wprowadzenie

rak wątrobowokomórkowy (HCC), który reprezentuje główny Podtyp histologiczny pierwotnych nowotworów wątroby, jest piątym najczęstszym nowotworem na świecie i trzecią główną przyczyną śmiertelności nowotworów (1,2). Najwyższe wskaźniki zachorowań na raka wątroby występują w krajach rozwijających się, zwłaszcza w Azji Wschodniej/Południowo-Wschodniej i Afryce Środkowej/Zachodniej,podczas gdy wskaźniki te są niskie w Azji Południowo-środkowej, Zachodniej, Północnej i Wschodniej Europie (3). Zmiany genetyczne i epigenetyczne czynniki wysokiego ryzyka,takie jak przewlekłe zakażenie HBV lub HCV, marskość wątroby, alkoholowa choroba wątroby i aflatoksyny, odpowiadają za wysoką zachorowalność na HCC (4-6).Jednak mechanizm molekularny, któremu towarzyszy hipatokarcynogeneza i progresja, jest nadal w dużej mierze niejasny.W związku z tym, jest to kluczowe dla nas, aby wyjaśnić etiologię i badaćzmienność witalnie molekularnej leżącej u podstaw inicjacji i progresji raka wątroby i ostatecznie poprawić nasze obecne koncepcje diagnozowania, badania przesiewowe i leczenie tej choroby.

podczas procesu hepatokarcynogenezy, progacja punktów kontrolnych cyklu komórkowego jest ważną cechą, która może promować powstawanie raka (2).jako jeden z regulatorów punktu kontrolnego cyklu komórkowego, cykl podziału komórek 20 (CDC20) wydaje się działać jako białko regulatorowe oddziałujące z kompleksem/cyklosomem promującym anafazę (APC/C)w cyklu komórkowym, który jest wymagany do inicjacji anafazy i wyjścia z mitozy (7,8). Dwa czynniki regulacyjne, CDC20 i Cdh1pośrednio wiążą się z APC i aktywują jego aktywność ubikwitynacji cykliny podczas mitozy i fazy G1 (9,10).Stwierdzono, że białko 80 związane z receptorem(RAP80), które rekrutuje BRCA1 do miejsc uszkodzenia DNA w szlaku ubikwityn sygnałowym indukowanym przez uszkodzenie DNA, może być degradowane przez kompleks promujący anafazę (APC/C-Cdc20) lub (APC/C-Cdh1) poprzez poliubikwitynację podczas mitozy do fazy G1 (11). Zubożenie RAP80 wykazało skuteczną kontrolę punktu kontrolnego fazy G2-M i promowało postęp cyklu mitotycznego.

ekspresja CDC20 może być znacząco tłumiona przez białko p53, które hamuje transformację złośliwą poprzez regulację cyklu komórkowego, starzenia się komórek i genów związanych z apoptozą(12). Wysoka ekspresja Cdc20 odnotowano w różnych nowotworach złośliwych, w tym w gruczolakoraku trzustki (13), raku oralskomórkowym, raku żołądka (14), raku szyjki macicy (15) i różnych komórkach nowotworowych (14,16).Jednak wzorzec ekspresji CDC20 i jego klinicznośćznaczenie w ludzkim raku wątrobowokomórkowym nie zostały wyjaśnione.

w tym badaniu, analizując zestaw danych mikromacierzy(nr akcesyjny GSE14520) z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) odkryliśmy, że Cdc20 był głównym węzłem w sieciach interakcji molekularnych HCC. Zbadaliśmy poziom ekspresji CDC20 w pierwotnych tkankach HCC i przylegających tkankach nowotworowych i oceniliśmy jego kliniczno-patologiczne znaczenie w 132 zarchiwizowanych próbkach HCC. Badano również wpływ knockdown Cdc20 przez siRNA na wzrost i cykl komórkowy komórek raka wątroby. Nasze ustalenia sugerują, że CDC20 może odgrywać istotną rolę w rozwoju HCC.

