Streszczenie
dostępne są różne techniki izolacji Candida w jamie ustnej. Takie metody odgrywają ważną rolę w diagnostyce i leczeniu kandydozy jamy ustnej. Rosnące znaczenie Candida jest częściowo związane z pojawieniem się zakażenia HIV i szerszym stosowaniem chemioterapii immunosupresyjnej. Wraz z Candida albicans było większe uznanie znaczenia nonalbicans Candida gatunków w kandydozie jamy ustnej. Identyfikacja zakażających szczepów Candida jest ważna, ponieważ Izolaty gatunków Candida różnią się znacznie, zarówno pod względem zdolności do wywoływania infekcji, jak i podatności na leki przeciwgrzybicze. Tak więc ten przegląd stanowi przegląd niezawodnych metod izolacji drożdżakowej i identyfikacji izolatów z jamy ustnej.
1. Wprowadzenie
termin Candida pochodzi od łacińskiego słowa candid, oznaczającego biały. Zarodniki Candida są komensalną, nieszkodliwą formą dymorficznego grzyba, który staje się inwazyjnym i patogennym pseudohiphae, gdy występuje zaburzenie równowagi flory lub osłabienie gospodarza .
translacja tego endogennego komensalu do pasożyta chorobotwórczego może być związana z czynnikami innymi niż patogenne atrybuty samego organizmu, co jest raczej unikalne w porównaniu z większością innych chorób zakaźnych, gdzie zjadliwość organizmów uważana jest za kluczowy czynnik w patogenezie. Stąd gatunki Candida są ściśle oportunistyczne. Można by stwierdzić, że przy braku patologii nie można zainicjować ani powierzchownych, ani ogólnoustrojowych form zakażeń Candida .
istnieje wiele gatunków Candida (Tabela 1), ale najbardziej rozpowszechnionym, który jest odzyskiwany z jamy ustnej, zarówno w stanie komensalnym, jak iw przypadkach kandydozy jamy ustnej, jest C. albicans. Szacuje się, że gatunek ten stanowi ponad 80% wszystkich doustnych izolatów drożdży.
Candida albicans
Candida glabrata
Candida dubliniensis
Candida guilliermondii
Candida krusei
, Candida lusitaniae
Candida parapsilosis
candida AP
, candida kefyr
In recent years there has been an increased interest in infections caused by the oportunistic Informatyka Elektronika Telekomunikacja Candida. Rosnące znaczenie Candida jest częściowo związane z pojawieniem się zakażenia HIV i szerszym stosowaniem chemioterapii immunosupresyjnej . Identyfikacja zakażających szczepów Candida jest ważna, ponieważ Izolaty gatunków Candida różnią się znacznie, zarówno pod względem zdolności do wywoływania infekcji, jak i podatności na leki przeciwgrzybicze .
wraz z C. albicans odnotowano większe uznanie znaczenia gatunków innych niż albicans Candida w chorobach człowieka. C. glabrata i C. krusei są gatunkami, które zyskały uwagę ze względu na zwiększoną odporność na niektóre leki przeciwgrzybicze. C. dubliniensis to niedawno zidentyfikowany gatunek chorobotwórczy, opisany po raz pierwszy w 1995 roku, kiedy został współizolowany z C. albicans z przypadków kandydozy jamy ustnej u osób zakażonych HIV .
Ten przegląd zawiera przegląd niezawodnych metod izolacji drożdżakowej i identyfikacji izolatów z jamy ustnej.
2. Patogenne atrybuty Candida
Przejście Candida z nieszkodliwego komensalu do organizmu patogennego jest złożone i jest związane z subtelnymi zmianami środowiskowymi, które prowadzą do ekspresji szeregu czynników zjadliwości (Tabela 2). Jest to połączony efekt zarówno czynników gospodarza, jak i drożdżakowych, które ostatecznie przyczyniają się do rozwoju kandydozy jamy ustnej .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
niezależnie od rodzaju kandydozy, zdolność gatunków Candida do utrzymywania się na powierzchni błon śluzowych osób zdrowych jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do jej zjadliwości. Jest to szczególnie ważne w jamie ustnej, gdzie organizm musi oprzeć się mechanicznemu działaniu płukania stosunkowo stałego przepływu śliny w kierunku przełyku .
