wyniki i dyskusja

Wcześniejsze badania (5, 11, 17, 19) opisywały rolę genów lb w procesach specyfikacji losów komórek. W Drosophila, gain and loss of function experiments ujawnili że geny lb określają tożsamość podgrupy komórek sercowych i mięśniowych i że ta funkcja wynika z wysoce ograniczonej, specyficznej dla linii mezodermalnej ekspresji lb. Ponadto dokładna analiza lbe (rys. 1) i wzorzec ekspresji lbl (dane nie pokazane) na początku fuzji serca ujawnił trójkątne skupisko komórek lb-dodatnich położone tuż przed wierzchołkiem serca (Fig. 1 A, grot). Aby uzyskać dokładniejszy opis położenia tych komórek w odniesieniu do gruczołów limfatycznych związanych z sercem i gruczołów pierścieniowych, mamy podwójnie znakowane zarodki dla LB i specyficznych markerów gruczołów (rys. 1 B I C). Prekursory gruczołu limfatycznego ujawniły się przeciwciałami przeciw wężowi po obu stronach końcówki serca (rys. 1B) ale nie pokrywają się z obszarem oznaczonym przez lb. Podobnie, podwójne zabarwienie linii pułapki wzmacniającej L (2) 1857, które wyraźnie wyraża LacZ w zarodkowym zawiązku gruczołu pierścieniowego (15), pokazuje, że komórki lb-dodatnie znajdują się bezpośrednio przed gruczołem pierścieniowym (Fig. 1C).

aby określić pochodzenie komórek lb-dodatnich związanych z sercem, śledziliśmy ekspresję lb w przedniej części zarodków od wczesnego stadium. Na etapach embrionalnych poprzedzających fuzję serca, nie byliśmy w stanie wykryć ekspresji lb związanej z przednią częścią dwóch zawiązków serca. Odkrycie to sugerowało, że komórki lb-dodatnie nie są pierwotnie określone w obszarze serca i mogą reprezentować komórki innego pochodzenia, które stają się związane z komórkami serca w późniejszych stadiach. Rzeczywiście, w późnym stadium 11, grupa komórek lb-dodatnich w naskórku głowy grzbietowej (Fig. 2A) można wykryć. Komórki te zaczynają inwaginować nieco później i tworzą wiodącą część złożonego naskórka (rys. 2b). Położenie i czas tej inwaginacji przypominają fałdowanie naskórka głowy, dając początek tylnej części torebki grzbietowej zwanej woreczkiem czołowym (20). Aby sprawdzić, czy komórki wyrażające lb odpowiadają końcówce worka czołowego, użyliśmy linii escargot-LacZ N516, która wyraża lacZ w komórkach tworzących torebkę grzbietową (20). Podwójne zabrudzenia etapu 14 (rys. 2B) i etap 16 (rys. 2C) zarodki N516 wykorzystujące przeciwciała anty-Lbe i anty-β-galaktozydazy wyraźnie wykazują, że LB i esg współwystępują w końcówce invaginującego worka czołowego. Grzbietowy widok embrionalnego regionu głowy (rys. 2D) potwierdza, że komórki te wykazują taki sam układ trójkątny jak komórki lb-dodatnie związane z sercem pokazane wcześniej (porównaj Fig. 2D i 1).

zebrane razem dane wskazują, że komórki wyrażające lb leżące bezpośrednio przed sercem pochodzą z naskórka głowy i migrują w kierunku czubka serca podczas inwazji worka czołowego. Ta obserwacja rodzi dodatkowe pytanie dotyczące roli genów lb w specyfikacji tej grupy komórek. Wcześniej wykazaliśmy, że geny lb odgrywają ważną rolę w specyfikacji podgrupy prekursorów serca i mięśni (11, 19). Analiza funkcjonalna myszy lb ortholog Lbx1 genu (21, 22) ujawniła również jego implikację w kontroli specyfikacji i ukierunkowanej migracji prekursorów mięśni wyrostka robaczkowego. Ponadto Najnowsze dane wskazują, że Lbx1 u myszy określa subpopulację komórek grzebienia nerwowego serca niezbędnych do prawidłowego rozwoju serca (23).

