Zwierzęta

Danio pręgowany utrzymywano w temperaturze 28,5 °C w 14-godzinnym cyklu światła włączonego / 10-godzinnego wyłączonego w roztworze Danieau . Kombinatoryczny Mutant krystaliczny (albb4/b4;nacrew2/W2;roya9/A9) został wygenerowany przez sekwencyjne krzyżowanie trzech różnych pojedynczych mutantów, mianowicie nacrew2/W2 (ref. 9), roya9/A9 (sygn. 4) i albb4 / b4 (Nr ref. 18) mutanty. Co ważne, zarówno larwy, jak i dorosłe danio pręgowane są żywotne i nie wykazują widocznych nieprawidłowości morfologicznych, funkcjonalnych ani behawioralnych innych niż fenotyp pigmentacji. Mutant casper otrzymano przez skrzyżowanie mutantów nacrew2/w2 i roya9 / A9, jak opisano poprzednio4. Linia AB została wykorzystana do uzyskania danio pręgowanego typu dzikiego. Linie transgeniczne stosowane w tym badaniu obejmują TG (elavl3: GCaMP5G)21 i Tg(elavl3:GCaMP6f) 28. Konfokalne eksperymenty obrazowania funkcjonalnego przeprowadzono w mutancie masy perłowej. Eksperymenty z obrazowaniem arkuszy świetlnych przeprowadzono w nacre, casper i crystal mutants. Eksperymenty z funkcjonalnym obrazowaniem dwufotonowym przeprowadzono w larwach kryształów. W leczeniu larw danio pręgowanego za pomocą PTU stosowaliśmy standardowe procedury8, w szczególności larwy hodowano w 200 µM PTU (Sigma) w roztworze Danieau od 24 godzin po zapłodnieniu (hpf). Larwy TG (elavl3:GCaMP5G) użyte do konfokalnego obrazowania funkcjonalnego wizualnie wywołanej aktywności nerwowej w tektum nerwowym potraktowano 200 µM PTU od 24 hpf do 3 dpf i zobrazowano w 4 dpf. Praca ta została zatwierdzona przez lokalny organ ds. dobrostanu zwierząt i oceny etycznej (King ’ s College London) i została przeprowadzona zgodnie z Ustawą Animals (Scientific Procedures) Act 1986, na podstawie licencji brytyjskiego Urzędu Spraw Wewnętrznych (Ppl70/8057).

obrazowanie

mikroskopia in vivo całych zwierząt

Zdjęcia całych zwierząt dorosłych danio pręgowanego wykonano cyfrową lustrzanką Nikon D7000 wyposażoną w obiektyw makro Sigma 150 mm. Dorosłe danio pręgowane znieczulono 0.2% tricaine (MS222, Sigma) w wodzie dla ryb i umieszczony w szalce Petriego o średnicy 90 mm zawierającej wodę dla ryb. Obrazowanie larw wykonano przy użyciu mikroskopu Axioskop Zeissa połączonego z kamerami EXi Blue CCD (Retiga) i oprogramowaniem do akwizycji Volocity (PerkinElmer). Danio pręgowanego znieczulono 0,02% tricaine w roztworze Danieau i unieruchomiono w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Sigma) na szkiełkach szklanych.

Konfokalne obrazowanie wapnia

obrazowanie wykonano przy użyciu mikroskopu konfokalnego ZEISS LSM 710 wyposażonego w głowicę skanującą do detekcji spektralnej i 20x / 1.0 Na cel zanurzenia w wodzie (Carl Zeiss). Funkcjonalne szeregi czasowe wizualnie wywołanej odpowiedzi wapnia w komórkach zwojów siatkówki (rgcs) uzyskano z szybkością 4,1 Hz i rozdzielczością 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 pikseli) i otworkową aperturą 1 AU. Światło wzbudzenia zapewniał wieloliniowy laser o długości fali 488 nm. Nie znieczulone larwy TG (elavl3: GCaMP5G)unieruchomiono w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Sigma) przygotowanej w roztworze Danieau i zamontowano grzbietową stronę do góry na podniesionej szklanej platformie, która została umieszczona w specjalnie wykonanej komorze wypełnionej Danieau. Agaroza była wystarczająca do powstrzymania larw, aby znieczulenie nie było wymagane. Obrazowanie wykonano w godzinach popołudniowych (13: 00-20: 00).