nie rozpoznano pojedynczego dominującego czynnika zjadliwości Candida, chociaż istnieje wiele czynników, które zostały zaangażowane w promowanie procesu infekcji. Należą do nich atrybuty związane z adhezją Candida do powierzchni jamy ustnej (np. względna hydrofobowość powierzchni komórki i obecność specyficznych cząsteczek adhezyny), zdolność do przeciwstawiania się mechanizmom obrony immunologicznej gospodarza (np. przełączanie fenotypowe o wysokiej częstotliwości i przejście morfologiczne) oraz uwalnianie enzymów hydrolitycznych (np., wydzielane proteinazy aspartylowe i fosfolipazy), które mogą wywoływać uszkodzenia komórek gospodarza .
3. Kandydoza jamy ustnej
Samaranayake zaproponował klasyfikację, w której zmiany w kandydozie jamy ustnej podzielono na dwie główne grupy: grupę I lub pierwotne kandydozy jamy ustnej ograniczone do zmian zlokalizowanych w jamie ustnej bez udziału skóry lub innych błon śluzowych; grupę II lub wtórne kandydozy jamy ustnej, w których zmiany są obecne w jamie ustnej, a także w miejscach pozaustnych, takich jak skóra (Tabela 3). Zmiany w grupie I składają się z klasycznej triady-pseudomembranous, rumieniowe i hiperplastyczne warianty-a niektóre sugerują dalszy podział tych ostatnich na płytki jak i guzkowe typy .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Rozpoznanie kandydozy jamy ustnej
rozpoznanie kandydozy jamy ustnej często można postawić na podstawie charakteru cech klinicznych, chociaż w miarę możliwości należy pobrać próbki mikrobiologiczne, aby zarówno zidentyfikować, jak i określić ilościowo wszelkie Candida, które mogą być obecne, oraz dostarczyć Izolaty do badań wrażliwości przeciwgrzybiczej.
5. Metody izolacji
dostępne techniki izolacji Candida w jamie ustnej obejmują zastosowanie wymazu, wymazu , Kultury odcisku , pobrania całej śliny , skoncentrowanego płukania jamy ustnej i biopsji błony śluzowej. Każda metoda ma szczególne zalety i wady, a wybór techniki pobierania próbek zależy przede wszystkim od charakteru badanej zmiany (Tabela 4). W przypadku gdy dostępna i zdefiniowana zmiana jest widoczna, często preferowane jest bezpośrednie podejście do pobierania próbek, takie jak użycie wymazu lub odcisku, ponieważ zapewni to informacje o organizmach obecnych w samej zmianie. W przypadkach, w których nie ma widocznych zmian lub w przypadkach, w których zmiana jest trudna do uzyskania, bardziej dopuszczalna jest pośrednia próbka oparta na hodowaniu próbek śliny lub płukaniu jamy ustnej.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
ilościowe oszacowanie obciążenia grzybiczego można wykonać przy użyciu odcisków, stężonego płukania jamy ustnej i hodowli płukania jamy ustnej, jako środka odróżniającego przewóz komensalny od patogennego występowania Candida jamy ustnej, przy czym większe obciążenia uważane są za prawdopodobne w tym ostatnim .
6. W celu identyfikacji należy zbadać mikroskopię bezpośrednią
cechy morfologiczne gatunków Candida (Tabela 5). Rozmaz ma wartość w rozróżnianiu między formami drożdżowymi i myślnikowymi, ale jest mniej wrażliwy niż metody kulturowe . Preparat wodorotlenku potasu (KOH) w próbce ujawnia niepigmentowane przegrody z charakterystycznym dychotomicznym rozgałęzieniem (pod kątem około 45°) . W Koh-Calcofluor fluorescencyjny-plama metoda grzybicze cechy, takie jak hyphae, komórki drożdży, i inne elementy grzybicze będzie fluoresce .