aby sprawdzić, czy Drosophila lb są wymagane do specyfikacji komórek związanych z sercem, przeanalizowaliśmy tworzenie torebek grzbietowych w zarodkach z niedoborem obu genów lb (patrz materiały i metody). Wykorzystując sondę esg RNA jako marker, wykazaliśmy, że w zarodkach lbdef ekspresja esg w dalszej części worka czołowego, w którym znajdują się komórki związane z sercem, jest nieobecna (porównaj rys. 2 E i G z F I H). Ponadto, Jak pokazują grzbietowo-boczne widoki zarodków etapu 14 (rys. 2 G I H), odległość między woreczkiem żółtkowym a najbardziej dystalnymi komórkami esg-dodatnimi jest znacznie powiększona u zarodków z niedoborem lb. To odkrycie, poparte obserwacją optyki Nomarskiego, ujawniające, że tylna część worka czołowego ma zmienioną morfologię (dane nie pokazane), wskazywało na to, że Hance nie są określone lub nie migrują prawidłowo w zarodkach lbdef. Ponieważ analizowany niedobór obejmuje również sąsiednie geny bap i C15, zbadaliśmy tworzenie się przedniego worka w zmutowanych zarodkach BAP i zarodkach Arm-GAL4>UAS-rnaic15. Zarówno w embrionach bap208, jak i rnaic15, worek czołowy wybarwiony esg miał prawidłowy kształt (DANE nie zostały pokazane), wykluczając tym samym wpływ genów BAP i C15 na różnicowanie lub migrację komórek związanych z sercem. Dane te silnie sugerują, że nieprawidłowy wzór dystalnych esg-dodatnich przednich komórek sac w zarodkach lbdef wynika z utraty funkcji lb.

mezodermalne i Niemesodermalne składniki zaangażowane w kształtowanie regionu odpływu serca. Nasze eksperymenty immunologiczne wykazały, że komórki lb-dodatnie zakotwiczające serce leżą bardzo blisko kardioblastów wyrażających lb (Fig. 1). Ponieważ większość kardioblastów przednich wykazuje ekspresję cyny (5), embriony podwójnie znakowane przeciwciałami anty-cyny i anty-Lbe wizualizują odpowiednie pozycje końcówki serca i najbardziej dystalnej części worka czołowego. Co zaskakujące, te dwie struktury pokrywają się o około trzy długości komórek, gdy obserwuje się je od strony grzbietowej (Fig. 3A). Ponadto, boczny widok konfokalny przedniego obszaru serca (rys. 3b) wyraźnie pokazuje, że czubek worka czołowego, który składa się z niemesodermalnych komórek lb-wyrażających ekspresję, jest bezpośrednio przytwierdzony do serca. Dokładniej, zaobserwowaliśmy, że przednia część aorty (częściowo pokrywająca się z komórkami lb związanymi z sercem) wygina się brzusznie, tworząc morfologicznie odrębny obszar odpowiadający regionowi odpływu serca. Ta morfologia sugeruje, że może istnieć dodatkowy składnik komórkowy sprzyjający zagięciu brzusznemu serca. Postanowiliśmy poszukać obecności mięśnia brzusznie położonego przyczepionego do czubka aorty. Widok boczny zarodka, podwójnie zabarwiony na łańcuch ciężki miozyny (Myo)i Lbe (rys. 3C), wyraźnie pokazuje, że odpływ serca jest rzeczywiście przymocowany do mięśnia głowy, który proponujemy nazwać COM. Dokładniejsza analiza sekcji konfokalnych wykazała, że zawiązek serca jest w rzeczywistości połączony dwoma ściśle leżącymi Komami, które rozciągają się od przełyku i przyłączają się do obu stron obszaru wypływu serca (otwarte groty strzał na Fig. 3D). O dziwo, owe embrionalne mięśnie głowy nie zostały wcześniej opisane naszej wiedzy. Brak opublikowanej dokumentacji dla COMs wynika prawdopodobnie z faktu, że morfologia i pochodzenie mięśni głowy somatycznej w zarodku Drosophila nie były systematycznie analizowane. Korzystając z jedynego dostępnego opisu muskulatury głowy dorosłych, wykonanego przez Millera (24), nie byliśmy w stanie zidentyfikować mięśni głowy dorosłych, które mogłyby odpowiadać komórkom embrionalnym przedstawionym tutaj.

