the incPRINT method to identify RNA–protein complexes

aby identyfikować interakcje RNA–protein systematycznie w żywych komórkach, opracowaliśmy metodę, która mierzy interakcje komórkowe między dowolnym oznaczonym testem RNA a dowolnym oznaczonym testem białkowym. Zasada incPRINT polega na przejściowej podwójnej ekspresji oznaczonego MS2 testowego RNA i oznaczonego FLAG testowego białka w komórkach HEK293T stabilnie ekspresji detektora lucyferazy połączonego z białkiem powłoki MS2 (MS2CP) z genomicznie zintegrowanego plazmidu (Fig. 1). Testowy RNA jest przywiązany do detektora lucyferazy poprzez interakcję MS2-MS2CP; kompleks RNA-lucyferazy jest jednocześnie oczyszczany z oznaczonym znacznikiem FLAG białkiem testowym immunoprecypitowanym z lizatów komórkowych przez przeciwciało anty-FLAG (Fig. 1). Pośrednie interakcje RNA-białka mostkowane przez DNA są eliminowane przez leczenie Dnazą po etapie lizy komórek. Aby wykryć każdą interakcję RNA z białkiem, RNA-MS2 oczyszczony jednocześnie z oznaczonym FLAG testem białkiem mierzy się za pomocą mierzalnej luminescencji lucyferazy (Fig. 1). Aby kontrolować poziom ekspresji badanych białek, liczebność badanych białek mierzy się metodą ELISA przy użyciu drugiego przeciwciała anty-FLAG sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) (Fig. 1). Metoda incPRINT jest elastyczna w skali, przydatna jako test o niskiej lub wysokiej przepustowości. Aby umożliwić systematyczną, wysokoprzepustową identyfikację komórkowych interakcji RNA z białkiem, wygenerowaliśmy dostosowaną bibliotekę ∼3000 ludzkich białek oznaczonych FLAG, w tym ∼1500 znanych RBPs (na podstawie refs. 10,11), ∼1300 czynników transkrypcji12 i ∼170 białek związanych z chromatyną. Oznaczoną zawartość białka można dostosować do żądanej konfiguracji eksperymentalnej.

incPRINT niezawodnie wykrywa interakcje komórkowe RNA z białkiem

aby ustalić incPRINT, przeprowadziliśmy serię eksperymentów na małą skalę, wykorzystując zachowany obszar Xist lncRNA o wartości ∼1 kb, zwany powtórzeniem a, zwany dalej Xist(a)13. Ponieważ kilka interakcji Xist (a) – białko zostało dobrze ustalonych7, służyły one jako kontrola w naszych początkowych eksperymentach incPRINT. Zaprojektowaliśmy konstrukcję do ekspresji Xist(a)-MS2 i zbadaliśmy zdolność RNA Xist (a)-MS2 do interakcji z wybranym zestawem wcześniej zidentyfikowanych protein wiążących Xist7,14,15. Do kontroli ekspresji RNA zastosowano niedyskryminujące białko wiążące Poli (a) PABPC3, a EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) jako kontrolę negatywną. luminescencja incPRINT wykryła specyficzne interakcje Xist(a)-MS2 z SPEN, RBM15, RBM15B, YTHDC1, HNRNPC, SRSF7 i RALY, podczas gdy HNRNPU, zgłoszony do wiązania pełnej długości Xist, ale nie konkretnie Xist (a) 7, a EGFP wykazał Wiązanie podstawowe (Fig. 2A). Leczenie Rnazą zniosło sygnał interakcji RNA z białkiem mierzony przez lucyferazę, podczas gdy ekspresja badanych białek wykrytych przez ELISA pozostała w większości niezmieniona (Fig. 2A, dodatkowe rys. 1a), wykazując, że interakcje między znakowanymi białkami a detektorem lucyferazy były mostkowane przez RNA.

aby zoptymalizować liczbę pętli macierzystych MS2 używanych do oznaczania testowanego RNA, Xist(a) połączono z dwoma, czterema, sześcioma, dziesięcioma lub 24 pętlami macierzystymi MS2, a ich interakcje z zestawem białek kontrolnych testowano w małym eksperymencie incPRINT. Wzrost natężenia luminescencji bezpośrednio skorelowany ze zwiększoną liczbą pętli macierzystych MS2 do dziesięciu pętli macierzystych bez wyraźnego zwiększenia wiązania z kontrolą EGFP(dodatkowe rys. 1B). Dlatego we wszystkich późniejszych eksperymentach incPRINT RNA zostały oznaczone dziesięcioma pętlami macierzystymi MS2.

