badanie przesiewowe markerów powierzchni komórek ludzkich

komórki hESC i HPSC-RPE dysocjowano do pojedynczych komórek przy użyciu Trypla przez 5-10 minut. Pęcherzyki optyczne dysocjowano na pojedyncze komórki za pomocą wyboru Trypli (Gibco, Invitrogen) przez 10 minut, a następnie dysocjację fizyczną za pomocą igły 20 G. Aby umożliwić jednoczesną analizę tych różnych populacji w tej samej próbce, komórki hESC, HPSC-RPE i komórki pęcherzyków optycznych znakowano CellTrace™ CFSE (0,25 µM) przez 7 minut w 37 °C lub CellTrace™ Violet (5 µM) przez 20 minut w 37 °C zgodnie z protokołem producenta (Thermo Fisher Scientific). Następnie trzy typy komórek zostały barwione za pomocą paneli przesiewowych BD Lyoplate™ (BD Biosciences) zgodnie z protokołem producenta. Kody kreskowe komórek pozwoliły łatwo rozróżnić trzy grupy komórek i zminimalizować zmienność próbki podczas badania przesiewowego. Próbki analizowano na 96-studzienkowych płytkach na LSRFortessa wyposażonym w lasery 405, 640, 488, 355 i 561 nm (BD Biosciences) lub CytoFLEX wyposażonym w lasery 405, 638, 488 i 561 nm (Beckman Coulter). Nieżywotne komórki wykluczono z analizy przy użyciu barwnika kwasu nukleinowego 7-Aad (7-aminoactinomycin D) (BD Biosciences). Analiza danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FlowJo V. 10 (Tree Star). Ekran markera powierzchni komórki wykonano raz dla pęcherzyków optycznych 3D, a raz dla HPSC-RPE day 60.

Kultury komórkowe

linie hs980 i hs983 zostały wcześniej uzyskane i hodowane w Warunkach wolnych od kseno30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745:31/3). Dawcy wyrazili świadomą zgodę na wyprowadzenie i późniejsze wykorzystanie linii hESC. Linię WA09 / H9 hESC uzyskano z Wicell i przystosowano do hodowli bez podajnika na hrLN-521 (10 µg/mL, Biolamina). Komórki utrzymywano przez rozmnażanie klonalne na płytkach powlekanych hrLN-521 w pożywce NutriStem HPSC XF (branże biologiczne), w inkubatorze 5% CO2/5% O2 i passowano enzymatycznie w stosunku 1:10 co 5-6 dni.

linie hiPSC CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I i CTRL-14-II zostały uprzejmie dostarczone przez Karolinska Institutet iPSC Core facility (Szwedzki Urząd ds.: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Dawcy wyrazili świadomą zgodę na wyprowadzenie i późniejsze wykorzystanie linii hiPSC. Komórki utrzymywano przez rozmnażanie klonalne na płytkach powlekanych hrLN-521 (Biolamina) w pożywce NutriStem HPSC XF (branże biologiczne), w inkubatorze 5% CO2/5% O2 i passował enzymatycznie w stosunku 1:10 co 5-6 dni.

w celu przejścia, Kultury zbiegu przemyto dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez Ca2+ i Mg2+ i inkubowano przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2/5% O2 Z Select TrypLE. Następnie enzym ostrożnie usuwano i komórki pobierano w świeżo podgrzanym ośrodku NutriStem HPSC XF poprzez delikatne pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki odwirowywano w temperaturze 300 × g przez 4 minuty, granulki ponownie zawieszano w świeżo podgrzanym ośrodku NutriStem HPSC XF, a komórki platerowano na świeżo pokrytym hrLN-521 naczyniu. Dwa dni po przejściu, medium zostało zastąpione świeżym, wstępnie rozgrzanym NutriStem HPSC XF medium i zmieniane codziennie.

