wykorzystanie analogów ATP przez zmodyfikowane CDK
wytworzyliśmy zmutowane CDK 'Shokat’ zawierające wymiany aminokwasów w zachowanej, nieporęcznej pozostałości w ich kieszeniach wiążących ATP. W przypadku CDK2 i CDK3 była to wymiana fenyloalaniny na alaninę w pozycji 80, oznaczonej CDK2 (F80A). Zsyntetyzowaliśmy również 12 analogów ATP, aby określić, czy zaprojektowane CDK mogą używać tych analogów do fosforylowania rekombinowanego białka siatkówki (Rb) in vitro i odkryliśmy, że najbardziej efektywnie wykorzystują N6-(2-fenyloetylo)-ATP (PE-ATP) (Fig. Chociaż zarówno dziki typ, jak i cyklina E-CDK2 (F80A) używały normalnego ATP do fosforylowania białka glutationu-s-transferazy (GST)-Rb, tylko kinaza F80A mogła używać PE-ATP. Podobne wyniki uzyskano z cykliną E-CDK3, ale w tym przypadku mutant F80A nie mógł już używać normalnego ATP, chociaż podstawa strukturalna tej obserwacji jest niejasna (Fig. Badania te potwierdziły, że kinazy typu dzikiego i zmodyfikowane wykazują pożądaną specyficzność ATP.
charakterystyka zaprojektowanych CDKs. a) kompleksy cyklin E-CDK2/3 lub ich odpowiedniki zaprojektowane przez F80A (oznaczone gwiazdkami) zostały immunoprecypitowane z transfekowanych lizatów komórek U2OS przez ha-tag na podjednostce CDK i poddane in vitro testom kinaz z 10 µM normalnego analogu ATP lub PE-ATP. Fosforylację GST-Rb monitorowano przez immunoblotting fosfospecyficznym przeciwciałem anty-pS780-RB (New England Biolabs). Kinazy typu dzikiego nie mogą używać PE-ATP. b) chromatografia cienkowarstwowa-analiza ujawnia hydrolizę ATP w lizacie komórkowym i przeniesienie do nukleotydów akceptora (po lewej). Pozycje wolnego fosforanu i ATP są wskazane. Natomiast ATP-γ – s nie jest hydrolizowany w lizatach komórkowych (po prawej). (c) testy kinaz przeprowadzono stosując kompleksy typu dzikiego i cykliny a-CDK2 (F80A) oczyszczone z E. coli i GST-Rb w obecności 200 µM ATP, ATP-γ-s i PE-ATP-γ-s w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. reakcje kinaz analizowano elektroforezą w żelu SDS i wizualizowano przez barwienie Coomassiego. Zakres fosforylacji GST-Rb był monitorowany przez przesunięcie elektromobilności GST-Rb.
podczas gdy zmutowane CDK skutecznie wykorzystywały PE-ATP do fosforylowania Rb in vitro, podobne eksperymenty z wykorzystaniem znakowanego radioaktywnie PE-ATP w lizatach komórkowych nie powiodły się, ponieważ znakowany fosforan został odszczepiony od PE-ATP przez aktywność ATPazy w lizatach (dane nie pokazane). W związku z tym przestawiliśmy się na tiofosforanową postać analogu ATP (PE-ATP-γ-S), która nie była hydrolizowana przez lizaty (Fig.1B). Chociaż kinazy często wykorzystują ATP-γ-S mniej efektywnie niż normalny ATP, tiofosforylacja ma w tym kontekście kilka zalet. Po pierwsze, tiofosforany są bardziej stabilne i odporne na fosfatazy . Po drugie, ponieważ nie ma wcześniej istniejących zdarzeń tiofosforylacji w komórkach, etykietowanie tiofosforanowe zapewnia unikalne markery dla białek fosforylowanych przez zmutowaną kinazę. Wreszcie, Grupa tiofosforanowa ma podobne właściwości chemiczne jak grupa sulfhydrylowa i jest podatna na modyfikacje chemiczne. Wyeksprymowaliśmy i oczyszczaliśmy rozpuszczalne kompleksy typu dzikiego i cykliny a-CDK2 (F80A) z bakterii i przeprowadziliśmy podobny test kinazy Rb w celu sprawdzenia ich zdolności do stosowania PE-ATP-γ-S. Jak pokazano na fig. 1c, chociaż obie kinazy mogą używać ATP lub ATP-γ – s do fosforylowania białka GST-Rb (na co wskazuje jego przesunięcie elektromobilności), tylko mutant F80A może używać PE-ATP-γ-s. w ten sposób wykorzystaliśmy PE-ATP-γ-s do wszystkich naszych późniejszych badań.
