wyniki

ekspresji ALDH1 w zarodku i dorosłej trzustce.

na podstawie wcześniejszych badań dokumentujących wysoki poziom aktywności enzymatycznej ALDH1 w progenitorach nerwowych, krwiotwórczych i nabłonkowych sutka (17-19), scharakteryzowaliśmy temporalne i przestrzenne wzorce ekspresji białka ALDH1 w zarodkowej i dorosłej trzustce myszy (Fig. 1). Stosując e-kadherynę jako marker komórek nabłonka trzustki, odkryliśmy, że białko ALDH1 jest najpierw wykrywalne w rozwijającym się nabłonku trzustki na E12.5 (Fig. 1a). W tym momencie wyrażenie jest ograniczone do końcówek kanalików rozgałęziających, ostatnio zaproponowanych jako reprezentująca wielotencjalną domenę progenitorową (20). Podobny wzór ekspresji został wcześniej zgłoszony dla transkryptów Aldh1a1 (21). Ekspresja w końcówkach rurowych (a nie w centralnych pniach) utrzymuje się przez E14 .5 (rys. 1 B i B’), a następnie jest regulowany w różnicowaniu komórek acynarnych. W dorosłej trzustce ekspresja aldh1 nabłonka jest najczęściej obserwowana w centroacynarnych i końcowych komórkach nabłonka (Fig. 1 C-E). Wykryto również mezenchymalne (ujemne e-cadheryny) komórki ekspresji ALDH1 otaczające wysepki endokrynologiczne i zewnątrzwydzielnicze acini (Fig. S1).

do dalszego scharakteryzowania ekspresji ALDH1 i aktywności enzymatycznej ALDH1 w dorosłych końcowych komórkach kanałowych/centroacynarnych zastosowaliśmy preparaty obwodowych jednostek acinarowo-przewodowych świeżo wyizolowanych z egzokrynnej trzustki myszy trawionej kolagenazą (22). Co ważne, te izolowane obwodowe jednostki acinar-Dual są znacznie wyczerpane z dużych kanałów i elementów endokrynologicznych. W porównaniu z całkowitą trzustką, w obwodowych jednostkach acinarowo-kanałowych wykazano>400-krotne zmniejszenie transkryptów insuliny, oceniane metodą RT-PCR (Fig. S2A). Gdy przeprowadzono analizę FACS na obwodowych jednostkach acinar-ductal zebranych z transgenicznych myszy Ins1: dsred eksprymujących czerwone białko fluorescencyjne w komórkach β, tylko 3 z 10 000 komórek (0,03%) tego preparatu były dodatnie dla DsRed.

dodatkową trójwymiarową charakterystykę ekspresji białka ALDH1 uzyskano stosując znakowanie fluorescencyjne z pełnym mocowaniem izolowanych obwodowych jednostek acinar-Dual. Białko ALDH1 lokalizowane było w połączeniu z e-kadheryną jako markerem komórek nabłonkowych i albo ze skoniugowaną FITC dolichos biflorus aglutyniną (DBA), albo skoniugowaną FITC aglutyniną z orzeszków ziemnych (pna), markerami odpowiednio komórek przewodowych i acinarnych. Obrazowanie wielokanałowe potwierdziło głównie centroacynarne / końcowe położenie kanałowe komórek nabłonkowych wykazujących ekspresję ALDH1 w dorosłej trzustce (Fig. S3). Komórki wykazujące ekspresję ALDH1 były najczęściej międzykomórkowe pomiędzy nabłonkiem końcowego przewodu pokarmowego a komórkami bardziej obwodowymi. Ponadto zaobserwowano również pojedyncze komórki nabłonkowe wykazujące ekspresję ALDH1 bezpośrednio przylegające do końcowego nabłonka przewodowego (Fig. S3 A i B). Zidentyfikowano zarówno DBA-dodatnie, jak i dba-ujemne komórki ALDH1-dodatnie, podczas gdy ALDH1-dodatnie komórki pna-dodatnie tylko rzadko.