Co ciekawe, podwójne zabarwienie Myo/Lbe ujawniło również, że Niewesodermalne Hance są przyłączone do obu komórek serca (rys. 3E) i COMs (rys. 3D). Ponieważ Hance wyrażają lb i kojarzą się wybiórczo z najbardziej przednią parą lb-dodatnią komórek serca (Fig. 3e i 4 D–F), spekulujemy, że ustanowienie tego kontaktu może obejmować interakcje komórek typu homofilowego. Badanie cząsteczek adhezyjnych komórek biorących udział w sygnalizacji międzykomórkowej między komórkami homotypowymi (25, 26) pomoże w określeniu mechanizmów leżących u podstaw ustanowienia łączności między komórkami wykazującymi ekspresję lb a komórkami serca.

aby zwizualizować przestrzenny układ końcówki aorty, Koms i LB-wyrażających Hanc, użyliśmy wspomaganej komputerowo analizy 3D i rekonstrukcji skanów konfokalnych. To podejście w pełni potwierdziło nasze obserwacje, ujawniając, że oprócz Hancsa region wypływu serca jest ściśle związany z parą Komów (rys. 3F). Mięśnie te nakładają się na czubek serca z obu stron i przyczyniają się do jego zgięcia brzusznego.

aby zrozumieć, w jaki sposób kontakt między sercem, COMs i HANCs jest nawiązywany podczas rozwoju, monitorowaliśmy te struktury we wczesnym i późnym stadium zarodków 14 (rys. 3 G I H). Nasze dane wskazują, że zarówno lb-dodatnie komórki serca, jak i LB-wyrażające Hanc przyciągają rozszerzające się komórki.

kontakt między Koms i HANCs wydaje się nieco poprzedzać przywiązanie COM do czubka aorty i jest widoczny na początku etapu 14 (rys. 3G). W tym czasie filopodia COM rozciągają się w kierunku lb-dodatnich komórek serca (rys. 3G) i zostają ostatecznie przyłączone do tych komórek w późnym stadium 14 na początku fuzji serca (Fig. 3H). Ponieważ Koms wchodzi w kontakt z komórkami serca i HANCs zanim HANCs przywiązuje się do serca, spekulujemy, że COMs, oprócz zginania czubka serca, ułatwia jego kontakt z HANCs. Nawiązanie kontaktu między mięśniami somatycznymi a ich miejscami przyłączenia naskórka (komórkami ścięgien) zostało szeroko zbadane (27), ujawniając kluczową rolę paska czynnika transkrypcyjnego palca cynkowego (28) i białka wiążącego RNA (29). Użyliśmy obu tych markerów do badania, czy komórki Hanca i serca, do których COMS przyłączają się, wykazują właściwości komórek ścięgnisto-podobnych. Podwójne etykietowanie na embrionach WT z przeciwciałami anty-Lbe/anty-Lacz oraz na embrionach how-lacZ z przeciwciałami anty-Lbe/anty-LacZ ujawniło, że HANCs i komórki serca kontaktujące się z kom nie wykazują ekspresji markerów komórek ścięgien (dane nie pokazane). To odkrycie wskazuje, że komórki lb-dodatnie przyciągają COMs za pomocą mechanizmu innego niż używany przez komórki ścięgien. Najciekawszymi kandydatami do kierowania Koms są wydzielana szczelina białkowa posiadająca motywy wiązania wielu białek i jej receptory Robo i Rob2 (30). Slit i Robo pojawiły się niedawno jako kluczowe komponenty kontrolujące procesy przyciągania i odpychania podczas morfogenezy mięśni somatycznych (31), co sugeruje, że mogą być również zaangażowane w przyciąganie kom.