jednoetapowe oczyszczanie peptydów tiofosforylowanych
zastosowanie inżynierii CDK i analogów ATP ułatwia wysoce specyficzną fosforylację substratów: kolejnym wyzwaniem jest zidentyfikowanie ich w złożonym lizacie. Staraliśmy się wykorzystać znaczniki tiofosforanowe do kowalencyjnego wychwytywania i wzbogacania peptydów tiofosforylowanych po fosforylacji i trawieniu lizatów. Jednak kluczowym problemem było chemiczne rozróżnienie tiofosfopeptydów i peptydów zawierających cysteinę. Chociaż opisano chemoselektywną metodę wzbogacania tiofosfopeptydów, przytłaczająca obfitość reszt cysteiny w złożonej mieszaninie białek utrudnia to podejście . Zastosowaliśmy prostą metodę wychwytywania i uwalniania, aby selektywnie izolować tiofosforylowane peptydy w lizatach trypsynizowanych komórek (Fig. 2A). Białka w lizacie fosforylowano in vitro cykliną a-CDK2 (F80A) i PE-ATP-γ-s. mieszaninę białek następnie trawiono i otrzymywane peptydy mieszano z Tiopropylową Sepharose 6b , aktywowaną żywicą dwusiarczkową, która wychwytuje zarówno peptydy zawierające cysteinę, jak i tiofosfopeptydy w reakcji wymiany dwusiarczkowej. Ponieważ tradycyjna elucja ditiotreitolu (DTT) uwalnia oba rodzaje peptydów związanych, wykorzystaliśmy jakościowe różnice między peptydami tiofosforanowymi związanymi żywicą a peptydami zawierającymi cysteinę odpowiednio w wiązaniu siarczku fosforotiolatu i wiązaniu siarczku alkilodisiarczku. Przy wysokich wartościach pH Wiązanie siarczku fosforotiolatu jest hydrolizowane, a siarczek alkilodisiarczku pozostaje nienaruszony . Obróbka żywicy silną zasadą (taką jak wodorotlenek sodu) specyficznie uwalnia tiofosfopeptydy (a także przekształca je w normalne fosfopeptydy), ale nie w peptydy zawierające cysteinę, poprzez hydrolizę wiązania siarczku fosforotiolatu (Fig.2b). Ponieważ peptydy związane przez cysteinę nie są eluowane w końcowym etapie, nie możemy odzyskać tiofosfopeptydów zawierających cysteinę. Ponadto elucja powoduje utratę sygnatury tiofosforanowej poprzez przekształcenie tiofosfopeptydu w fosfopeptyd. Nasza metoda izolacji tiofosfopeptydów różni się nieznacznie od metody Blethrow et al. w tym wychwytujemy tiofosfopeptydy za pomocą chemii wymiany dwusiarczków (Żywica dwusiarczkowa) zamiast alkilacji (Żywica jodoacetamidowa) i selektywnie eluujemy je za pomocą hydrolizy zasadowej, a nie utleniania.
jednoetapowe oczyszczanie tiofosfopeptydów. a) ogólny schemat izolacji tiofosfopeptydów. Białka znakowano cykliną a-CDK2 (F80A) i PE-ATP-γ-s i poddano trawieniu tryptycznemu. Otrzymane peptydy zmieszano z dwusiarczkami, które wychwytują zarówno tiofosfopeptydy, jak i peptydy zawierające cysteinę. Następnie kulki potraktowano roztworem zasadowym w celu selektywnego uwalniania tylko fosfopeptydów. b) chemii leżącej u podstaw selektywności tiofosfopeptydu. Zarówno grupy tiofosforanowe, jak i cysteinowe zawierają reaktywne grupy tiolowe, które mogą być kowalencyjnie wychwytywane przez dwusiarczki. Przy wysokich wartościach pH wiązania siarczku fosforotiolatu (w pobliżu górnej strzałki) są hydrolizowane, aby umożliwić uwalnianie peptydów związanych z koralikami, podczas gdy wiązania alkilodisiarczkowe (w pobliżu dolnej strzałki) są stabilne, a zatem peptydy są zatrzymywane na kulkach. Należy zauważyć, że podczas hydrolizy wiązania siarczku fosforotiolatu tiofosforan przekształca się w normalny fosforan.