Izolacja komórek Centroacynarnych i końcowych przewodów EKSPRESUJĄCYCH ALDH1.

w nadziei na wyizolowanie komórek ekspresyjnych ALDH1 z dorosłej trzustki myszy, wykorzystaliśmy substrat fluorogenny znany jako „Aldefluor” (technologie StemCell), który wcześniej był stosowany w oparciu o FACS izolowaniu hematopoetycznych, nerwowych i sutkowych nabłonkowych komórek macierzystych (17-19). Przed podjęciem próby izolacji komórek nabłonka trzustki wyrażających ALDH1 w oparciu o FACS, najpierw zastosowaliśmy ten odczynnik do wizualizacji żywych komórek wyrażających ALDH1 w obwodowych jednostkach acinar-Dual (Fig. 2). Jak pokazano na Fig. 2 E I F, badania te potwierdziły lokalizację centroacynarowo-kanałową komórek aldefluor-dodatnich o małej liczebności w dorosłej trzustce myszy. Komórki centroacynarowo-końcowe przewodu aldefluorowo-dodatnie łatwo odróżniano od sąsiednich komórek acinarnych ze względu na ich mały rozmiar i brak granulek zymogenu. Dodatkowe przykłady obrazowania żywych komórek przy użyciu odczynnika Aldefluoru przedstawiono na Fig. S4. Wyniki te sugerowały, że Immunofluorescencja anty-ALDH1 i cytofluor na bazie Aldefluoru oznaczały podobną populację centroacynarowo-kanałową, a ponadto sugerowały, że komórki te mogą być skutecznie izolowane przez FACS.

następnie wykonaliśmy charakterystykę i sortowanie pojedynczych komórek dysocjowanych z obwodowych jednostek acinar-ductal. Jako początkowy sposób ustalenia specyficznego bramkowania komórek ekspresyjnych ALDH1, zastosowaliśmy farmakologiczny inhibitor aktywności enzymatycznej ALDH1 (DEAB). Jak przedstawiono na Fig. 2 A–D, Strategia ta pozwoliła na izolację populacji komórek o niskiej obfitości charakteryzującej się wysokim poziomem wrażliwej na DEAB aktywności enzymatycznej ALDH1, obejmującej 0,9% ± 0.2% wszystkich posortowanych komórek dorosłej myszy trzustki. Stosując przeciwciało e-cadheryny do jednoczesnej identyfikacji komórek nabłonkowych, stwierdzono, że komórki Aldefluoru (+) E-cadheryny (+) reprezentują 0,5% ± 0,13% wszystkich posortowanych komórek w dorosłej trzustce myszy (Fig. 2D).

używając ilościowego RT-PCR do porównania populacji aldefluor-dodatnich, e-cadherin-dodatnich (A+E+), aldefluor-ujemnych, e-cadherin-dodatnich (A−E+), aldefluor-dodatnich, e-cadherin-ujemnych (A+E−) i aldefluor-ujemnych, e-cadherin-ujemnych (a−e−) wyizolowanych z dorosłej trzustki myszy, stwierdzono, że populacja A+E+ została znacząco wzbogacona w transkrypty kodujące aldh1a1 i aldh1a7 oraz wyczerpane transkrypty dla dwóch innych izoform aldh1, aldh1a2 i Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 nie został wykryty w żadnej z próbek. W porównaniu z populacją A−E+, komórki A+E+ nieznacznie wyczerpały transkrypty dla Pdx1 (P < 0,09), amylazy (p < 0,001) i Cytokeratyny-19 (p < 0,01) (markery wyrażone odpowiednio w zróżnicowanych komórkach β, komórkach Acinarnych i komórkach kanałowych). Natomiast komórki A + E + charakteryzowały się wysokim poziomem ekspresji Ptf1a, pomimo że były one wyczerpane zarówno transkryptów amylazy, jak i białka amylazy (Fig. 3G i Fig. S5). Ponadto komórki te wzbogacono o transkrypty kodujące SCA-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 i Hey2, markery wcześniej związane z populacjami progenitorowymi w trzustce i innych tkankach. Stosując znakowanie immunofluorescencyjne na prepach cytospin komórek sortowanych FACS, potwierdziliśmy znaczne wzbogacenie białka ALDH1 i Sox9 oraz wyczerpanie amylazy w komórkach A + E+ (Fig. S5). Ponadto przeprowadziliśmy również analizę FACS w celu określenia częstotliwości, z jaką komórki Aldefluoru (+) były również dodatnie dla markerów komórek macierzystych, takich jak CD133 i białko Sca-1, i zaobserwowaliśmy, że ponad 90% komórek Aldefluoru (+) dodatkowo współwystępowało oba te markery komórek macierzystych. Natomiast tylko 0,11% komórek Aldefluoru ( + ) było dodatnich dla markera śródbłonka naczyniowego PECAM, podczas gdy 0,08% było dodatnich dla markera hematopoetycznego CD45. Po przeprowadzeniu analizy FACS na obwodowych jednostkach acinarowo-kanałowych pobranych od transgenicznych myszy Ins1-DsRed wykazujących ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego w komórkach β, wszystkie komórki Aldefluoru ( + ) okazały się ujemne dla dsRed.

badanie funkcji hormonalnej i zewnątrzwydzielniczej.

