD i β, poparta bezpośrednimi interakcjami między nimi i / lub specyficznym fałdowaniem konformacyjnym składników wiązki polipeptydów leżących u podstaw porów. Rzeczywiście, zarówno interakcja β z CBD, jak i znaczenie konformacji funkcjonalnej zostały bezpośrednio wykazane w żywych komórkach wykazujących rekombinację Cav1.2.
3.3. Rola A1c C-tail Folding
ilościowa zależna od napięcia mikroskopia progu w połączeniu z zaciskiem patch w żywej komórce wykazała, że podjednostka A1C C-terminal tail podlega odwracalnym przegrupowaniom konformacyjnym bramkowanym napięciem . Zakotwiczenie ogona C a1C z wewnętrzną ulotką błony plazmatycznej za pośrednictwem domeny homologowej pleckstrina (PH) połączonej z końcem C a1C (A1c -) zniosło tę przegrupowanie konformacyjne i zahamowało zarówno SI,jak i CDI (Fig.4(A)) w sposób bardzo podobny do obserwowanego w przypadku A1C, IS-IV (Fig. 3(C)). Ta modyfikacja ograniczająca ruchliwość końcówki karboksylowej A1C miała znaczący wpływ na transdukcję sygnału Ca2+. Zależna od Kreb aktywacja transkrypcyjna związana z aktywnością Cav1. 2 została całkowicie stłumiona pomimo silnego generowanego przez kanał „C-zakotwiczony” w odpowiedzi na depolaryzację. Uwolnienie ogona C a1C przez aktywację hydrolizy PIP2 po aktywacji fosfolipazy C w pełni przywraca wszystkie te niedobory funkcji, w tym SI, CDI i skuteczne sprzęganie z transkrypcją zależną od CREB . W związku z tym kluczowe dla inaktywacji jest specyficzne funkcjonalne składanie ogona C-terminala A1c. Ma kluczowe znaczenie dla transdukcji sygnału, ponieważ jest on przeznaczony do klatki przenikającego Ca2+ w cam dołączonym do CBD i skutecznego przenoszenia tego Ca2+ w klatce do celów sygnalizacyjnych związanych z transkrypcją zależną od Kreb lub skurczem mięśnia sercowego . Przede wszystkim funkcja ta występuje w ścisłej koordynacji z bodźcami zewnątrzkomórkowymi aktywującymi kanał. Pod względem transdukcji sygnału, SI jest blokadą wewnątrz kanału, która jest uwalniana przez przenikający Ca2+, aby przyspieszyć jego zamknięcie i zainicjować ruch ogona C-terminala .
3.4. Rola N-końca A1C
wszystkie funkcje wymienione powyżej zależą również od integralności N-końca A1C. Właściwości inaktywacyjne rekombinowanego kanału A1C/β/α2δ nie są w znacznym stopniu zmienione przez zmiany strukturalne proksymalnej części N-ogona A1c, na przykład przez fuzję fluorescencyjnego białka, domenę PH lub przez alternatywne splatanie eksonów 1 / 1A generujących długą izoformę A1C . Pierwsza funkcjonalna analiza wpływu częściowej delecji N-końca A1c wykazała, że bierze ona udział w inaktywacji, podczas gdy β zapobiega hamowaniu kanału przez n-ogon. Używając mikroskopii FRET połączonej z patch clamp, odkryliśmy, że inaktywacja powoduje silną wzajemną reorientację A1C i ß1a NH2-termini, ale ich odległość względem błony plazmatycznej nie ulega znaczącej zmianie . Ten względny brak mobilności jest nadawany przez β w sposób ułatwiający reakcję kanału na bramkowanie napięciowe. Eksperymenty nad odłączeniem podjednostki A1c N-końcowego ogona od regulacji kanału przeprowadzono przy braku β. Zakotwiczenie N-ogona A1c w wewnętrznej części błony plazmatycznej za pomocą przyłączonej domeny PH stworzyło warunki, w których PHN-A1C i α2δ były wystarczające do wytworzenia silnego prądu wewnętrznego (Fig. 4 (B)). Kanał ten jest jednak pozbawiony CDI i jakiejkolwiek inaktywacji zależnej od napięcia. Rzeczywiście, ani prąd Ba2+, ani prąd Ca2+ nie wykazywały znacznego zaniku (patrz: nakładające się ślady). Uwalnianie N-ogona A1C po hydrolizie PIP2 przez aktywację fosfolipazy C całkowicie hamowało kanał z niedoborem β . Podobne właściwości, z wyjątkiem znacznie wolniejszej aktywacji prądu, obserwowano po delecji całego (ale 4 aminokwasów) N-końcowego ogona a1C (Fig. 4 (C)). W przypadku obu rodzajów rozłączenia N-końcowego ogona A1C-czy to poprzez usunięcie, czy przez zakotwiczenie PM-opóźnienie w aktywacji prądu całej komórki wydaje się być związane z wydłużeniem pierwszego opóźnienia. Nagrania jednokanałowe ujawniły, że delecja N-ogona zasadniczo ustabilizowała stan otwarty kanału ΔN-A1C / α2δ, który wykazywał dłuższe otwory podczas długotrwałej depolaryzacji .