aby przetestować wykonalność tego podejścia, fosforylowaliśmy GST-RB cykliną a-CDK2 (F80A) i PE-ATP-γ-S I zastosowaliśmy naszą procedurę oczyszczania do trawienia trypsyny mieszaniny reakcyjnej. Wyizolowane peptydy analizowano za pomocą tandemowej spektrometrii masowej electrospray (ESI-MS/MS) za pomocą spektrometru masowego pułapki jonowej. Peptydy zidentyfikowano przez dopasowanie widm masowych tandemów do bazy danych sekwencji ludzkiego białka (z dodaną sekwencją GST-Rb) za pomocą oprogramowania SEQUEST . Substrat GST-Rb zawiera pięć cystein oraz siedem miejsc SP/TP, które są miejscami sprzyjającymi fosforylacji CDK . Odzyskaliśmy wiele fosfopeptydów zawierających tylko i wszystkie spodziewane miejsca fosforylacji (Tabela 1). Ponadto nie odzyskaliśmy peptydów zawierających cysteinę i bardzo niewielu niespecyficznych peptydów. Zapewniło to dowód Zasady dla naszych testów na dużą skalę.
Identyfikacja substratów ludzkiej cykliny a-CDK2 w lizatach komórkowych
naszym celem było zidentyfikowanie potencjalnej cykliny substraty a-cdk2 w skali proteomu. Aby zmniejszyć złożoność próbki, frakcjonowano lizat całych komórek HEK293 na 11 frakcji przy użyciu chromatografii jonowymiennej i wytrącania siarczanu amonu (dodatkowy plik danych 1). Następnie przeprowadziliśmy testy kinazy in vitro na każdej frakcji. Jako pozytywną kontrolę dodaliśmy również niewielką ilość GST-Rb do każdej reakcji. Po przetrawieniu mieszaniny reakcyjnej trypsyną, zastosowaliśmy nasz protokół oczyszczania, aby wyizolować tiofosfopeptydy z mieszanin peptydowych. Odzyskane peptydy poddano chromatografii cieczowej-analizie MS / MS i przeszukiwaniu bazy danych. Odzyskaliśmy różną liczbę peptydów i co najmniej jeden fosfopeptyd RB z każdej frakcji lizatu (dodatkowy plik danych 2).
cdks fosforyluje białka w sposób ukierunkowany prolinowo na serynę lub treoninę, a liczne badania potwierdzają tezę, że motyw S/T-P-X-R / K reprezentuje motyw konsensusu CDK. Z fosfopeptydów zidentyfikowaliśmy łącznie 203 białka: 180 kandydatów zostało fosforylowanych w ramach motywów SP lub TP (Proline-directed; dodatkowy plik danych 3). Te kandydujące substraty reprezentują szeroki zakres procesów biologicznych, w tym kontrolę cyklu komórkowego, metabolizm DNA i RNA, translację i struktury komórkowe (Fig. 3). Łącznie 96 z 222 (43%) miejsc skierowanych proliną było zgodnych ze znanym konsensusem CDK (z dodatnio naładowaną pozostałością w pozycji +3). Co ciekawe, około 24% miejsc skierowanych proliną (53/222) zawierało dodatnio naładowaną pozostałość w pozycjach +4 lub +5, co sugeruje, że ten motyw może być również preferowany przez CDK2. Rzeczywiście, Blethrow et al. zauważono również, że znaczna liczba substratów cykliny B-CDK1 zawiera miejsca, w których nie występuje konsensus. W przypadku peptydów, które zawierały miejsca nie będące konsensusem, odkryliśmy, że około 50% odpowiadających im białek nosiło co najmniej jeden motyw K/RXLφ lub K/Rxlxφ (gdzie φ jest dużą pozostałością hydrofobową, A X jest dowolnym aminokwasem) dystalnie do miejsc fosforylacji, a prawie wszystkie z nich nosiły co najmniej jeden minimalny motyw RXL (dodatkowy plik danych 3). Jest to zgodne z ugruntowaną ideą, że motywy te promują wiązanie cykliny a-CDK2 z podłożami . Oprócz selekcji do fosforylacji z motywami konsensusu CDK, zidentyfikowaliśmy 28 białek, które wcześniej były zaangażowane jako substraty CDK (oznaczone pogrubioną czcionką w dodatkowym pliku danych 3) . Tak więc, prawie 15% naszych kandydatów zostało wcześniej znalezionych jako cele CDK, co dodatkowo wspiera ideę, że nasze metody zostały przechwycone i wzbogacone dla podłoży CDK2. Wreszcie, 43% fosforylacji, które znaleźliśmy, zostało wcześniej zidentyfikowane w wielkoskalowych analizach fosfoproteomu in vivo, wskazując, że te fosforylacje nie są ograniczone do naszych warunków lizatu.