materiały i metody

Analiza Bioinformatyczna

zestaw danych Microarray GSE14520 (17) został pobrany z GEO. W badaniu tym wykorzystano łącznie 183 HCC i 179 odpowiadających im tkanek para-rakowych, które poddano analizie za pomocą Genechipów Affymetrix U133A pochodzących z kohorty 2 chińskich pacjentów. Dane dotyczące profilowania ekspresji genów zostały ponownie podsumowane za pomocą metody RMA(18) i plików CDF Entrez Gene-centric (19) (zamiast oryginalnych plików CDF affimetrix), które filtrowały niespecyficzne sondy na genach i łączyły wiele zestawów sond reprezentujących ten sam gen w jeden zestaw sond. Przeprowadzono analizę istotności mikromacierzy (SAM) (20) w celu identyfikacji genów o różnej ekspresji między HCC a odpowiadającymi im tkankami raka para. Delta została ustawiona na 2,25, a próg ofFDR na 0,001. Geny nadekspresowane w HCC, które były ekspresowane w ponad 50 tkankach HCC, ale mniej niż 10 reagujących na raka tkanek badano. Geny poddano dalszej analizie za pomocą oprogramowania GenCLiP (21) (http://ci.smu.edu.cn) w celu opisania funkcji genów i zbudowania sieci interakcji molekularnych.

deklaracja Etyczna

próbki kliniczne zostały wykorzystane wyłącznie do celów badawczych. Aprobatę uzyskała Komisja Etyki Szpitala Ogólnego ChinesePLA (LREC 2012/40). Wszystkie próbki zebrano pod warunkiem uprzedniej pisemnej świadomej zgody od pacjentów.

pacjenci i próbki tkanek

szesnaście par świeżego HCC i przyległych nienowotworowych komórek wykorzystywanych do analizy PCR i western blot w czasie rzeczywistym zostało pobranych podczas operacji z chińskiego szpitala ogólnego PLA(Pekin, Chiny) od listopada 2012 do lutego 2013. Tissueswere snap-zamrożone w ciekłym azocie do czasu użycia. Osadzone w parafinie, zarchiwizowane HCC i przyległe tkanki nienowotworowe wykorzystywane doimmunohistochemii (IHC) uzyskano od 132 pacjentów z HCC, którzy przeszli częściową resekcję wątroby w tym samym szpitalu między styczniem 2006 a grudniem 2007. Mediana wieku pacjentów wynosiła 52 lata (zakres 24-80 lat).

kultura komórkowa

jedna normalna linia komórkowa wątroby (LO2) i trzy linie komórkowe HCC (HepG2, SMMC7721, Huh7) zostały zakupione z amerykańskiej kolekcji TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA) lub chińskiego banku komórek Akademii Nauk i były utrzymywane w Instytucie biotechnologii akademii wojskowych Nauk Medycznych. Wszystkie komórki utrzymywano w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco 's Eagle’ s (Dmem, Invitrogen,CA) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, Gibco, Carlsbad,CA) i 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny, 100 µg/mlstreptomycyny w 37°C z 5% CO2.

ekstrakcja RNA, synteza cDNA i analiza PCR w czasie rzeczywistym

całkowite RNA ekstrahowano z linii komórkowych i tkanek przy użyciu odczynnika Trizolowego (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. W sumie 2 µg RNA zostało odwrócone przy użyciu zestawu do syntezy TransScript i cDNA z transgen Biotech (Pekin, Chiny). Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. Dane ekspresji znormalizowano do średniejgeometrycznej genu β-aktyny i obliczono z ΔΔCt (22), a wyniki poddano ekspresji z 2−ΔΔCt.

Analiza Western blot

Analiza Western blot została przeprowadzona zgodnie ze standardowym protokołem. Zastosowano elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS (10%) w celu oddzielenia białka, które następnie poddano elektrotransferacji z żelu do membrany z fluorku poliwinylidenu (PVDF). Po zablokowaniu 5% wysuszonym mlekiem odtłuszczonym przez 1 godzinę błonę inkubowano poliklonalnym przeciwciałem przeciw ludzkiemu CDC20 królika (1: 1000, Technologia Bioworld, St. Louis Park, MN)przez 1 h W roomtemperatura. Jako aninternal control zastosowano mysie przeciwciało monoklonalne α-tubuliny przeciw ludzkiemu(1:5000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Po trzykrotnym przemyciu buforowaną tris solą fizjologiczną ztween-20 (TBST), błonę inkubowano przeciwciałem koniugowanym peroksydazą chrzanu przeciw myszom rabitora (rozcieńczenie 1:5000). Detekcję chemiluminescencyjną przeprowadzono za pomocą Immobilizonu Western Chemiluminescent HRP substrat (Millipore Corporation, Billerica, MA).