w celu ustalenia,czy interakcje RNA z białkiem wykryte przez incPRINT rzeczywiście wystąpiły w komórkach,czy powstały dopiero in vitro po lizy16, 17, 18 komórek, zmierzono i porównano sygnał luminescencji z dwóch niezależnych eksperymentów. W pierwszym eksperymencie, RNA Xist(a)-MS2 i białka testowe oznaczone tagiem FLAG były współtransfekowane w tej samej populacji komórek, jak opisano powyżej. W drugim eksperymencie RNA Xist (a)-MS2 i białka testowe oznaczone znacznikiem FLAG transfekowano oddzielnie w dwóch różnych populacjach komórkowych i połączono ze sobą dopiero po etapie lizy komórek, umożliwiając tworzenie kompleksów RNA–białkowych wyłącznie in vitro (Fig. 1c). Odkryliśmy, że interakcje były preferencyjnie wykrywane, gdy RNA Xist(a)-MS2 i białka oznaczone tagiem FLAG były współtransfekowane (standardowy warunek incPRINT; Fig. 2b). Wyniki te sugerują, że ilekroć sygnał interakcji został wykryty przez incPRINT, wynikał on z kompleksów RNA-białkowych utworzonych w komórkach, podczas gdy skojarzenie kompleksów RNA–białkowych po lizie komórek wydawało się nieistotnym tłem w Warunkach specyficznych dla incPRINT (Fig. 2b). Razem wzięte, te eksperymenty ustalają, że incPRINT mierzy komórkowe interakcje RNA z białkiem za pomocą odczytu luminescencji.

wysokoprzepustowa Detekcja oddziaływań RNA-białko

aby przetestować skalowalność incPRINT do systematycznej identyfikacji oddziaływań RNA–białko, przesłuchaliśmy naszą dostosowaną bibliotekę ~3000 oznaczonych FLAG ludzkich białek (w tym ∼1500 znanych RBPs10,11, ∼1300 czynników transkrypcji12 i ∼170 białek związanych z chromatyną), z Xist(a)–MS2. W celu wzmocnienia zaufania do interakcji RNA–białko zidentyfikowanych przez incPRINT, wszystkie interakcje były testowane w biologicznych duplikatach, generując dwie wartości luminescencji (intensywność interakcji RNA–białko) i dwie wartości ELISA (poziom ekspresji białka testowego) dla każdej badanej pary RNA–białko. Po odfiltrowaniu białek wyrażonych na niewystarczającym poziomie (patrz rozdział „metody”), analizowano dane dotyczące interakcji dla 2405 białek. odtwarzalność incPRINT oceniono poprzez obliczenie wyników korelacji biologicznych duplikatów dla obu luminescencji (Fig. 2c; R2 = 0.87) i sygnały ELISA (rys. 2d; R2 = 0,99). W szczególności nie wykryto korelacji między wartościami luminescencji i ELISA, co wskazuje, że intensywność interakcji nie była jedynie odzwierciedleniem poziomów ekspresji białka (Fig. 2e). Podsumowując, nasze dane pokazują, że incPRINT jest skalowalną metodą o wysokiej przepustowości, która w sposób powtarzalny mierzy interakcje RNA z białkiem w komórce.