|
||||||||||||||||||||||
rozmaz pobrany z miejsca zmiany chorobowej jest mocowany na szkiełkach mikroskopowych, a następnie barwiony albo bejcą grama, albo techniką okresowego kwasu Schiff (PAS). Stosując te metody, drożdżaki i drożdże drożdżaków pojawiają się albo ciemnoniebieskie (Gram-plama) lub czerwono-fioletowe (PAS).
w przypadku przewlekłej kandydozy hiperplastycznej, biopsja zmiany jest niezbędna do późniejszego wykrycia inwazji Candida przez zabarwienie histologiczne przy użyciu plam PAS lub Gomoriego methenaminy. Demonstracja elementów grzybowych w tkankach odbywa się, ponieważ są one głęboko barwione przez te plamy. Obecność blastospor i hyphae lub pseudohyphae może umożliwić histopatologowi identyfikację grzyba jako gatunku Candida i, biorąc pod uwagę obecność innych cech histopatologicznych, postawić diagnozę przewlekłej hiperplastycznej kandydozy .
7. Posiew laboratoryjny
7.1. Wymaz
wymaz z miejsca zmiany chorobowej jest stosunkowo prostą metodą wykrywania wzrostu i można uzyskać półtrwałą ocenę Candida. Metoda pobierania próbek polega na delikatnym pocieraniu sterylnego wacika bawełnianego nad tkanką uszkodzoną, a następnie zaszczepieniu pierwotnego podłoża izolacyjnego, takiego jak agar dekstrozy Sabourauda (SDA) .
7.2. Skoncentrowane płukanie jamy ustnej
technika płukania jamy ustnej polega na trzymaniu przez 1 minutę w jamie ustnej 10 mL jałowego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (0,01 M, pH 7,2). Następnie roztwór zatęża się (10-krotnie) przez odwirowanie i znaną objętość, zwykle 50 µL, zaszczepia się na podłożu agarowym za pomocą spiralnego systemu galwanicznego. Po 24-48 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C wzrost ocenia się przez wyliczenie Kolonii i wyraża się jako jednostki tworzące kolonie drożdżowe na mL (cfu mL−1) płukania .
7.3. Kultura odcisku
metoda odcisku wykorzystuje sterylną podkładkę piankową o znanej wielkości (zwykle 2,5 cm2), wcześniej zanurzoną w odpowiednim płynnym podłożu, takim jak bulion Sabourauda, bezpośrednio przed użyciem. Podkładka jest następnie umieszczana na miejscu docelowym (błonie śluzowej lub protezie wewnątrzustnej) przez 30 sekund, a następnie przenoszona do agaru w celu hodowli .
8. Pożywki do hodowli
najczęściej stosowanym podstawowym pożywką izolacyjną dla Candida jest SDA, który, chociaż pozwala na wzrost Candida, hamuje wzrost wielu gatunków bakterii jamy ustnej ze względu na niskie pH. włączenie antybiotyków do SDA dodatkowo zwiększy jego selektywność . Zazwyczaj SDA inkubuje się tlenowo w temperaturze 37°C przez 24-48 godzin. Candida rozwija się jako kremowe, gładkie, wklęsłe kolonie na SDA, a różnicowanie między gatunkami jest rzadko możliwe . Szacuje się, że więcej niż jeden gatunek Candida występuje w około 10% próbek doustnych, a w ostatnich latach zdolność do wykrywania gatunków niealbikanów staje się coraz ważniejsza .
w ostatnich latach opracowano inne pożywki różnicujące, które umożliwiają identyfikację niektórych gatunków Candida na podstawie wyglądu Kolonii i koloru po hodowli pierwotnej. Zaletą takich mediów jest to, że obecność wielu gatunków Candida w jednej infekcji można określić, co może być ważne w wyborze kolejnych opcji leczenia . Przykłady obejmują agar Pagano-Levin lub dostępne w handlu agary chromogenne, a mianowicie CHROMagar Candida, albicans ID, Fluroplate lub Candichrom albicans .