obrazowanie arkusza świetlnego

obrazowanie arkusza świetlnego całego mózgu wykonano przy użyciu mikroskopu Zeiss Lightsheet Z. 1 wyposażonego w dwa cele oświetleniowe 10x/0,2 NA i jeden cel detekcji zanurzenia w wodzie 20x / 1,0 Na (Carl Zeiss). Światło wzbudzenia lasera 488 nm zostało użyte do wywołania fluorescencji GCaMP6f, a filtr 505-545 BP został użyty do wykrywania emitowanego światła. Skaner pivot (Carl Zeiss) został użyty do zapewnienia jednorodnego oświetlenia, a tym samym uniknięcia cieni wzdłuż osi oświetlenia. Grubość blaszki wynosiła 5,39 µm w centrum i 10,8 µm na krawędziach pola widzenia. Czas ekspozycji wynosił 29,97 ms. rozmiar wolumetrycznych obrazów wynosił 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pikseli) przy rozdzielczości 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. 4 larwy DPF nacre, casper i crystal TG(elavl3:GCaMP6f) zostały najpierw sparaliżowane przez 10-15 minut α-bungarotoksyną (1 mg/ml; Biotium) przygotowaną w roztworze Danieau. Następnie larwy unieruchomiono w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Sigma) i umieszczono w szklanej kapilarze (objętość 20 µl, 701904; Brand). Następnie wytłoczyliśmy część cylindra agarozowego zawierającego głowę larwy z kapilary i skierowaliśmy larwy tak, aby grzbietowa strona głowy była skierowana do celu wykrywania, a oczy były skierowane do dwóch celów oświetleniowych. Obrazowanie larw mutantów Caspera w postaci arkusza świetlnego z całego mózgu zostało wykonane przy użyciu mikroskopu z arkusza świetlnego zbudowanego przez dr Martina Meyera (King ’ s College London) i wyposażonego w obiektyw do wykrywania XLUMPlanFLN 20x/1.0 NA z zanurzeniem w wodzie (Olympus).

dwufotonowe obrazowanie wapniowe

dwufotonowe obrazowanie funkcjonalne w siatkówce zostało wykonane przy użyciu mikroskopu Nikon A1R MP wyposażonego w 4-kanałowy aparat GaAsP NDD i obiektyw apochromat 25x/1.1 NA water-immersion obiektyw (Nikon). Wzbudzenie zapewniał Laser tytanowo-szafirowy Kameleon Ultra II (koherentny) dostrojony do 930 nm. Szereg czasowy wizualnie wywołanych reakcji wapnia uzyskano z szybkością 4 Hz i rozdzielczością 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 pikseli). Po aktywacji skanowania laserowego czekaliśmy 60 sekund przed rozpoczęciem stymulacji wizualnej, aby zapewnić, że siatkówka dostosuje się do poziomu światła tła wywołanego przez laser multi-fotonowy. 4 DPF crystal TG(elavl3:GCaMP6f) larwy zostały najpierw sparaliżowane przez 10-15 minut w α-bungarotoksynie (1 mg/ml; Biotium) przygotowanej w roztworze Danieau. Następnie larwy unieruchomiono w 2% niskiej temperaturze topnienia agarozy (Sigma) i zamontowano na podniesionej, wykonanej na zamówienie szklanej platformie z grzbietową stroną do góry (nachylenie pod kątem 45°) i jednym okiem skierowanym na ekran LCD (patrz stymulacja wizualna), który umieszczono pod specjalnie wykonaną komorą wypełnioną Danieau. Obrazowanie wykonano w godzinach popołudniowych (13: 00-20: 00).

stymulacja wzrokowa

ruchome pręty w preparacie konfokalnym

bodźce ruchome pręty były generowane jak poprzednio opisane22,33. Filtr dyfuzyjny (3026, Rosco) został połączony z jedną stroną komory, aby służyć jako ekran projekcyjny. Usunięto agarozę przed okiem skierowanym na ekran projekcyjny, umożliwiając swobodny widok rzutowanego obrazu z boku Komory. Larwy były umieszczone 3 cm od ekranu, a wyświetlany obraz wypełniał pole widzenia o wymiarach ~97° × 63°. Bodźce wzrokowe składały się z jasnych (56 cd/m2) lub ciemnych pasków (8 cd/m2) (odpowiednio 175% i 25% średniej luminancji) na średnim szarym tle (32 cd/m2). Ponieważ nie stwierdzono różnic jakościowych między jasnymi i ciemnymi słupkami, dane uzyskane przy użyciu obu bodźców zostały połączone. Każdy pręt poruszał się o 10° szerokości z prędkością 20° / s I oddzielał się od poprzedniego pręta o 30°, umożliwiając jednocześnie więcej niż jeden pręt na ekranie. Długie osie prętów były prostopadłe do kierunku ruchu. Każdy z 12 kierunków ruchu został przedstawiony raz (3 sekundy) w pseudolosowej kolejności unikalnej dla każdego kawałka na każdym obrazowanym zwierzęciu. Każdy odstęp między epokami wynosił 10 sekund, aby umożliwić sygnał GCaMP5G powrót do wartości wyjściowej. Przeplatano również stan zerowy pustego ekranu wynoszący 2 sekundy. Eksperymenty wizualne były generowane i kontrolowane za pomocą niestandardowego kodu Labview i MATLAB (MathWorks), zaimplementowanego na prezenterze bodźców ViSaGe (Cambridge Research Systems) i dostarczanego za pomocą projektora DLP Pico (Optoma).