incPRINT identyfikuje proteom RNA o niskiej ekspresji

następnie staraliśmy się sprawdzić, czy incPRINT może skutecznie identyfikować białka oddziałujące z transkryptami wyrażonymi na niskich poziomach endogennych. Identyfikacja proteiny kojarzący z niski Kopia liczba RNA jest ogólnie trudny gdy using RNA affinity capture-MS podejście należny typowo niska wydajność RNA puryfikacja i duży ilość materiał wymagający dla masowy spektrometria. Ponieważ Firre jest funkcjonalnie ważnym lncRNA, który moduluje architekturę jądrową wyższego rzędu w chromosomach19 i ma raczej niską endogenną obfitość (∼20 cząsteczek na komórkę w oparciu o dane RNA-Seq w różnych tkankach myszy), oceniliśmy jego RBP-interactome za pomocą incPRINT. Transkrypt Firre o Pełnej długości oznaczony przez MS2 był wyrażany ∼40-krotnie wyżej niż endogenny FIRRE w komórkach HEK293T używanych do inkprint(Fig. 2A). Jak podano dla endogennej transkryptu19, Firre-MS2 lokalizowano preferencyjnie w stosunku do jądra (Fig. 2b). Badając naszą bibliotekę około 3000 białek, incPRINT zidentyfikował zestaw specyficznych białek jako Interaktor Firre(rys. 3a, czerwone kropki; dane uzupełniające 1), podczas gdy większość białek nie oddziaływała z Firre (Fig. 3A, szare kropki; dane uzupełniające 1). Co ważne, incPRINT zidentyfikował zarówno znane, jak i nowe białka oddziałujące na Firre. CTCF i HNRNPU, wcześniej zgłoszone przez dwa niezależne badania, aby wiązać Firre i być ważne dla jego funkcji19, 20, zostały również zidentyfikowane przez incPRINT (Fig. 3A). Aby zweryfikować wiązania nowych interaktorów Firre, przeanalizowaliśmy kodowanie eCLIP data21. Dane eCLIP, dostępne dla siedmiu zidentyfikowanych przez Incprint RBP oddziałujących z Firre, potwierdziły ich wiązanie z Firre w linii komórkowej K562, dodatkowo potwierdzając metodę incPRINT(dodatkowe rys. 2c; dane uzupełniające 2). Zgodnie z rolą Firre w organizacji19, zestaw interakcji Firre zidentyfikowanych przez incPRINT były białka związane z chromatyną, w tym CHD1, POU5F1, JARID2, EPC1, SATB1, MECP2, AEBP2 i CTCF (dane uzupełniające 1). Analizy domen białek wykazały, że białka oddziałujące na Firre zostały znacząco wzbogacone dla motywu rozpoznawania RNA (RRM) (Fig. 3b; dane uzupełniające 3).

w celu określenia, czy do skutecznego zidentyfikowania białek wiążących się z RNA o niskim poziomie endogennym wymagane jest nadekspresja RNA, testowano zestaw białek o różnych stężeniach Firre-MS2, począwszy od nadekspresji, jak opisano powyżej, do poziomów porównywalnych z endogennym FIRRE w komórkach HEK293T (Fig. 2d, e). Podczas gdy nadekspresja RNA powodowała wyższe wyniki interakcji, umożliwiając ich lepsze oddzielenie od wyników tła, sygnał lucyferazy był solidnie wykrywalny powyżej sygnału tła, gdy stosowano rozcieńczenia Firre-MS2(Fig. 2d). Co ważne, sygnał ten nie był związany z poziomem ekspresji białka testowego (dodatkowe rys. 2e). Łącznie dane te pokazują użyteczność incPRINT w identyfikacji białek związanych z transkryptami wyrażonymi na niskich poziomach endogennych.