Klasyfikacja białek według kategorii funkcjonalnych. Liczby wskazują zidentyfikowane białka w każdej kategorii.
zarówno nasze badania, jak i te zgłoszone przez Blethrow et al. zastosowaliśmy podobne schematy izolacji fosfopeptydów i powiązane cyklina-CDK, i spodziewaliśmy się, że substraty ujawnione w obu badaniach mogą się znacząco pokrywać. Rzeczywiście, znaleźliśmy prawie 50% (30/68) substratów cykliny B-CDK1 na naszej liście kandydatów do cykliny a-CDK2; dlatego metody te są solidne i powtarzalne (dodatkowy plik danych 4). Istnieją jednak również znaczne różnice między tymi dwoma wykazami, które prawdopodobnie wynikały z wielu czynników, w tym różnic proceduralnych, różnych typów komórek, niekompletnej identyfikacji peptydów przez MS i swoistości substratu nadanej przez podjednostki cykliny i/lub kinazy. Niektóre z tych różnic mogą również odzwierciedlać różne funkcje biologiczne cykliny a-CDK2 i cykliny B-CDK1. Na przykład, znaleźliśmy dziewięć białek zaangażowanych w translację białek i / lub funkcję rybosomu, ale żadne z tych białek nie zostało znalezione z cykliną B-CDK1, pomimo ich stosunkowo dużej obfitości.
chociaż zidentyfikowaliśmy kilka znanych substratów CDK2, nie zidentyfikowaliśmy niektórych wcześniej opisanych substratów CDK2. Niektóre z wymienionych wyżej czynników mogą również stanowić przyczynę braku znalezienia znanych substratów CDK2 w naszych analizach. Ponadto substraty już fosforylowane przez endogenne CDK nie byłyby tiofosforylowane in vitro. Możliwe jest również, że niektóre białka nie zostały rozpuszczone podczas przygotowania lizatu i/lub etapu sonikacji i wyłączone z naszych analiz. Wreszcie, jest możliwe, że duże kompleksy białkowe mogły zostać zakłócone przez procedury frakcjonowania przed reakcją kinazy, i że białka, które są fosforylowane przez CDK2 tylko w kontekście tych kompleksów, mogą nie zostać odkryte przez nasze metody.
odzyskaliśmy również cztery fosfopeptydy odpowiadające cyklinie a i CDK2 oraz 27 dodatkowych fosfopeptydów z miejscami skierowanymi nie proliną (dodatkowy plik danych 5). Podejrzewaliśmy, że te fosfopeptydy wynikają z autofosforylacji cykliny a-CDK2 i fosforylacji tła przez inne kinazy, a inni zgłaszali podobną fosforylację tła . Aby przetestować te możliwości, przeprowadziliśmy reakcję kinazy kontrolnej z użyciem cykliny a-CDK2 (F80A) i PE-ATP-γ-s bez dodatku lizatu komórkowego i odzyskaliśmy trzy z czterech peptydów cykliny a-CDK2 (dodatkowy plik danych 5). Ponadto, kiedy przeprowadziliśmy podobną reakcję „tylko kinazy” w obecności γ-32P-ATP, zaobserwowaliśmy włączenie 32P do obu tych białek w sposób zależny od dawki (dodatkowy plik danych 6). Eksperymenty te potwierdziły, że w oryginalnych testach istniała autofosforylacja cykliny a-CDK2.