ruszty ruchome w preparacie dwufotonowym

bodźce ruchome ruszty w preparacie dwufotonowym były generowane i kontrolowane za pomocą PsychoPy39 i dostarczane przez ekran LCD (SKD5VA-3, technologia GoodWell) umieszczony pod wykonaną na zamówienie komorą Pleksi. Filtr długoprzepustowy z czerwonego szkła (Fgl610, Thorlabs) został umieszczony pomiędzy ekranem LCD a komorą, aby umożliwić jednoczesne obrazowanie i wizualną stymulację. Larwa była umieszczona w odległości 2 cm od ekranu, a obraz na ekranie LCD wypełniał pole widzenia o wymiarach ~140° × 100 ° (średnia luminancja tła 30,4 cd / m2). Bodźce wzrokowe składały się z krat prostokątnych (Kontrast 100%, częstotliwość przestrzenna 1,66 cykli / cm, częstotliwość czasowa 1 cykli / s). Każdy pręt kraty miał szerokość 8,5°, a długie osie prętów były prostopadłe do kierunku ruchu. Każdy z 12 kierunków ruchu został przedstawiony raz (6 sekund) z interwałem między epokami wynoszącym 10 sekund, aby umożliwić sygnał GCaMP6f powrót do linii bazowej. Przeplatano również stan zerowy pustego ekranu wynoszący 6 sekund. Wyzwalacze TTL (0-5-0 woltów) do rejestrowania zdarzeń czasu epoki, gdzie generowane przez urządzenie LABJACK USB DAQ (U3-LV, LabJack Corporation). Po aktywacji skanowania laserowego czekaliśmy 60 sekund przed rozpoczęciem stymulacji wizualnej, aby zapewnić, że siatkówka dostosuje się do poziomu światła tła wywołanego przez laser multi-fotonowy.

test odpowiedzi Optomotorycznej

poszczególne larwy 5 dpf umieszczono w szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej roztwór Danieau. Ekran LCD iPhone ’ a 5 (Apple) sterowany przez MacBooka Pro (Apple) za pomocą wyświetlacza Duet (Kairos Technologies) został użyty do wyświetlania czarno-białych krat prostokątnych (kontrast 85%, częstotliwość przestrzenna 0,33 cykli/mm, Częstotliwość czasowa 3,5 cykli/s) poruszających się w 4 kierunkach (odległość kątowa 90°) na dnie szalki Petriego. Bodźce wzrokowe były generowane w Keynote (Apple). Każda larwa była testowana łącznie 5 razy (każde badanie trwało 6 s, a następnie 10 s kratek statycznych) i oceniana zgodnie z próbami, na które zareagowała (tj. ryby obracają się i pływają w kierunku ruchomych kratek). Zachowanie larw było monitorowane wzrokowo za pomocą stereomikroskopu M165 FC (Leica).