jako wstępne badanie aktywności progenitorowej, zbadaliśmy komórki Aldefluoru (+) i aldefluoru (-) pod kątem zdolności do tworzenia pankreatosfery (Fig. 3), podobny do testu neurosferycznego powszechnie stosowanego do identyfikacji neuronowych progenitorów (23). W tych testach komórki A+ E + centroacynarne/końcowe były wyjątkowo zdolne do tworzenia sfer w hodowli zawiesinowej. Komórki A+ E + wykazywały sprawność formowania kuli >100 razy większą niż ich odpowiedniki A−E+ (rys. 3 A i B oraz tabela S1). Przy niższej wydajności pojedyncze komórki A + E+ były nawet w stanie tworzyć kule, gdy były platerowane przy gęstości klonalnej (jedna komórka na studzienkę) w płytkach 96-studzienkowych (tabela S1). Żadna z ujemnych populacji e-kadheryny nie wykazywała znaczącej zdolności sferycznej. Podczas hodowli w okresie 5-7 dni pankreatosfery pochodzące z komórek A + E+ wykazywały silną ekspresję e-kadheriny (Fig. 3C), potwierdzając ich tożsamość nabłonkową, a poszczególne komórki w sferach zaczęły gromadzić znaczne ilości amylazy lub insuliny i peptydu insuliny C (Fig. 3 D i E). Po 5 dniach, ≈50% pankreatosfery wykazywało ekspresję amylazy, podczas gdy około 30% wykazywało immunoreaktywność wobec peptydu insuliny C. W poszczególnych sferach na ogół stwierdzono obecność insuliny lub amylazy, ale nie obu tych czynników. Małe podgrupy komórek w sferach utrzymywały ekspresję ALDH1 w okresie hodowli, a także wykazywały ekspresję jądrową białka Sox9 (Fig. 3 F I G), co sugeruje możliwość utrzymania samoodnawiającej się Puli progenitorowej. Ta pozorna zdolność do samoodnawiania była dodatkowo wspierana przez fakt, że pankreatosfery wytwarzane przez centroacynarne/końcowe komórki kanałowe Aldefluoru (+) mogły być poddawane seryjnej enzymatycznej dysocjacji, utrzymując swoją zdolność formowania sfer przez co najmniej trzy sekwencyjne przejścia w 7-dniowych odstępach. Ponadto, komórki w sferach były silnie proliferacyjne, jak oceniono przez nocną inkorporację EdU dodanego na początku lub na końcu okresu hodowli (Fig. 3H).

opierając się na różnych zdolnościach komórek progenitorowych wyświetlanych przez komórki A+E+, zbadaliśmy posortowane populacje komórek pod kątem ekspresji ngn3, markera komórek progenitorowych układu hormonalnego (Fig. S2B). Zgodnie z wcześniejszymi badaniami (7) nie byliśmy w stanie wykryć znaczącej ekspresji Ngn3 ani w całkowitej dorosłej trzustce, ani w żadnej ze świeżo posortowanych populacji komórkowych. Jednakże, po umieszczeniu komórek A + E+ w hodowli, zaczęły one generować wykrywalną ekspresję Ngn3 bezpośrednio poprzedzającą początek ekspresji insuliny, co dodatkowo potwierdzało endokrynologiczne zdolności progenitorowe centroacynarnych i końcowych komórek nabłonka przewodu pokarmowego wykazujących ekspresję ALDH1.

Trzustosfery pochodzące z Aldefluoru (+) w końcowych przewodach/Centroacynarach wykazują wydzielanie insuliny reagujące na glukozę.

wykrycie komórek ekspresji insuliny i peptydu insuliny C w hodowanych pankreatosferze skłoniło do oceny, czy komórki te są zdolne do wydzielania insuliny reagującej na glukozę, co jest charakterystyczne dla funkcjonalnych komórek β. Jako pozytywną kontrolę wykorzystaliśmy komórki Ins-1 (Klon 832/13) uwiecznioną linię komórek β powszechnie stosowaną do badań wydzielania insuliny w odpowiedzi na fizjologiczne stężenia glukozy. Po nocnej inkubacji pankreatosfery lub komórek Ins-1 w glukozie 0, 5 i 11 mM, zarówno supernatanty z pożywki hodowlanej, jak i lizaty komórkowe zebrano i oznaczono dla wydzielanego i komórkowego peptydu insuliny C, stosując test ELISA. Trzustosfery pochodzące z aldefluoru ( + ) centroacynar/końcowe komórki kanałowe wydzielały peptyd C w sposób zależny od glukozy, z wrażliwością na glukozę podobną do tej wykazywanej przez komórki Ins-1 (Fig. 3i).