Immunohistochemię (IHC) oraz monitorowanie

Immunohistochemię ekspresji CDC20 w próbkach HCC iadjacent non-tumor przeprowadzono metodami standardowymi.Krótko mówiąc, fragmenty tkanek inkubowano z króliczym anty-CDC20diluted 1: 200 (Technologia Bioworld) przez noc w temperaturze 4°C. Jako kontrolę negatywną zastosowano serumalbuminę bydlęcą (1%; BSA) bez pierwotnego przeciwciała. Wtórna peroksydaza Poli-Chrzanowa (HRP) przeciwciało przeciw IgG królika (ZSGB-Bio, Pekin, Chiny) inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

wszystkie sekcje immunologiczne zostały zweryfikowane i ocenione niezależnie przez dwóch patologów w ślepej manner bez znajomości informacji kliniczno-patologicznych, w oparciu o metodę H-score, która uwzględnia intensywność barwienia razem z odsetkiem dodatniego barwienia komórek (23,24).W przypadku metody H-score losowo wybrano 10 pól w × 400magnification. Natężenie barwienia w komórkach oceniono jako 0,1, 2 i 3 odpowiadające odpowiednio barwieniu ujemnemu, słabemu, pośrednim i silnemu. W każdym polu zliczono całkowitą liczbę komórek i komórek barwionych przy każdej intensywności. Wynik H obliczono według wzoru: (%komórek barwionych w kategorii intensywności 1×1) + (%komórek barwionych w kategorii intensywności 2×2) + (%komórek barwionych w kategorii intensywności 3×3). H-wynik od 0 do 300, gdzie 300 stanowiło 100% silnych komórek (3+) (24). Wysoką ekspresję Cdc20 zdefiniowano jako barwienie H-score komórek ≥200.

supresja CDC20 przez małe interferingRNA (siRNA)

dwuniciowe, małe interferujące RNA (siRNA) zostało zsyntetyzowane i oczyszczone przez GenePharma (Szanghaj, Chiny). Następstwa odpowiadające regionowi kodującemu ludzkiego Cdc20: sens, 5′-GGAGCUCUCUCAGGCCA UUU-3′; antysens,5′-AUGGCCUGAGAGCUCCUU-3′. Do kontroli negatywnej użyto kodowanego siRNA. Te sirna rozpuszczono w wodzie indietylowego pirokarbonianu (DEPC), aby osiągnąć stężenie 20µm. Rak wątroby komórki HepG2 leczono siRNA cdc20 lub kontrolnym siRNA w 20 nM przy użyciu odczynnika do transfekcji interferonu invitro siRNA (PolyPLUS Transfection, NewYork, NY).

ilościowe analizy PCR i Western blot w czasie rzeczywistym były wykorzystywane do wykrywania efektu interferencyjnego siCDC20. Komórki, które były nieleczone lub leczone sirnaoligonukleotydami kontroli ujemnej, były grupami kontrolnymi.

test proliferacji komórkowej

dwie plastikowe kolby o powierzchni 25 cm2 były inokulowane 2×105 komórkami raka wątroby (HepG2), które następnie transfekowano odpowiednio 20 nM ujemną kontrolą siRNA i CDC20siRNA w celu inkubacji przez 48 godzin. Następnie komórki trawiono i wysiewano do 6-studzienkowych płytek zawierających 2 ml pożywki na studzienkę.Następnie komórki ze studni trawiono i liczono za pomocą automatycznego licznika komórek (Invitrogen) co 24 godziny do piątego dnia.