najbardziej przednie komórki serca z ekspresją lb odgrywają centralną rolę w kształtowaniu obszaru odpływu serca. Obserwacja, że zarówno COMs, jak i HANCs zdecydowali się dołączyć do najbardziej przednich lb-dodatnich komórek serca, skłoniła nas do sprawdzenia, czy deregulacja ekspresji lb w sercu może wpływać na kształtowanie regionu odpływu serca. Do wykonania tego testu użyliśmy systemu wyrażeń ukierunkowanych na Gal4/UAS (16). Zastosowano dwie różne linie efektorowe GAL4, 24B-GAL4 i Tin-GAL4 (rys. 4 A I C). Linia 24B-GAL4 umożliwia ukierunkowaną ekspresję we wszystkich komórkach serca i mięśni (rys. 4A) o jednolitym i wysokim poziomie ekspresji w najbardziej przednich komórkach serca (strzałka na Fig. 4a). Linia Tin-GAL4 (uprzejmie dostarczona przez R. Bodmer) indukuje ekspresję transgenu UAS selektywnie w czterech kardioblastach w każdym hemisegmencie (należą do nich komórki lb-dodatnie), ale poziom indukcji w większości przednich komórek serca jest niższy (strzałka na Fig. 4C) niż linia 24B-GAL4. Aby rozszerzyć ekspresję lb serca, obie linie efektorowe GAL4 zostały skrzyżowane z linią UAS-lbe. Ektopowa ekspresja lb serca napędzana przez linię Tin-GAL4 była słabsza niż endogenna ekspresja LB w sercu i nie zaobserwowano wyraźnych zmian wywołanych wzmocnieniem funkcji w regionie odpływu serca (dane nie zostały przedstawione). Natomiast zarodki 24B-GAL4>UAS-lbe wykazywały wyraźne rozszerzenie ekspresji lb w obrębie serca (Fig. 4G), co prowadzi do nieprawidłowego kontaktu Koms z czubkiem serca. Najbardziej precyzyjnie okazało się, że COMs przywiązują się bezpośrednio do najbardziej przednich komórek serca, które tworzą odpływ serca(gwiazdka na Rys. 4G), a nie do drugiej pary komórek serca, jak w WT (rys. 4D). Zmienione połączenie COMs najprawdopodobniej wynika z ektopowych sygnałów atrakcyjnych generowanych przez rozszerzoną ekspresję lb serca. W rezultacie zginanie brzuszne najbardziej przedniej części serca było bardziej wyraźne (porównaj rys. 4 D i G). Zauważyliśmy również zmienioną morfologię COMs (otwarty Grot na Fig. 4 D i G), co może wynikać z ektopowej ekspresji mięśni lb. Na kontakt pomiędzy komórkami serca nie miały wpływu eksperymentalne warunki nieprawidłowej ekspresji. Aby sprawdzić, czy ekspresja lb serca jest wymagana do przyciągania COMs, skorzystaliśmy z wcześniej opisanego negatywnego wpływu regulacyjnego parzystego pomijanego (eve), który jest w stanie specyficznie tłumić lb w komórkach serca (5). Ponownie, linie efektorowe 24B-GAL4 i Tin-GAL4 zostały użyte do napędzania ekspresji eve w sercu. Odkryliśmy, że oba te sterowniki skrzyżowane z linią UAS-eve (Tin-GAL4 z mniejszą penetracją) prowadzą do stłumienia aktywności lb w sercu (rys. 4 H I I). Pomimo wad missspecification, zawiązki sercowe powstają normalnie w UAS-eve gain of function embriones (ref. 5 i Rys. 4B), co pozwala na monitorowanie COMs i HANCs w kontekście, w którym ekspresja serca lb jest wyczerpana. Nasze dane pokazują, że w takich zarodkach lb-zubożonych (patrz brak ekspresji lb serca na Fig. 4 H I I) COMs nie przywiązują się do czubka serca. Zauważyliśmy, że COMs Rozszerzony przednio i dołączony do invaginating HANCs (rys. 4 H I I), które nie są już w stanie prawidłowo zakotwiczyć czubka serca. Główna gałąź COM, która zwykle łączy się z regionem odpływu serca (porównaj rys. 4 E i F z H I I) był nieobecny lub zespolony z gałęzią HANC-attaching. W związku z tym uważamy, że nieprawidłowy kształt COM i całkowita utrata jego kontaktu z czubkiem serca są spowodowane uszczupleniem mięśnia sercowego. Założenie to potwierdza fakt, że te same fenotypy obserwowano u zarodków z ektopową ekspresją serca (Tin-gal4-driven) i sercowo-mięśniową (24B-GAL4-driven) Ewy (porównaj rys. 4 H I I). Zmieniony kontakt i pozycjonowanie COMs pojawił się w późnym stadium zarodków 14, gdy łańcuch ciężki miozyny nie jest jeszcze wykrywalny w kardioblastach (Fig. 4 E I H). Analiza zarodków Stadium 15 wykazała ponadto, że utracie ekspresji lb serca towarzyszy obniżona Regulacja β3-tubuliny (porównaj Fig. 4 F I I) w obszarze odpływu serca, co wskazuje, że ekspresja lb w sercu ma istotny wpływ na końcową morfogenezę serca. Dane te uzupełniają ostatnie doniesienia opisujące role morfogenetyczne członka rodziny receptora COUP-TF, Seven-up, wyrażonego w tylnej parze kardioblastów w każdym segmencie i wymaganego do tworzenia Ostii w segmentach brzusznych A5-A7 (32, 33). W tym kontekście pokazanie roli lb w kształtowaniu obszaru odpływu serca zwiększa możliwość, że w segmentach brzusznych lb odgrywa podobną rolę w nawiązywaniu kontaktu między komórkami serca a mięśniami alarnymi zakotwiczającymi serce. Hipoteza ta pozostaje do zbadania.