agar Pagano-Levin rozróżnia gatunki Candida na podstawie redukcji chlorku trifenylotetrazolu. Pożywka wytwarza kolonie C. albicans o bladym kolorze, podczas gdy kolonie innych gatunków Candida wykazują różne stopnie różowego zabarwienia. Agar Pagano-Levin ma podobną wrażliwość na SDA, ale jest lepszy w wykrywaniu więcej niż jednego gatunku w próbce, CHROMagar Candida identyfikuje C. albicans, C. tropicalis, A C. krusei na podstawie koloru Kolonii i wyglądu, podczas gdy albicans ID i Fluroplate okazały się korzystne dla domniemanej identyfikacji C. albicans . Stwierdzono, że swoistość identyfikacji wynosi 95% dla CHROMagar Candida i 98,6% dla AGARÓW albicans ID i Fluroplate . Zastosowanie Chromagar Candida jako pierwotnego agaru izolacyjnego zostało przytoczone jako podejście, które pozwala na dyskryminację nowo opisanego C. dubliniensis z C. albicans. Na CHROMagar Candida, C. dubliniensis podobno rozwija się jako ciemniejsze zielone kolonie w porównaniu z C. albicans . Jednakże rozróżnienie pomiędzy tymi dwoma gatunkami za pomocą Chromagaru wydaje się zmniejszać wraz z subkulturą i przechowywaniem izolatów. Niepowodzenie wzrostu C. dubliniensis na podłożach agarowych w podwyższonej temperaturze inkubacji 45°C zostało ostatnio zasugerowane jako alternatywny test dla rozróżnienia między tymi dwoma gatunkami .
9. Identyfikacja gatunków Candida
Identyfikacja drożdży w oparciu o pierwotne pożywki hodowlane może być potwierdzona za pomocą różnych badań uzupełniających tradycyjnie opartych na morfologicznych (Tabela 5) i fizjologicznych właściwościach izolatów.
9.1. Kryteria morfologiczne
Test probówki zarodkowej jest standardową laboratoryjną metodą identyfikacji C. albicans. Badanie polega na indukcji wyrostków myślowych (probówek zarodkowych) podczas subkulturacji w surowicy końskiej w temperaturze 37°C przez 2-4 godziny. Około 95% izolatów C. albicans wytwarza kiełki zarodkowe, własność dzieloną również przez C. stellatoidea i C. dubliniensis .
C. albicans i C. dubliniensis można również zidentyfikować z innych gatunków na podstawie ich zdolności do wytwarzania cech morfologicznych znanych jako chlamydospory. Chlamydospory są refraktywnymi, kulistymi strukturami powstałymi na końcu strzępek po hodowli izolatów na pożywce ubogiej, takiej jak agar mąki kukurydzianej. Izolaty są zaszczepiane w krzyżowym wzorze wylęgu na agarze i pokrywane sterylnym coverslip. Agary inkubuje się przez 24-48 godzin w temperaturze 37°C, a następnie bada mikroskopowo na obecność chlamydosporu .
9.2. Kryteria fizjologiczne / Identyfikacja biochemiczna
biochemiczna identyfikacja gatunków Candida w dużej mierze opiera się na wykorzystaniu węglowodanów. Tradycyjne badania obejmowałyby hodowlę izolatów testowych na podstawowym agarze pozbawionym źródła węgla. Roztwory węglowodanów umieszcza się następnie w studzienkach wysiewanego agaru lub na tarczach bibuły filtracyjnej umieszczonych na powierzchni agaru. Wzrost w pobliżu źródła węgla wskazywałby na wykorzystanie. Systemy komercyjne opierają się na tej samej zasadzie, ale testowane węglowodany są umieszczone w plastikowych studzienkach umieszczonych na pasku testowym. Wzrost w każdej studni jest odczytywany przez zmiany zmętnienia lub zmiany koloru w niektórych systemach zestawów. Kody numeryczne uzyskane na podstawie wyników badań są wykorzystywane do identyfikacji organizmu badanego na podstawie porównania bazy danych .