fluorescence-activated cell sorting(FACS) test cyklu komórkowego

siRNA dla CDC20 i kontroli ujemnej sirnaoligonukleotydy transfekowano do komórek HepG2 za pomocą odczynnika do transfekcji siRNA in vitro in vitro przez 48 godzin.po leczeniu 2 µg/ml tymidyny (Sigma-Aldrich, St. Louis,MO) przez 24 godziny, komórki pobierano w 0, 3, 6, 9, 12-h po usunięciu tymidyny z pożywki i utrwaleniu 70% alkoholem.Przed analizą komórki przemyto PBS, potraktowano 1 mg / mlrnazą A w 37°C przez 30 minut, a następnie zabarwiono jodkiem propidium (PI). Analizy zostały przeprowadzone przez BD FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), a wyniki analizowane były przez oprogramowanie WinMDI w wersji 2.9.

analizy statystyczne

wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane przy użyciu pakietu oprogramowania statystycznego IBMSPSS 20.0. Do porównania ekspresji MRNANORMALIZOWANEGO cdc20 z β-aktyną w liniach komórkowych wykorzystano jednokierunkową analizę zmienności (ANOVA). Tę samą metodę zastosowano również w porównaniu różnicowania histologicznego w nowotworach znormalizowanych z normalnymi próbkami wątroby. Porównania danych w dwóch grupach przeprowadzono testem t ucznia. Test χ2 był używany do analizy zależności między ekspresją CDC20 a cechami kliniczno-patologicznymi. Korelacje między zmiennymi obliczono na podstawie współczynników korelacji Spearmana.Poziom istotności statystycznej został ustawiony na P<0.05 dla wszystkich testów.

wyniki

CDC20 jest głównym węzłem w sieciach interakcji cząsteczkowej HCC

analiza sama zidentyfikowała 4358 genów nadekspresowanych inHCC, w których 137 genów uległo ekspresji w ponad 50 tkankach HCC,ale w mniej niż 10 tkankach para-carcinoma. Analiza GenCLiP wykazała, że spośród 137 genów, 72 geny były związane z cyklem komórkowym(P=1,238 e-15, przez χ2 test), 19 genów było związanych z montażem wewnątrzkomórkowym (P=2,172 e-55, przez χ2 test), a 26 genów było związanych z segregacją chromosomów (P=5,472 e-55, przez X2 test). Wśród sieci molekularnych zbudowanych ze 137 genów CDC20 był głównym węzłem, który wcześniej nie był związany z HCC. Wiadomo, że dziewięć genów (NEK2,E2F1, BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C i CDKN2A) oddziałuje z CDC20, w którym 7 genów było związanych z punktem kontrolnym montażu wrzeciona (Sac) (Fig.1). Celem SAC jest CDC20 (25). W związku z tym wnioskowaliśmy,że w HCC nadekspresja CDC20 prowadzi do braku SAC, a komórki szybko stają się aneuploidami.

CDC20 jest nadekspresowany w HCC

ilościowy PCR w czasie rzeczywistym został użyty do badania poziomu transkryptu CDC20 w trzech liniach komórkowych HCC (HepG2, SMMC-7721 i Huh7) i jednej normalnej linii komórkowej wątroby (LO2). Poziom mRNA CDC20 był wyższy we wszystkich trzech liniach komórkowych HCC niż w linii normalcell (rys. 2).

w celu ustalenia, czy wzrost regulacji cdc20 w liniach komórkowych HCC jest podobny u pacjentów z HCC, wykonaliśmy kwantytywny PCR w czasie rzeczywistym na 16 parach dopasowanych HCC i przylegających tkankach wątroby. Jak pokazano na Fig.3A, CDC20 stwierdzono różną nadekspresję w 14 wszystkich badanych próbkach pierwotnej HCC u ludzi w porównaniu z próbkami nienowotworowymi u tych samych pacjentów. Dodatkowo stosunek ekspresji mRNA cdc20 do guza(t/NT) wynosił co najmniej >2-krotnie we wszystkich tych 14 badanych próbkach, A najwyższy stosunek wynosił nawet około 40-krotnie. Poziom białka CDC20 potwierdzono we wszystkich 16 sparowanych próbkach tkanek za pomocą analizy western blot. Obraz J1. 47v został użyty do skwantizowania poziomu szarości każdego pasma i obliczenia stosunku CDC20 T/NT u każdego pacjenta normalizującego się z a-tubuliną. Wyniki wykazały, że wszystkie badane próbki HCC wykazały wyższy poziom ekspresji białka CDC20 z wyjątkiem próbki 1 i próbki 4, co było zgodne z poziomem mRNA (Fig. 3b). Wyniki te wykazały, że cdc20 był często regulowany w tkankach HCC lub liniach komórkowych.