ponadto przedstawione fenotypy (rys. 4) sugerują, że ekspresja lb doświadczalnie wyczerpana w sercu wpływa na emisję lub odbiór atrakcyjnych sygnałów przez komórki serca, a w konsekwencji prowadzi do zakłócenia kontaktu z Koms. Ten sam lub podobny Atraktant mięśniowy może być wytwarzany lub otrzymywany przez lb-dodatnie, co sugeruje, że lb reguluje ekspresję genów zaangażowanych w kontakt komórka-komórka. Co ciekawe, w homologu lb myszy stwierdzono, że Gen Lbx1 jest wymagany do ukierunkowanej migracji podzbioru prekursorów mięśni (21, 22), co wskazuje, że mogą istnieć zachowane mechanizmy ruchu komórkowego, które są kontrolowane przez geny lb.

zebrane razem, poprzez analizę zarodków, w których ekspresja lb serca została rozszerzona lub doświadczalnie wyczerpana, wykazaliśmy, że lb jest wymagany do prawidłowego zamocowania HANCs i COMs, aw konsekwencji do prawidłowego wzorca regionu wypływu serca. To odkrycie dostarcza wglądu w funkcjonalne znaczenie przedniego-tylnego zróżnicowania prekursorów serca w każdym segmencie serca Drosophila.

Czy można przedstawić prototyp Drosophila komórek Neural Crest? Morfogeneza serca kręgowców obejmuje dwa różne typy komórek, mezodermalny pierwiosnek serca i subpopulację komórek grzebienia nerwowego, które migrują z regionu głowy. W tym artykule pokazaliśmy, że u Drosophila grupa komórek niemesodermalnych pochodzących z naskórka głowy (które nazwaliśmy Hancami) przyczynia się do ostatecznej morfogenezy serca. Podobnie jak w kręgowych komórkach grzebienia nerwowego, Hance przechodzą kierowane ruchy, wchodzą w kontakt z komórkami serca i uczestniczą w kształtowaniu regionu odpływu serca. Wykazaliśmy, że geny homeoboxu, o których wiadomo, że biorą udział w różnicowaniu prekursorów serca (5, 11), są wyrażane w genach Homeoboxu i są wymagane do ich specyfikacji. Podobnie ortolog lb, Gen Lbx1, został niedawno uznany za wymagany do specyfikacji podgrupy komórek grzebienia nerwowego serca u myszy (23), co wskazuje, że geny lb/Lbx1 odgrywają zachowaną rolę w specyfikacji niemesodermalnych składników serca. W tym ujęciu Hancsa można rzeczywiście porównać z kręgowymi komórkami grzebienia nerwowego. Jednak nasze dane wskazują również, że Hance wykazują co najmniej dwie cechy charakterystyczne tylko dla Drosophila: (i) poruszają się jako część złożonej ektodermy głowy, a nie jako rozwarstwione komórki grzebienia nerwowego; oraz (ii) tworzą funkcjonalny kompleks z COMs, które nie mają homologicznych struktur u kręgowców. W związku z tym konieczne są dalsze analizy, aby wyjaśnić dokładną rolę Hancsów i ich potencjalne funkcje przypominające komórki grzebienia nerwowego.