przeprowadziliśmy również kontrolne reakcje kinazowe z użyciem frakcji lizatu, GST-RB „spike-in” i PE-ATP-γ-s bez dodatku cykliny a-CDK2. Te „no-kinazy” kontrolują reakcje fosforylowane 7 z 27 fosfopeptydów skierowanych nie-proliną na naszej liście (dodatkowy plik danych 5), co sugeruje, że większość, jeśli nie wszystkie, z tych fosfopeptydów wynikało z fosforylacji tła przez kinazy, które są w stanie w ograniczonym stopniu wykorzystać Analog ATP. Na przykład, większość z tych peptydów zawiera kwaśne miejsca fosforylacji skierowane na pozostałości, które są motywami kinazy kazeinowej 2. Kinaza kazeinowa 2 jest wyjątkowa, ponieważ może wykorzystywać GTP, a także ATP; tak więc miejsce aktywne może pomieścić nieporęczne analogi ATP, takie jak PE-ATP . Co ważne, nie odzyskaliśmy żadnych fosfopeptydów Rb z tych eksperymentów kontrolnych, co wskazuje na brak niespecyficznej aktywności CDK w naszych testach. Odzyskaliśmy również 44 niezmodyfikowane peptydy, z których 12 zawierało pozostałości cysteiny. Większość tych peptydów pochodzi z kilku frakcji lizatu (dodatkowy plik danych 2). Podejrzewamy, że wynikały one z niskiego poziomu niespecyficznego wiązania peptydów z żywicą pomimo rygorystycznych warunków mycia, a w przypadku peptydów zawierających cysteinę, z niewielkiej ilości hydrolizy wiązania alkilodisiarczkowego podczas etapu elucji. Podsumowując, nasze metody były wysoce selektywne, a nasze badania zidentyfikowały zaskakująco dużą grupę kandydujących substratów cyklin a-CDK2, z których większość nie została wcześniej zidentyfikowana jako cele CDK.
Walidacja kandydujących substratów jako docelowych cyklin a-CDK2
zastosowaliśmy kilka strategii, aby zweryfikować niektóre z nowych kandydatów na naszej liście jako substratów cyklin a-CDK2. Ponieważ nasza identyfikacja białek opierała się na sekwencjach peptydowych, zaczęliśmy od potwierdzenia, że cyklina a-CDK2 fosforylowała trzy natywne i pełnowymiarowe kandydatki, które były immunoprecypitowane za pomocą znaczników epitopowych z transfekowanych 293 komórek (EF2, TRF2 i RAP1). Ponieważ białka te nie były obecne na liście cyklin B-CDK1, ustaliliśmy, czy są one również fosforylowane przez cyklinę B-CDK1. Każdy kandydat na CDK2 był fosforylowany zarówno przez cyklinę a-CDK2, jak i cyklinę B-CDK1, chociaż EF2 był fosforylowany w mniejszym stopniu niż TRF2 lub RAP1 (Fig.4a). Wyrażaliśmy również TRF2, RAP1 i białko rybosomalne rl12 jako Fuzje GST i oczyszczaliśmy je z Escherichia coli. Kiedy zastosowaliśmy cyklinę a-CDK2 do fosforylacji TRF2 i RAP1 in vitro, białka były silnie fosforylowane, A analizy MS wykazały, że te fosforylacje miały miejsce w tych samych miejscach, które początkowo zidentyfikowaliśmy (Fig.4B). Użyliśmy również cykliny a-CDK2 i cykliny B-CDK1 do fosforylacji GST-RL12 i odkryliśmy, że oba CDK również fosforylowały rl12 in vitro (Fig. Badania te potwierdzają więc, że peptydy zidentyfikowane na naszym ekranie reprezentują białka, które mogą być fosforylowane przez cyklinę a-CDK2, przynajmniej in vitro. Chociaż znaleźliśmy jakościowe różnice w zdolności cykliny a-CDK2 i cykliny B-CDK1 do fosforylowania specyficznych białek, w każdym przypadku kandydaci byli fosforylowani przez oba CDK. Ponieważ preparat enzymatyczny, którego użyliśmy w tych badaniach, zawierał nadmiar wolnego CDK2 (F80A), rozważaliśmy możliwość, że niektóre fosforylacje substratów mogą wynikać z połączenia endogennych cyklin z CDK2 (F80A), który był monomeryczny lub który mógł dysocjować z cykliną A podczas warunków testu. Stwierdziliśmy, że ilość aktywności cykliny B-CDK2 (F80A) w tych ekstraktach była znikoma w porównaniu z cykliną a-CDK2 (F80A) i nie mogliśmy wykryć żadnej aktywności cykliny e-CDK2 (F80A) (dodatkowy plik danych 7). Niemniej jednak, nie możemy wykluczyć możliwości, że niektóre peptydy mogły być fosforylowane przez CDK2 (F80A) w kompleksie z endogenną cykliną, a specyficzność każdego kandydującego substratu dla cykliny a w porównaniu z innymi cyklinami, które aktywują CDK2, musi zostać zwalidowana, jak opisano poniżej.