immunohistochemia barwienie CDC20protein

IMMUNOHISTOCHEMIA (IHC) przeprowadzono w celu analizy ekspresji białka i lokalizacji CDC20 w 132 archiwalnych próbkach tkanek HCC osadzonych w parafinie, w tym 14 przypadków dobrze zróżnicowanych, 78 przypadków umiarkowanie zróżnicowanych i 40 przypadków guzów słabo zróżnicowanych. Białko CDC20 zwiększyło się (H-score ≥200) W 90 (68,18%) z 132 tkanek HCC. Jak pokazano wfig. 4A, wysokie poziomy CDC20 były obecne w pierwotnych zmianach HCC i dodatnie zabarwienie głównie w cytoplazmie i jądrach. W przeciwieństwie do tego, CDC20 byłnegatywnie lub słabo zabarwiony w odpowiednich tkankach nienowotworowych. Przez wielokrotne porównanie wyników barwienia CDC20 między 132 zarchiwizowanymi tkankami HCC i przyległymi tkankami nienowotworowymi (głównie w tym hepatocirrhosis i hepatitis), wyniki barwienia CDC20 znacznie wzrosły w próbkach HCC w porównaniu z próbkami okołoobszarowymi (Fig. 4B). Ponadto, wyniki barwienia CDC20 były znacznie zwiększone wraz z postępem różnicowania histologicznego guza z dobrze topoorly zróżnicowanych tkanek (Fig.5).

korelacja pomiędzy zwiększoną ekspresją Cdc20 a parametrami kliniczno-patologicznymi HCC

Dalej analizowano zależność między ekspresją białka CDC20 a cechami kliniczno-patologicznymi u 132 pacjentów z HCC. Jak podsumowano w tabeli I, ekspresja CDC20 była istotnie związana z płcią (P=0,013), zróżnicowaniem guzów (P=0,000), Stadium TNM (P=0,012), ekspresją p53 i Ki-67 (odpowiednio P=0,023 i P = 0,007). Stwierdzono jednak nostatystycznie istotny związek pomiędzy wysoką ekspresją Cdc20 a innymi cechami kliniczno-patologicznymi, takimi jak: wielkość guza, zakażenie HBV, poziom AFP w surowicy, marskość wątroby,inwazja naczyniowa i przerzuty wewnątrz/poza wątrobą. Analiza równoważności ramion wykazała, że wysoka ekspresja CDC20 była ściśle powiązana z płcią (R=0,215, P=0,013), uboższa różnica guzów (R=0,421, p<0,001), zaawansowana Faza TNM(R=0,218, P=0,012), wyższy poziom ekspresji p53 (R=0,212, P=0,014) i Ki-67 (r=0,235, P=0,007) (tabela II). Podsumowując, wyniki te wykazały, że CDC20 wykazywał wysoką ekspresję w tkankach HCC i jego ekspresja była ściśle skorelowana z różnicowaniem i progresją HCC.

tłumienie ekspresji CDC20 przezirna

ilościowe PCR w czasie rzeczywistym ujawniło 90% tłumienie poziomu transkrypcyjnego CDC20 w 48 h po transfekcji za pomocą siCDC20, w porównaniu z nieleczonymi komórkami lub komórki zakażone sirna kontroli ujemnej (rys. 6a) (P<0.0001). Zachodnia analiza blotanalizy wykazała również oczywistą supresję poziomu białka CDC20 w 48 h po transfekcji siCDC20 (Fig. 6b). Zmodyfikowaną ekspresję białka inhibitora kinazy 1A (p21) zależnego odcykliny zbadano również za pomocą analizy Western blot, a wyniki wykazały, że poziom białka P21 został znacznie podwyższony ze względu na hamowanie CDC20 (Fig. 6b).