incPRINT identyfikuje partnerów interakcji specyficznych dla regionu RNA

ponieważ wiele lncrna funkcjonuje jako modułowe rusztowania, umożliwiające Wiązanie specyficznych RBPs z dyskretnymi domenami rna1,5, staraliśmy się sprawdzić, czy incPRINT pozwala na identyfikację interakcji specyficznych dla domeny RNA. Idealną cząsteczką potwierdzającą zasadę jest lncRNA Xist, biorąc pod uwagę jej istotną rolę w inaktywacji chromosomu X ssaków (XCI)22,23 oraz jej modułową strukturę i funkcję. Transkrypt Xist o długości ∼17 kb zawiera kilka zachowanych regionów sekwencji (zwanych powtórzeniami od A do F), które pełnią różne funkcje podczas procesu XCI, w tym inicjację wyciszania genów (powtórzenie a), utrzymanie stanu nieaktywnego X (powtórzenia F i B) oraz właściwą lokalizację chromosomów i ogniskową akumulację Xist (powtórzenia C i E)13,24,25,26,27,28,29,30,31,32 (Fig. 4a). Ponadto w kilku niezależnych badaniach zidentyfikowano i zwalidowano zestaw funkcjonalnych interakcji białkowych z pełnowymiarowym Xist7,14,15,26,28,33,34,35. Staraliśmy się zastosować incPRINT do trzech konserwatywnych regionów myszy Xist, tj. Xist(a), Xist(F) i Xist(C) (rys. 4a). Podczas ekspresji w komórkach HEK293T stosowanych do inkprint, każdy fragment Xist-MS2 wykazywał inny poziom ekspresji w porównaniu do endogennego Xist, od ∼60-krotnego wzrostu dla Xist (a) do prawie endogennego poziomu ekspresji dla Xist(C) (Fig. 3A). Wszystkie pojedyncze fragmenty Xist-MS2 lokalizowano preferencyjnie w stosunku do jądra, podobnie jak ich endogenny odpowiednik o Pełnej długości (Fig. 3b). Każdy region Xist (tj., Xist (a), Xist(F) i Xist(C)) był przesłuchiwany z naszą biblioteką około 3000 białek. Aby porównać sygnały w poszczególnych regionach Xist wyrażone na różnych poziomach (dodatkowe rys. 3C), wyniki interakcji dla każdego regionu Xist znormalizowano za pomocą danych wiążących RNA MS2 (dane uzupełniające 4). W celu normalizacji Zestaw 200 białek o najwyższej punktacji lucyferazy w zestawie danych RNA MS2 zdefiniowano jako wspólne spoiwa wszystkich RNA oznaczonych MS2. Wspólne spoiwa zidentyfikowano następnie w każdym zbiorze danych i obliczono ich medianę punktacji interakcji dla każdego badanego RNA i wykorzystano do normalizacji intensywności luminescencji surowej w każdym zbiorze danych (patrz sekcja „Metody”). Warto zauważyć, że dane MS2 nie zostały wykorzystane jako kontrola swoistości wiązania, ponieważ wiele RBPs rozpoznaje motywy RNA o niskiej złożoności36 obecne również w znaczniku MS2, a ponieważ wiązanie białek z MS2 nie wyklucza potencjalnej interakcji funkcjonalnej z testowym RNA. Podobnie jak w przypadku Firre, okazało się, że większość białek nie wiąże się z żadnym z badanych fragmentów Xist (Fig. 4B-d, szare kropki; dane uzupełniające 4), podczas gdy określone zestawy białek zostały zidentyfikowane do interakcji z każdym pojedynczym regionem Xist (Fig. 4b-d, czerwone kropki; dane uzupełniające 4). Co ważne, wśród zidentyfikowanych przez incPRINT białek oddziałujących na Xist znaleźliśmy dobrze znanych partnerów interakcji Xist zidentyfikowanych w poprzednich badaniach w celu wiązania pełnej długości transkryptu7 ,14,15 (wskazanych na Fig. 4b-d, tabela uzupełniająca 1). Porównując zestawy białek zidentyfikowanych przez incPRINT i ich wyniki interakcji dla każdego przesłuchiwanego regionu Xist (dane uzupełniające 4), odkryliśmy, że każdy fragment Xist oddziaływał z zestawem białek specyficznych dla odpowiedniego regionu, z niewielką częścią rbps wiążącą się ze wszystkimi trzema regionami Xist (Fig. 4e). Tak więc, zastosowanie inkrustacji do trzech zakonserwowanych regionów Xist umożliwiło identyfikację i przypisanie do określonych regionów RNA RBPs uprzednio oznaczonych jako wiążące transkrypt Xist o Pełnej długości 7, 14,15 (Fig. 4E; znane białka oddziałujące na Xist są wskazane Po prawej stronie). Na przykład incPRINT zidentyfikował Spen jako interaktor specyficzny dla Xist (A) (rys. 4e), potwierdzając wcześniejsze znaleziska7, 8. Podobnie RBM15, RBM15B i YTHDC1 zostały zidentyfikowane przez incPRINT do interakcji specyficznie z Xist (a) i Xist(F), ale nie Xist(C), potwierdzając ich zgłoszone wiązanie z 5′ końcem Xist7,9 (Fig. 4e). Ponadto zidentyfikowaliśmy specyficzną dla Xist(C) interakcję z HNRNPU (znaną również jako SAF-A), która wcześniej wykazywała udział w lokalizacji Xist7,14, 33 (Fig. 4e, tabela uzupełniająca 1). Aby zweryfikować interakcje Xist-białko specyficzne dla regionu RNA, kod eCLIP data21 Dostępny dla 14 białek zidentyfikowanych przez incPRINT, z których kilka to nowatorskie RPB oddziałujące z Xist, potwierdził ich wiązanie z XIST w linii K562 (dodatkowe Fig. 3d; dane uzupełniające 2), dodatkowo potwierdzające specyfikę naszej metody. Funkcjonalna różnica między interaktomami białek trzech regionów Xist została potwierdzona przez analizy wzbogacania terminów ontologii genów (GO). Zgodnie z różniczkowymi funkcjami opisanymi dla poszczególnych regionów Xist, białka związane z Xist(a) i Xist(F) zostały wzbogacone dla RBPs zaangażowanych w przetwarzanie RNA, podczas gdy region powtórzeń C korzystnie oddziaływał z białkami wiążącymi DNA uczestniczącymi w regulacji transkrypcji (Fig. 3e, f). Zgodnie z analizą GO, analiza domeny białka wykazała, że białka oddziałujące na Xist(a) zostały wzbogacone dla SPOC (Spen paralog i ortholog C-terminal) i domen białkowych RRM, białka oddziałujące na Xist(F) zostały wzbogacone dla domeny RRM, a białka oddziałujące na Xist(C) nie wykazały szczególnego wzbogacenia (Fig. 4f; dane uzupełniające 3), dodatkowo podkreślając specyficzność zestawów białek zidentyfikowanych przez incPRINT dla każdego regionu Xist. Podsumowując, incPRINT z powodzeniem odzyskał znane interakcje Xist-białko i odkrył nowe RBPs. Identyfikując specyficzne zestawy białek oddziałujących z poszczególnymi zachowanymi regionami modularnego lncRNA, wykazaliśmy, że incPRINT umożliwia specyficzne dla regionu przypisanie oddziaływań RNA-białko.