Analiza

analizy czynnościowe

analizowano dane obrazowania wapnia in vivo,jak opisano poprzednio22, 33. Podsumowując, funkcjonalne szeregi czasowe zostały przetworzone przed analizą w następujący sposób: obrazy szeregów czasowych z każdego eksperymentu zostały skorygowane o ruch za pomocą algorytmu sztywnego ciała (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), mediana filtrowana z jądrem o rozmiarze 1 woksela w celu usunięcia ciemnego i wystrzałowego szumu, i przestrzennie wygładzane z jądrem Gaussa 2D = 2 woksele w celu poprawy sygnału do szumu. Wartość początkową (B), która koryguje dryfy o niskiej częstotliwości, wyznaczono za pomocą algorytmu sześciennego splajnu ekstrapolującego między węzłami uśrednionymi z 5 s danych interwału między epokami. Obie względne zmiany natężenia sygnału (ΔF = F-B; gdzie F = surowa fluorescencja)i znormalizowane zmiany intensywności sygnału zostały obliczone na każdym wokselu. ΔF wykorzystano dla danych funkcjonalnych populacji (analiza wokselowa), podczas gdy %ΔF/F0 wykorzystano dla ręcznie zdefiniowanych regionów zainteresowania (ROIs). Dla każdego voxela lub ROI całkową odpowiedź w przedziale epokowym obliczono, aby zapewnić pojedynczą metrykę odpowiedzi dla każdego przedstawionego kierunku ruchu bodźca. Integralną częścią każdego okna epokowego jest metryka sumaryczna bardziej odporna na efekty nasycenia sondy wapniowej niż maksymalna zmiana sygnału. Próg dla każdego woksela w sekwencji obrazu akwizycji określono na podstawie wariancji zmian ΔF w interwałach między epokami i warunku zerowego, próg = 5 × SDs. Wszystkie woksele, które były ponad progowe w co najmniej dwóch epokach prezentacji wizualnej, zostały uznane za reagujące wizualnie i poddane dalszej charakteryzacji.

w celu analizy selektywności kierunku i orientacji wizualnie reagujących wokseli wskaźniki selektywności kierunku i orientacji (DSI i OSI)40, oparte na dopasowanych profilach von – Misesa lub Gaussa41, obliczono wraz z oszacowaniem ich przydatności do dopasowania, R2. DSI zdefiniowano jako(Rpref−Rnull)/(Rpref + Rnull), gdzie Rpref, odpowiedź na preferowany kierunek, była odpowiedzią całkową w przedziale czasu-preferowanego kierunku. Rnull został podobnie obliczony jako odpowiedź Całkowa wywołana przez kierunek przeciwny do preferowanego kierunku. OSI zdefiniowano jako (Rpref-Rord)/(Rpref + Rord), gdzie Rpref, odpowiedź na preferowaną orientację, była odpowiedzią całkową w stosunku do preferowanego przedziału czasu-orientacji. Rorth został podobnie obliczony jako odpowiedź Całkowa wywołana przez orientację ortogonalną. Aby zminimalizować cross talk i nadmierne dopasowanie związane z metrykami DSI i OSI, podjęto rygorystyczne podejście. Aby voxel był uważany za selektywny kierunkowo (DS) lub selektywny orientacyjnie (OS), zastosowano wzajemnie wykluczające się kryteria: DS if DSI > 0,5 i OSI < 0.5; I OS jeśli OSI > 0.5 i DSI < 0.5. W obu przypadkach wartość dopasowania (R2) dla DSi i OSI, odpowiednio, musiała wynosić >0,8; w ten sposób dopasowane krzywe wyjaśniały co najmniej 80% odpowiedzi całkowych. Pojedynczy rozkład von-Misesa został użyty do dopasowania odpowiedzi wokseli DS i oszacowania ich preferowanego kierunku kąta ruchu od środka dopasowanej krzywej. Suma dwóch von-Misesa (odległość kątowa 180° od siebie) została użyta do dopasowania odpowiedzi OS voxeli i oszacowania ich preferowanej orientacji kątów ruchu ze środków dopasowanych krzywych. Wariancja kołowa została również obliczona dla porównania jako alternatywna metryka selektywności orientacji (wariancja Kołowa < 0,4)41.

analizy morfologiczne

w celu określenia objętości mózgu zobrazowanej w 4 DPF nacre, casper i crystal Tg (elavl3:Gcamp6f), obliczyliśmy liczbę wokseli gcamp6f+ w każdym obrazie objętościowym, stosując funkcję dopasuj>funkcję progu, a następnie analizuj>histogram>polecenie listy w ImageJ42. Następnie uzyskane wartości pomnożono przez objętość pojedynczego wokselu (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

analizy statystyczne

wyniki badań statystycznych podawane są w postaci liczb i legend. Analizy statystyczne i testy przeprowadzono przy użyciu Prism 6 (GraphPad) lub MATLAB R2014b (MathWorks). Przed wykonaniem testów statystycznych, statystyki opisowe (np. testy normalności w celu sprawdzenia, czy wartości pochodzą z rozkładu Gaussa lub F-test w celu porównania wariancji) zostały wykorzystane do wyboru odpowiedniego testu statystycznego (przedstawione na rysunku legendy wraz z wynikami testu). Kryterium istotności statystycznej ustalono na p < 0.05.