wpływ supresji CDC20 na proliferację komórek i cykl komórkowy

Test proliferacji komórek wykazał, że wzrost komórek komórek transfekowanych siRNA cdc20 był znacząco hamowany w porównaniu z komórkami transfekowanymi siRNA z kontrolą ujemną(Fig. 6C). Spodziewano się, że hamowaniu proliferacji komórek przez siCDC20 będzie towarzyszyła największa aktywność metafazy cyklu komórkowego. W teście cytometrii przepływowej zaobserwowano zwiększoną liczbę komórek w fazie G2/M w komórkach transfekowanych sicdc20 w porównaniu z komórkami transfekowanymi za pomocą ujemnego siRNA kontrolnego (Fig. 6D). Dane te wskazywały, że supresja CDC20 hamowała wzrost komórek poprzez zmniejszanie zatrzymania fazy G2/M.

dyskusja

poprzez analizę bioinformatyczną mikroarraydataset z bazy danych GEO, zidentyfikowaliśmy CDC20, który był głównym ornode w sieciach interakcji molekularnych HCC, był związany z punktem kontrolnym montażu spindle (SAC) w cyklu komórkowym. Uważa się, że w trakcie obróbki plastycznej za zwiększoną szybkość euploidyzacji odpowiedzialne są wady lub zakłócenia w zespole wrzeciona (26). Mondalet al donoszą, że CDC20 jest nadekspresowany w pierwotnych guzach głowy i szyi oraz w kilku liniach komórkowych raka płaskonabłonkowego jamy ustnej (OSCC). Wysoki poziom ekspresji CDC20 w komórkach OSCC jest związany z przedwczesną promocją anafazy, prowadzącą do zaburzeń mitotycznych (27). Badania wykazały również, że wysoka ekspresja CDC20 jest wykrywana w tkankach raka oralnokomórkowego i raka jelita grubego, a jego ekspresja może przewidywać złe rokowanie u pacjentów (28,29).

CDC20 jest również wymagane dla późnych komórek anafazowych doexit z mitozy (30). Celowanie cdc20 skutkuje blokowaniem wyjścia z mitozy, co może być lepszą strategią terapeutyczną raka w celu zabijania komórek nowotworowych bardziej efektywnie niż leki działające na wrzeciono (31). Wang i wsp. stwierdzili, że cdc20, który może działać jako onkoproteina w celu promowania progresji i rozwoju nowotworów u ludzi, stanowi obiecujący cel terapeutyczny (32). Chociaż rola CDC20 w nowotworze i rokowaniu kilku osób została dogłębnie zbadana i potwierdzona, ograniczone badania zbadały potencjalną funkcję CDC20 w inicjacji i progresji raka wątrobowokomórkowego.

w tym badaniu oceniliśmy poziom ekspresji cdc20 w 16 sparowanych świeżo mrożonych tkankach HCC i odpowiadających im próbkach nowotworowych. Wyniki wykazały, że średni poziom mRNA i białka CDC20 w tkankach HCC był znacznie wyższy niż w innych tkankach nienowotworowych. Immunohistochemia została zastosowana w celu zbadania subkomórkowej lokalizacji CDC20 i jej związku z klinicznymi parametrami patologicznymi HCC patients.By korzystając z testu χ2, odkryliśmy, że wyższy poziom ekspresji białka CDC20 był związany z płcią, różnicowaniem nowotworu, etapem TNM, ekspresją P53 i Ki-67. Aby zbadać potencjalną funkcję biologiczną i mechanizm molekularny CDC20 w HCC, zaprojektowano dwuniciowy, mały interferujący RNA (siRNA) ukierunkowany na cdc20 w celu zakłócenia jego poziomu ekspresji w linii komórkowej HepG2. W teście proliferacji komórkowej i teście FACS odkryliśmy, że komórki transfekowane oligonukleotydami siCDC20 wykazywały zmniejszoną szybkość wzrostu i zwiększoną proporcję komórek w stadium G2/M.