9.3. Serologia
testy serologiczne są często stosowane w celu ustalenia znaczenia klinicznego szczepów Candida. Wzrost miana przeciwciał lgG przeciwko C. albicans może odzwierciedlać inwazyjną kandydozę u osób z odpornością. Wykrywanie przeciwciał IgA i IgM jest ważne dla identyfikacji ostrej infekcji. Osoby z immunosupresją często wykazują zmienność w produkcji przeciwciał i w takim przypadku zaleca się stosowanie testu wykrywania antygenu. Testy takie jak enzym linked immunosorbent assay (ELISA) i radio immuno assay (RIA) do wykrywania antygenu kandydującego, albo Mannan ściany komórkowej lub składniki cytoplazmatyczne są obecnie dostępne w krajach rozwiniętych .
diagnostyka serologiczna jest często opóźniona, a w badaniach nadal brakuje czułości i swoistości. Ponadto wytwarzanie przeciwciał u pacjentów z obniżoną odpornością jest zmienne, co komplikuje diagnozę . Wynika to z faktu, że antygeny grzybicze i metabolity są często szybko usuwane z krążenia, a obecność przeciwciał nie zawsze oznacza zakażenie Candida, zwłaszcza u pacjentów z poważną chorobą podstawową lub przyjmujących leki immunosupresyjne .
testy serologiczne nie są zwykle narzędziem diagnostycznym w przypadku kandydozy jamy ustnej. Jednak takie testy mogą być narzędziem prognostycznym u pacjentów z ciężką kandydozą jamy ustnej, którzy słabo reagują na leczenie przeciwgrzybicze .
9.4. Molekularne metody identyfikacji
Identyfikacja poprzez analizę zmienności genetycznej jest bardziej stabilnym podejściem niż stosowanie metod opartych na kryteriach fenotypowych. Do identyfikacji Candida w oparciu o zmienność genetyczną są Analizy elektroforetycznych różnic kariotypu i polimorfizmów długości fragmentu restrykcyjnego (rflps) przy użyciu elektroforezy żelowej lub hybrydyzacji DNA-DNA .
metody PCR specyficzne dla gatunku zostały również wykorzystane do identyfikacji gatunków Candida. Opisano kilka genów docelowych dla dyskryminacji gatunków Candida, chociaż te najczęściej amplifikowane są sekwencjami rybosomalnego RNA Operonu. Identyfikacja może być uzyskana na podstawie wielkości produktu PCR uzyskanego po rozpuszczeniu elektroforezy w żelu lub zmiany sekwencji produktu PCR określonej przez bezpośrednie sekwencjonowanie lub przez zastosowanie analizy fragmentu restrykcyjnego po cięciu sekwencji PCR endonukleazami restrykcyjnymi .
fluorescencja in situ hybridization z Peptide nucleic acid method (pna Fish) jest nową techniką detekcji, która celuje w wysoce zachowane sekwencje specyficzne dla gatunku w obfitym rRNA żywych C. albicans. Pojedyncze komórki mogą być wykrywane bezpośrednio bez potrzeby wzmacniania . Technika ta osiąga czułość 98,7-100%, ze swoistością 100%, pozwalając na rozróżnienie C. albicans od fenotypowo podobnego C. dubliniensis .
Technologia molekularna może być również używana do identyfikacji szczepów gatunków Candida, chociaż zastosowanie technik takich jak elektroforeza w żelu impulsowym (PFGE), Analiza Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD) i amplifikacja sekwencji powtórzeniowej PCR (REP) są w dużej mierze zarezerwowane dla badań epidemiologicznych w badaniach nad kandydozą jamy ustnej .
10. Wnioski
w ostatnich latach położono większy nacisk na wiarygodną identyfikację gatunków Candida z ludzkich próbek klinicznych. Schematyczne przedstawienie izolacji i identyfikacji drożdżaków przedstawiono na fig. 1. Ponieważ Candida jest mikroflorą rezydującą, wymagane są odpowiednie metody izolacji, aby ustalić obecność w jamie ustnej wraz z ich liczbą. Ważne jest również, aby zidentyfikować szczepy zakażające Candida, ponieważ Izolaty gatunków Candida różnią się znacznie, zarówno pod względem zdolności do wywoływania infekcji, jak i podatności na leki przeciwgrzybicze. Różne techniki fenotypowe są dostępne do identyfikacji izolowanych Candida w tym za pomocą morfologicznych testów Kultury, różnicowego agar media, i biochemiczne testy asymilacji. Metody te są uzupełniane najnowszymi technikami molekularnymi w dużej mierze zarezerwowanymi dla badań epidemiologicznych.