incPRINT identyfikuje funkcjonalne interakcje RNA z białkiem

ponieważ Xist ma dobrze scharakteryzowaną funkcję komórkową w wyciszaniu genów podczas XCI, staraliśmy się sprawdzić, czy niektóre interakcje Xist z białkiem odkryte przy użyciu incPRINT są funkcjonalnie istotne. Skupiono się na białku ZZZ3, które współdziała ze wszystkimi trzema badanymi regionami Xist, oraz RBM6, które wykazuje bardziej specyficzne wiązanie z regionami Xist(a) i Xist(F) (Fig. 4e). Po pierwsze, potwierdziliśmy interakcję Xist z RBM6 i ZZZ3 w Warunkach endogennych, testując Ko-strącanie Xist z obydwoma białkami w komórkach zarodkowych myszy. Białka zostały oznaczone HA w polimorficznej linii komórkowej TX1072 ES, która umożliwia indukowaną doksycykliną ekspresję Xist, wyzwalając XCI przy braku różnicowania 31,37,38,39. Immunoprecypitacja RNA (RIP) po indukcji doksycykliny Xist i usieciowaniu komórek UV, a następnie analizach QRT-PCR, wykazała znaczące wzbogacenie transkryptu Xist białkami RBM6 i ZZZ3, potwierdzając ich interakcję in vivo (Fig. 5a, b). W szczególności incPRINT zidentyfikowało RBM6 jako oddziałujące z Firre. RIP qRT-PCR wykrył specyficzną interakcję Firre z RBM6, ale nie z ZZZ3, potwierdzając w ten sposób Wiązanie Firre-RBM6 w Warunkach endogennych i dalej potwierdzając nasze wyniki incPRINT (Fig. 5a, b).

następnie, aby sprawdzić, czy RBM6 i ZZZ3 mają wpływ na XCI, użyliśmy jednokomórkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji RNA in situ (RNA FISH) do oceny ekspresji endogennego Lamp2, genu związanego z X, który jest normalnie wyciszany podczas inicjacji XCI40. Po indukowanej doksycykliną ekspresji Xist, wyczerpaniu Rbm6, Zzz3 i kontroli dodatniej Spen (dodatkowe rys. 4A, b) doprowadziło do zmniejszenia wyciszenia Lamp2, podczas gdy jego monoalleliczna ekspresja wywołana przez XCI pozostała niezmieniona po wyczerpaniu Thap7, który nie oddziaływał z Xist i był używany jako kontrola negatywna (Fig. 5c, d; dodatkowe rys. 4c; tabela uzupełniająca 2). W przypadku braku Xist (-doksycykliny) ekspresja Lamp2 pozostała niezmieniona po wyczerpaniu powyższych białek (dodatkowe rys. 4d; tabela uzupełniająca 2). Co ważne, wady wyciszania chromosomu X nie zostały wywołane przez zmienioną ekspresję Xist / Tsix po wyczerpaniu poszczególnych białek(Fig. 4e). Podsumowując, identyfikacja ważnych funkcjonalnie interakcji wśród RBP zidentyfikowanych przez incPRINT pokazuje potencjał incPRINT do odkrycia.