Tak więc, CDI jest pośredniczony przez determinanty CBD A1C C-tail, przez ADSI w regionie porów cytoplazmatycznych i przez fałdowanie A1C C – i N-termini. Kalmodulina integruje te determinanty, zapewniając przełącznik zależny od Ca2+, który kończy powolną inaktywację, uwalnia ogon C a1C i wysyła skojarzoną Ca2+ / kalmodulinę działającą jako aktywujący bodziec transdukcji sygnału Ca2+.
3.5. Ekspresja i inaktywacja Cav1.2 przy braku β i α2δ
czy podjednostki β i α2δ są niezbędne do ekspresji funkcjonalnej kanału Cav1. 2? Analiza wpływu egzogennego CaM (CaMex) na ekspresję i właściwości Cav1.2 przy braku β lub α2δ wyraźnie wykazała, że β ani α2δ nie są niezbędne. Nadekspresja CaMex tylko nieznacznie modyfikuje bramkowanie napięcia kanału A1C / ß2d / α2δ poprzez przesunięcie zależności napięcia aktywacji i inaktywacji w kierunku bardziej ujemnych potencjałów, ułatwiając (ale nie przyspieszając) inaktywację i zwiększając gęstość około 2-krotnie . CDI zostaje zachowany, jak wynika z efektu zastąpienia Ca2+ Ba2+ jako nośnika ładunku, który znacznie wydłużył czas dezaktywacji prądu (rys. 5 lit.a)). Nowe zrozumienie ról β i α2δ pochodzi z odkrycia, że CaMex renderuje ekspresję i aktywność kanału a1C przy braku β (Fig. 5 (B)) lub α2δ(Fig.5 (C)), ale nie obu tych pomocniczych podjednostek. Chociaż CaMex jest strukturalnie niezwiązany z β i α2δ, wspiera handel, CDI i bramkowanie kanałów. Analiza ilościowa wykazała, że CaMex nie stymulował redystrybucji A1C w PM przez cytoplazmę, ale znacząco zwiększał działanie błon osoczowych ukierunkowanych na kanały A1C/α2δ. Z drugiej strony, CaMex nie zwiększał względnej dystrybucji kanałów A1C/ß2d i A1C/ß2d / α2δ w błonie osocza przez cytoplazmę. Tak więc, w zależności od obecnej podjednostki pomocniczej, aktywność kanału A1C/ß2d i A1c/α2δ jest pod kontrolą różnych mechanizmów. Pomimo tego, kanały wspomagane przez CaMex wykazują dość podobne właściwości, w tym znacznie wolniejszą kinetykę inaktywacji prądu wapniowego i silne przesunięcie zależności napięciowej aktywacji i inaktywacji w kierunku bardziej ujemnych potencjałów. Podobnie jak w przypadku konwencjonalnych kanałów A1C/ß2d / α2δ, kanały te zachowują CDI i wysoką wrażliwość na antagonistów kanału wapniowego dihydropirydyny . Jednak tylko kanał A1C / β / CaMex wykazuje ułatwianie prądu wapnia przez silną prepulse depolaryzacji (dane nie pokazane).
ponieważ cam związany z CBD jest zaangażowany w CDI, oczywiste jest, że działanie CaMex jest pośredniczone przez różne miejsca wiązania CaM. Jeden z potencjalnych kandydatów takiego miejsca jest obecny w dystalnej części A1c N-końcowego ogona . Okaże się, czy ta strona rzeczywiście odgrywa rolę integrującą w pakiecie regulacyjnym kilku determinantów molekularnych wspierających inaktywację Cav1.2. Inna możliwość ogranicza rolę CaMex do aktywacji cichego Cav1.2 w dużych skupiskach, gdzie ograniczona lokalna dostępność CaM może być przyczyną niskiej aktywności ułamkowej opisanej w punkcie 2.5. Niezależnie od mechanizmów związanych z regulacją Cav1.2 przez CaM, wydaje się, że mają one niewielkie praktyczne znaczenie dla stosowania w medycynie w tym czasie, dokładnie dlatego, że CaM jest wszechobecnym i wielofunkcyjnym peptydem, który reguluje wiele innych funkcji komórkowych, podczas gdy jego obecność w Cav1.2 jest niezbędna dla CDI.