specyficzny knockdown CDC20 przez siRNA pokazał jakzagrożony wpływ na proliferację komórek raka wątroby invitro, co wskazywało, że nadekspresja CDC20 może przyspieszyć proliferację komórek i promować nowotwór i progresję HCC. Komórki nowotworowe wątroby z ekspresją CDC20 ulegały akumulacji w fazie inG2/M, co może być odpowiedzialne za hamowanie wzrostu komórek. Wykazano, że inhibitor kinazy zależnej od cyklin 1A (p21), o którym wiadomo, że bierze udział w punkcie kontrolnym G2/M (33), został podwyższony, gdy ekspresja CDC20 została specjalnie zahamowana w komórkach nowotworowych wątroby. P21 może hamować aktywność CDK prowadzącą do kumulacji niefosforylowanego białka supresorowego guza Rb, które hamuje transkrypcyjną aktywację E2F i następnie zapobiega wejściu komórek w fazę s cyklu komórkowego (34).

podsumowując, jest to pierwsze badanie mające na celu zbadanie ekspresji CDC20 w tkankach i liniach komórkowych HCC, dające nowy nacisk na to, że CDC20 może być znaczącym klinicznie wskaźnikiem i promującym cel terapeutyczny HCC. Niemniej jednak konieczne są dalsze badania skupione na molekularnych mechanizmach CDC20 w inicjacji i progresji HCC oraz badania nad prognostycznym znaczeniem cdc20.

podziękowania

autorzy dziękują kolegom z Instytutu Biotechnologii Akademii Medycyny wojskowej za wsparcie techniczne.