Walidacja in vitro selektywnych substratów CDK2. (a) komórki HEK293 były przejściowo transfekowane wektorami wyrażającymi znaczniki FLAG EF2, TRF2 i RAP1. Immunoprecypitaty przeciwciał anty-FLAG in vitro fosforylowano cykliną a-CDK2 lub cykliną B-CDK1 w obecności γ-32P-ATP (górne lewe panele). W reakcjach równoległych Histon H1 fosforylowano jako kontrolny w celu normalizacji aktywności cykliny a-CDK2 i cykliny B-CDK1 (prawy panel). „C” oznacza reakcje „tylko kinazy” bez transfekowanych substratów (lewy panel) i reakcję „bez kinazy” (prawy panel). Próbki białek oddzielono SDS PAGE, a żele przeniesiono na membrany PVDF. Sygnały fosforowe wizualizowano za pomocą autoradiografii. Membrana została następnie przebadana przeciwciałem anty-flagowym (Sigma-Aldrich) w celu potwierdzenia tożsamości pasma łożyskowego fosfo-sygnału (dolne lewe panele). Gwiazdka przedstawia niespecyficzne pasmo z komercyjnego preparatu cykliny B-CDK2. (b) reakcję kinazy przeprowadzono przy użyciu γ-32P-ATP i GST-TRF2, GST-RAP1, GST-RB (kontrola pozytywna) i GST (Kontrola negatywna) jako substratów w obecności lub bez dzikiej kinazy cyklinowej a-CDK2. Reakcje wizualizowano za pomocą strony SDS, a następnie barwienia Coomassie i autoradiografii (lewy panel). Podobny test kinazy przeprowadzono stosując cyklinę a/CDK2 typu dzikiego i ATP-γ-s, a następnie poddano schematowi izolacji fosfopeptydów. Analiza MS potwierdziła, że TRF2 i RAP1 zostały fosforylowane dokładnie w miejscach, które zidentyfikowaliśmy na ekranie z jednym dodatkowym miejscem dla RAP1 (prawy panel). (c) oznaczenie kinazy przeprowadzono stosując γ-32P-ATP, cyklinę a-CDK2 lub cyklinę B-CDK1 ze zwiększającymi się ilościami oczyszczonego GST-RL12. Próbki oddzielono stroną SDS, a żel zabarwiono Coomassie (dolny panel), a następnie autoradiografią (górny panel). „C” oznacza reakcje „tylko kinazy” bez transfekowanych substratów.