Aldefluor (+) Dorosłe końcowe komórki kanałowe/Centroacinarne mogą przyczyniać się do powstawania zarodkowych linii endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych.

jako jeszcze bardziej rygorystyczny test aktywności progenitorowej trzustki, wyizolowaliśmy wyizolowane komórki Aldefluoru (+) i aldefluoru (–) w mikrodissowane grzbietowe pąki trzustki wyizolowane z zarodków myszy E12.5 i zbadaliśmy zdolność do produktywnego przyczyniania się do rozwoju linii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej (Fig. 4). Podejście to zostało ostatnio wykorzystane do udokumentowania aktywności progenitorowej komórek ekspresji Ngn3 powstających po podwiązaniu przewodu trzustkowego (7). Aby prześledzić rodowód dorosłych komórek dawców i odróżnić je od ich odpowiedników pochodzących z zarodków, wyizolowaliśmy komórki Aldefluoru (+) i aldefluoru (-) z trzustki myszy niosących wszechobecnie wyrażony transgen pCAG:mCherry, jak schematycznie przedstawiono na Fig. 4A (pCAG:myszy mCherry zostały dostarczone przez Michaela Wolfganga, Johns Hopkins University). W porównaniu z komórkami Aldefluoru ( – ), komórki Aldefluoru (+) wykazywały znacznie zwiększony potencjał, aby przyczyniać się do powstawania linii endokrynologicznych w dojrzewających topach grzbietowych, co wykazano przez współwystępowanie mCherry z peptydem C (Fig. 4 B-E) lub glukagon (ryc. 4 F–I). Używając nałożonego oznakowania e-cadherin, aby umożliwić liczenie pojedynczych komórek mCherry ’ ego-dodatnich, oceniliśmy ilościowo zdolność dorosłych komórek Aldefluoru (+) i aldefluoru (−) do wchodzenia w linie embrionalne. Siedem dni po mikroiniekcji komórek Aldefluoru (+) do E12.5 pąków grzbietowych ekspresję glukagonu obserwowano w 11,7% pozostałych komórek mCherry ’ ego dodatnich, a ekspresję peptydu insuliny C obserwowano dodatkowo w 11,6% (Fig. 5N). Natomiast 2,4% resztkowych komórek aldefluoru (-) mCherry − dodatniego wyrażało glukagon, a tylko 0,2% wyrażało peptyd insuliny C. Co ciekawe, populacje Aldefluoru (+) i aldefluoru (–) wykazywały równoważne zdolności do wchodzenia w nieendokrynne linie nabłonkowe, być może odzwierciedlając fakt, że większość populacji aldefluoru (–) składała się z już zróżnicowanych komórek acinarnych. Podobną częstość występowania e-cadheriny, amylazy i pna zaobserwowano w pozostałych komórkach mCherry ’ ego-dodatnich pochodzących z populacji Aldefluoru (+) lub aldefluoru ( – ) (Fig. 4 J–N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

aby ocenić in vivo zachowanie komórek centroacynarnych i końcowych kanałów ekspresji ALDH1, oceniliśmy wzorce ekspresji ALDH1 w ustawianiu przewlekłego zapalenia i regeneracyjnej metaplazji indukowanej przez sekwencyjne podawanie małej dawki caeruleiny. Jak wcześniej informowano (15), leczenie dorosłych myszy trzema zastrzykami caeruleiny (50 µg/kg mc.) na tydzień przez 3 kolejne tygodnie wywoływało stan przewlekłego zapalenia trzustki, po którym następowała prawie całkowita regeneracja i naprawa. Proces ten charakteryzuje się naciekami zapalnymi, ekspansją zrębową i tworzeniem regeneracyjnych metaplastycznych kompleksów rurkowych, które obejmują kompleksy rurkowe typu 1, wcześniej wykazywane jako acynarne pochodzące z komórek, oraz kompleksy rurkowe typu 2 (TC2), wcześniej wykazywane jako nieacynarne Pochodzące i prawdopodobnie powstałe z proliferujących komórek kanału końcowego (15). W przeciwieństwie do stosunkowo małej liczebności końcowych przewodów ekspresujących ALDH1 i komórek centroacinarnych obserwowanych w normalnej dorosłej trzustce (Fig. 5 a i B), kanał końcowy wyrażający ALDH1 (rys. 5 C i D) i centroacinar (rys. 5 E i F) komórki były znacznie rozszerzone w leczeniu przewlekłego zapalenia trzustki wywołanego przez caeruleinę. Należy zauważyć, że kompleksy rurkowe typu 2 składały się głównie z komórek wyrażających ALDH1 (Fig. 5h), podczas gdy kompleksy rurkowe typu 1 nie wykazywały ekspresji ALDH1 (Fig. 5G).