	Parkin DM: Global cancer statistics in theyear 2000. Lancet Oncol. 2:533–543. 2001.PubMed/NCBI
	El-Serag HB and Rudolph KL: Hepatocellularcarcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis.Gastroenterology. 132:2557–2576. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Jemal a, Bray F, Center MM, Ferlay J, WardE and Forman D: Global cancer statistics. Ca Cancer J Clin.61:69–90. 2011. Zobacz artykuł : Google Scholar
	Severi t, van Malenstein H, Verslype C andvan Pelt JF: tumor initiation and progression in hepatocellularcarcinoma: risk factors, classification, and therapeutic targets.Acta Pharmacol Sin. 31:1409–1420. 2010. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Michielsen P i Ho e: wirusowe zapalenie wątroby z zespołem raka wątrobowokomórkowego. Acta Gastroenterol Belg. 74:4–8.2011.
	McGivern DR i Lemon SM: specyficzne dla wirusa mechanizmy karcynogenezy w chorobie nowotworowej związanej z wirusem zapalenia wątroby typu C. Onkogen. 30:1969–1983. 2011. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fung TK i Poon RY: Kolejka górska z mitotycznymi cyklinami. Semin Cell Dev Biol. 16:335–342. 2005.Zobacz artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu Tand Baum LG: a novel mammalian protein, p55cdc, present in dividingcells is associated with protein kinase activity and has homology to the Saccharomyces cerevisiae cell division cycle proteins cdc20 i Cdc4. Mol Cell Biol. 14:3350–3363. 1994.
	: Biologia komórki: checkpointbrake odciążony. Natura. 446:868–869. 2007. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Fang G, Yu H I Kirschner MW: kierowanie członkami rodziny białek CDC20 aktywuje kompleks promujący anafazę w mitozie i G1. Komórka Mol. 2:163–171.1998. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Cho HJ, Lee EH, Han Sh, et al: Degradacją ludzkiego RAP80 jest cykl komórkowy regulowany przez ubikwitynligazy Cdc20 i Cdh1. Mol Cancer Res. 10: 615-625. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Kidokoro T, Tanikawa C, Furukawa Y,Katagiri T, Nakamura Y i Matsuda K: CDC20, potencjalny cel nowotworowy, jest negatywnie regulowany przez p53. Onkogen.27:1562–1571. 2008. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Chang DZ, Ma Y, Ji B, et al: Zwiększona ekspresja cdc20 jest związana z różnicowaniem i postępem raka trzustki. J Hematol Oncol.5:152012. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Kim JM, Sohn Hy, Yoon Sy, et al:Identyfikacja genów związanych z rakiem żołądka za pomocą cDNAmicroarray zawierającego nowe znaczniki sekwencji wyrażonych wewnątrz komórek nowotworowych. Clin Cancer Res. 11: 473-482. 2005.PubMed/NCBI
	Espinosa AM, Alfaro a, Roman-Basaure E, etal: mitoza jest źródłem potencjalnych markerów dla badań przesiewowych i celów terapeutycznych w raku szyjki macicy. PloS 1.8:.PubMed/NCBI
	Ouellet V, Guyot MC, Le Page C, et al:tissue array analysis of expression microarray candidates identifies markers associated with tumor grade and outcome inserous epithelial jajnik cancer. Int J Rak. 119:599–607. 2006.Zobacz artykuł: Google Scholar
	Roessler s, Jia HL, Budhu A, et al: Aunique metastasis Gene signature enables prediction of tumorrelapse in early-stage hepatocellular carcinoma patients. CancerRes. 70:10202–10212. 2010. Zobacz artykuł: Google Scholar
	Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, et al:Exploration, normalization, and summaries of high densityoligonucleotide array probe level data. Biostatystyka. 4:249–264.2003. Zobacz artykuł: Google Scholar
	dai M, Wang P, Boyd AD, et al: evolvinggene/transcript definitions significantly change the interpretationof GeneChip data. Kwasy nukleinowe Res. 33: e1752005. Zobacz artykuł: Google Scholar:PubMed/NCBI
	Tusher VG, Tibshirani R i Chu G: Analiza istotności mikromacierzy stosowanych do reakcji jonizacji. Proc Natl Acad sci USA. 98:5116–5121. 2001.Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Huang ZX, Tian HY, Hu ZF, Zhou YB, Zhao Jand Yao KT: GenCLiP: program do grupowania list genówprofilowanie literatury i konstruowanie współwystępujących genówcenetworki związane z niestandardowymi słowami kluczowymi. Bioinformatyka BMC. 9:3082008.Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Adhikary S I Eilers M: Transcriptionalregulation and transformation by myc proteins. Nat Rev Mol CellBiol. 6:635–645. 2005. Zobaczartykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Detre S, Saclani Jotti G and Dowsett M: A’quickscore’ method for immunohistochemical semiquantitation:validation for oestrogen receptor in breast carcinomas. J ClinPathol. 48:876–878. 1995.
	Früh MPM: EGFR IHC score for selection ofcetuximab treatment: Ready for clinical practice? Transl LungCancer Res. 1:145–146. 2012.
	Hwang LH, Lau LF, Smith DL, et al: Nauka.279:1041–1044. 1998. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Kops GJ, Weaver BA i Cleveland DW: onthe road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint. Nat RevCancer. 5:773–785. 2005. Zobaczartykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Mondal G, Sengupta S, Panda CK, Gollin SM,Saunders ws i Roychoudhury s: nadekspresja Cdc20 prowadzi do pogorszenia punktu kontrolnego zespołu wrzeciona i uploidyzacji raka jamy ustnej. Rakotwórczość. 28:81–92. 2007. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Moura im, Delgado ML, Silva PM, et al:wysoka ekspresja CDC20 jest związana ze złym rokowaniem w raku oralskabłonkowym. J Oral Pathol Med. 43:225–231. 2013.Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Wu WJ, Hu KS, Wang DS, et al: CDC20overexpression przewiduje złe rokowanie u pacjentów z rakiem jelita grubego. J Transl Med. 11:1422013. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Yeong FM, Lim HH, Padmashree CG i SuranaU: wyjście z mitozy u początkujących drożdży: dwufazowa inaktywacja kinazy mitotycznej theCdc28-Clb2 i rola Cdc20. Komórka Mol.5:501–511. 2000. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Huang HC, Shi J, Orth JD i Mitchison TJ:dowody na to, że wyjście mitotyczne jest lepszym celem terapeutycznym raka niż zespół wrzeciona. Komórka Nowotworowa. 16:347–358. 2009. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wang z, Wan L, Zhong J, et al: Cdc20: apotential novel therapeutic target for cancer treatment. Curr PharmDes. 19:3210–3214. 2013. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bunz F, Dutriaux a, Lengauer C, et al:wymóg dla p53 i p21 do utrzymania zatrzymania G2 po uszkodzeniu DNA.Nauka. 282:1497–1501. 1998. Zobacz artykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Wells J, Boyd KE, Fry CJ, Bartley SM andFarnham PJ: swoistość genu docelowego E2F i pocket proteinfamily members in living cells. Mol Cell Biol. 20:5797–5807. 2000.Zobacz Artykuł : Google Scholar