4. β-Subunit Modulation of Cav1.2
niezwykła zmienność molekularna podjednostek β, odzwierciedlona w zmienionych właściwościach inaktywacji różnicowo modulowanego Cav1.2 , zilustrowana na fig.3(a) (panel e), stwarza nowe możliwości rozwoju innowacyjnych podejść do leczenia chorób związanych z niewłaściwym stosowaniem Ca2+. Kilka ostatnich obserwacji stanowi podstawę dla takiego optymistycznego poglądu. Po pierwsze, podjednostki β wykazują tendencję do tworzenia homo-i hetero-oligomerów, co zostało bezpośrednio wykazane za pomocą różnych technik biochemicznych zarówno w komórkach natywnych, jak i w rekombinowanym systemie ekspresji. Podczas gdy zwiększenie homooligomeryzacji β znacznie zwiększa gęstość, heterooligomeryzacja wariantów splicingu β2 z innymi podjednostkami β może również zmienić kinetykę zależności napięcia i inaktywacji Cav1 .2. Β-oligomeryzacja jest pośredniczona przez kilka determinantów molekularnych i dlatego wymaga wielu interwencji, Aby można było zarządzać, na przykład w przypadku patogennej nadekspresji β2. Wydaje się jednak, że bardziej realne jest samo celowanie w β2; wyznacznik molekularny β2-specyficznej powolnej i niekompletnej inaktywacji (patrz rysunek 2(a), panel d) zidentyfikowano jako 40-aminokwasowy wyznacznik C-końcowy (ß2CED) obecny we wszystkich 7 znanych naturalnie występujących wariantach splicingu β2. Odsprzęgnięcie jego niezależnej od Ca2+ i CaM interakcji z CBD (Fig. 3 (a), panel a) odzyskuje właściwości inaktywacji charakterystyczne dla modulowanego ß1b/β3 Cav1.2 wykazującego szybką i całkowitą inaktywację , jak wykazano w doświadczeniach delecji. Moim zdaniem takie selektywne odłączanie ß2CED od wiązania do jego receptora w CBD jest nową atrakcyjną strategią zarządzania przeciążeniem Ca2+, ponieważ inne podjednostki β nie mają wpływu. Ponadto zachowana zostanie rozmowa krzyżowa pomiędzy Cav1.2 a najbliższą docelową kinazą białkową II zależną od Ca2+/CaM.
5. Wnioski
Ten artykuł wykazał, że wiemy, jak przyspieszyć inaktywację Cav1.2 do mniej niż 10 ms (ryc. 3(C)), całkowicie pozbawić go inaktywacji (ryc. 4(B) i 4(C)) lub wyeliminować zależność jego ekspresji od β lub α2δ bez znaczących konsekwencji dla inaktywacji. Nakreśliliśmy ostateczne role termini A1C i CaM w inaktywacji, a jednak żadne z tych badań nie zbliżyło nas do ostatecznego celu, jakim jest zarządzanie niewłaściwą obsługą wapnia związaną z Cav1.2 z wyjątkiem starych i, niestety, niezbyt selektywnych blokerów kanału wapniowego. Jedynym nowym możliwym celem jest patogenna modulacja β2 Cav1.2, w której dochodzi do interakcji efektor-receptor.
pod względem biologii molekularnej Cav1.2 jest z pewnością jednym z najbardziej skomplikowanych systemów regulacyjnych znanych. Niezwykła różnorodność molekularna każdego z Cav1.2 składniki powodują powstanie wielu genetycznych / splicowych wariantów kanału, które podlegają segregacji na duże i zróżnicowane klastry oraz ciągłej zmianie funkcjonalnej poprzez homo – i heteroligomeryzację β i innych składników sygnałowych, nie mówiąc o gatunkach, tkankach i zmienności rozwojowej. Jesteśmy zaskoczeni nadmiarowością właściwości wielu izoform Cav1 .2 i jesteśmy jeszcze bardziej zaskoczeni, gdy niektóre z nich, wykazujące tylko „konwencjonalne” właściwości elektrofizjologiczne, okazują się być związane z chorobą. Szukając wyjaśnienia, nasz wgląd nie powinien być intuicyjnie skupiony tylko na charakterystyce zależności prądowo-napięciowej wapnia, amplitudzie i czasie trwania. Odpowiedź końcowa, taka jak przestrzenna i czasowa organizacja zdarzeń sygnałowych CREB związanych ze specyficzną izoformą Cav1.2 i jej konkurencja z innymi (np. zależnymi od cAMP) mechanizmami sygnałowymi lub innymi obecnymi izoformami Cav1.2, może dostarczyć nowych pomysłów i otworzyć nowe granice dla badania roli poszczególnych wariantów splotu Cav1.2 w normalnych i chorych komórkach i tkankach.
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