Walidacja RL12 jako substratu in vivoCDK2
powyższe badania potwierdziły kilka nowych kandydatów zidentyfikowanych na naszym ekranie jako substraty CDK2 in vitro. Jednakże, aby ustalić, czy nowy substrat jest również fosforylowany przez CDK2 in vivo, przeprowadziliśmy bardziej kompleksową analizę białka rybosomalnego RL12. Najpierw zmieszaliśmy immunoprecypitaty cykliny a-CDK2 i rl12 oznaczonych epitopem, ulegające ekspresji w ludzkich komórkach w obecności γ-32P-ATP i odkryliśmy, że cyklina a-CDK2 fosforylowała RL12 in vitro (Fig.5a). Fosforylacja została w dużej mierze zniesiona w zmutowanym RL12, gdzie zidentyfikowana fosfoseryna S38 została zastąpiona alaniną, i została przywrócona, gdy S38 została zastąpiona treoniną(Fig. 5b). Następnie wykorzystaliśmy mapowanie fosfopeptydu do identyfikacji peptydu zawierającego S38 i potwierdziliśmy, że został on bezpośrednio fosforylowany przez CDK2 in vitro (Fig.5c). Aby sprawdzić, czy RL12 jest również fosforylowany in vivo w sposób zależny od CDK2 w tym samym miejscu, oznaczamy metabolicznie komórki ortofosforanem 32P i immunoprecypitowanym dzikim typem lub RL12-S38A z komórek nadekspresujących cyklinę e-CDK2, katalitycznie nieaktywną cyklinę e-CDK2 lub inhibitor CDK p21 (hamujący endogenne CDK) . Ponieważ nie możemy badać endogennej fosforylacji rl12 z powodu braku odpowiedniego przeciwciała anty-rl12, badania te badały fosforylację pozamacicznego RL12 in vivo (te warunki transfekcji doprowadziły do około pięcio – do dziesięciokrotnej nadekspresji mRNA rl12 (dodatkowy plik danych 8). Odkryliśmy, że rl12 typu dzikiego, ale nie RL12-S38A, został fosforylowany in vivo (Fig. Fosforylacja ta była nasilona w komórkach nadekspresujących cyklinę e-CDK2, ale nie nieaktywną cyklinę e-CDK2, i była zmniejszona w komórkach nadekspresujących inhibitor P21 CDK (który hamuje endogenną cyklinę-CDK; Rysunek 5d). Na koniec wykorzystaliśmy mapowanie fosfopeptydów i analizy fosfoaminowe białka rl12 immunoprecypitowanego z oznaczonych komórek i potwierdziliśmy, że fosforylacja rl12 przez cyklinę e-CDK2 in vivo również wystąpiła na S38 (Fig.5e). W badaniach nad fosfoproteomem odnotowano również fosforylację RL12 S38 in vivo .
fosforylacja RL12 in vitro i In vivo. a) znakowane HA RL12 lub kontrola wektorowa („vec”) były przejściowo transfekowane do komórek U2OS i immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciała 12ca5. Kompleksy cykliny a-CDK2 ulegały również przejściowej ekspresji oddzielnie w komórkach U2OS i immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała przeciwko cyklinie A. testy kinazy przeprowadzono stosując immunoprecypitat rl12 (lub kontrolny) z immunoprecypitatem cykliny a-CDK2 lub bez niego w obecności γ-32P-ATP. B) podobne testy przeprowadzono przy użyciu cyklin a-CDK2 i immunoprecypitatów rl12 zawierających dziki Typ (WT) oraz wskazanych mutantów fosfozytu rl12. Gwiazdka oznacza łańcuch świetlny przeciwciała. C) mapowanie Fosfopeptydów i analiza kwasu fosfoaminowego znakowanego promieniotwórczo typu dzikiego (lewy panel) i mutanta s38t (prawy panel) RL12. d) Rl12 typu dzikiego, RL12-S38A lub sterowanie wektorowe było przejściowo współwystępowane z cykliną e-CDK2, katalitycznie nieaktywną (DN) cykliną e-CDK2 lub p21. Wszystkie komórki poddano znakowaniu ortofosforanem 32P. RL12 immunoprecypitowano z lizatów komórkowych i wizualizowano za pomocą SDS PAGE, a następnie autoradiografii. e) analizę mapowania Fosfopeptydów przeprowadzono również na znakowanym radioizotopem RL12 pokazanym w lit. d). Dolna strzałka pokazuje drugie i niewielkie miejsce fosforylacji wykryte in vivo.
chociaż potwierdziliśmy każdy z nowych kandydatów, które przetestowaliśmy do tej pory, wykazując, że białka pełnej długości są fosforylowane przez CDK2, niektórzy kandydaci na naszej liście prawdopodobnie nie będą fizjologicznie istotnymi substratami cykliny a-CDK2. Na przykład, reakcje kinazy przeprowadzono w lizatach, A In vivo subcellular compartmentalization may restrict the access of CDK2 to some candidates. Ponadto możliwe jest, że inne kinazy komórkowe są albo zbędne z CDK2, albo ważniejsze od CDK2 w odniesieniu do poszczególnych substratów in vivo. Dlatego też ważne jest, aby kandydaci byli rygorystycznie oceniani w jak najbardziej fizjologicznym kontekście. W tym celu w trwających badaniach wykorzystujemy podejście ukierunkowane na geny, aby zmutować podzbiór tych miejsc fosforylacji w endogennych genach, aby zbadać ich znaczenie fizjologiczne.