HPSC-RPE różnicowanie jednowarstwowe

protokół krok po kroku opisujący protokół różnicowania można znaleźć w protokole Exchange36. hESC lub hiPSC platerowano przy gęstości komórek 2,4 × 104 komórki / cm2 na płytkach pokrytych lamininą (20 µg / mL) przy użyciu pożywki NutriStem HPSC XF. Inhibitor Rho-kinazy (y-27632, Millipore) w stężeniu 10 µM dodano w ciągu pierwszych 24 godzin, podczas gdy komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C, 5% CO2 / 5% O2. Po 24 godzinach pożywkę hPSC zastąpiono pożywką różnicującą NutriStem HPSC XF bez podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i transformującego czynnika wzrostu-β (TGFß) (branże biologiczne), a komórki umieszczono w temperaturze 37 °C, 5% CO2/21% O2. Od 6 dnia po pokryciu do nośnika dodano 100 ng/mL aktywiny A (R&Systemy D). Komórki karmiono trzy razy w tygodniu i trzymano przez 30 dni. Następnie trypsynizowano monowarstwy przy użyciu Tryple Select (Gibco, Invitrogen) przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Enzym ostrożnie usunięto i komórki zebrano w świeżo podgrzanym, wstępnie rozgrzanym ośrodku NutriStem HPSC XF bez bFGF i TGFß przez delikatne pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki odwirowywano w temperaturze 300 × g przez 4 minuty, osad ponownie zawieszano, przepuszczano przez sitko komórkowe (ø 40 µm, BD Biosciences), a komórki wysiewano na naczynia pokryte lamininą (hrLN – 111 i hrLN-521 w dawce 20 mg/mL) przy różnych gęstościach komórek w zakresie od 1,4 × 106 do 1,4 × 104 komórek/cm2. Replated cells Feed three times a week during the later 30 days with NutriStem HPSC XF medium without bfgf and TGFß. W przypadku różnicowania hPSC-RPE in vitro w zawieszeniu 3D EBs, zastosowaliśmy się do naszego wcześniej opublikowanego protokołu10. Krótko mówiąc, pluripotencjalne komórki macierzyste hodowano do zbiegu na rhLN-521 i ręcznie zeskrobywano w celu wytworzenia EBS za pomocą końcówki pipety 1000 µL. Następnie EBS hodowano w zawiesinie w płytkach o niskiej przyczepności (Corning) o gęstości 5-7 × 104 komórek / cm2. Różnicowanie przeprowadzono w przygotowanym na zamówienie ośrodku NutriStem hESC XF, w którym eliminowano bFGF i TGFß ze zmianą mediów dwa razy w tygodniu. Dziesięć mikromoli inhibitora kinazy Rho (y-27632, Millipore) dodano do hodowli zawiesin tylko w ciągu pierwszych 24 godzin. po 5 tygodniach różnicowania, obszary pigmentowane wycięto mechanicznie z EBs za pomocą skalpela. Następnie komórki dysocjowano za pomocą TrypLE Select, a następnie przepłukiwano przez igłę i strzykawkę o masie 20 G. Komórki wysiewano przez sitko komórkowe (ø 40 µm, BD Biosciences) na naczyniach pokrytych LN przy gęstości komórek 0.6-1 , 2 × 104 komórki / cm2 i karmione dwa razy w tygodniu tym samym środkiem różnicującym, o którym mowa powyżej. Zdjęcia w jasnym polu uzyskano za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse TE2000-s, a do przechwytywania pigmentacji z górnej części studni użyto Aparatu Canon SX170 IS.

ilościowe PCR w czasie rzeczywistym

całkowity RNA wyizolowano za pomocą zestawu Rneasy Plus Mini i potraktowano Dnazą bez RNazy (obie z Qiagen). Komplementarne DNA (cDNA) zsyntetyzowano przy użyciu 1 µg całkowitego RNA w mieszaninie reakcyjnej o pojemności 20 µL, zawierającej losowe heksamery i odwrotną transkryptazę Superscript III (Gibco, Invitrogen), zgodnie z instrukcjami producenta.

Cytometrię przepływową

sortowanie komórek przeprowadzono na hodowlach hPSC-RPE po 21 lub 30 dniach różnicowania. Komórki inkubowano ze wspomnianymi sprzężonymi przeciwciałami na lodzie przez 30 minut. Dla każdego warunku włączono kontrole FMO w celu identyfikacji komórek ujemnych i dodatnich. Barwione komórki posortowano następnie za pomocą BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (BD Biosciences) przy użyciu oprogramowania FACSDiva v8.0.1.

zaraz po sortowaniu 70 000 komórek rozcieńczonych w 100 µL 2% FBS i 1 mM EDTA (Sigma) cytospinowano przez 5 minut przy 400 obr. / min na szkiełkach szklanych. Szkiełka pozostawiono do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie utrwalono 4% formaldehydem wolnym od metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zabarwiono immunofluorescencją.

Immunofluorescencja

Histologia i odporność tkanek

bezpośrednio po eutanazji przez dożylne wstrzyknięcie 100 mg/kg pentobarbitalu (allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), Oczy wyłuskano, a obszar wstrzyknięcia bleb oznaczono zielonym barwnikiem do znakowania tkanek (TMD) (produkty Histolab). Do ciała szklistego wstrzyknięto 100 µL roztworu utrwalającego (FS) składającego się z 4% buforowanego Formaldehydu (Solvenco AB) przed utrwaleniem w FS przez 24-48 h i osadzeniem w parafinie. Cztery mikrometrowe odcinki seryjne były produkowane przez obszar oznaczony TMD i co cztery sekcje były barwione hematoksyliną-eozyną.

dla immunostaining, slajdy deparaffinizowano w ksylen, odwodniono w stopniowanych alkoholach i przepłukano ddH2O i roztworem soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS, pH 7,6). Pobieranie antygenu uzyskano w buforze cytrynianowym 10 mM (dwuwodny cytrynian trisodu, Sigma-Aldrich, pH 6,0) z 1: 2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) w temperaturze 96 °C przez 30 minut, a następnie przez 30 minut oziębienie w temperaturze pokojowej. Szkiełka przemyto TBS i Zablokowano przez 30 minut 10% normal donkey serum (Abcam) rozcieńczonym w TBS zawierającym 5% (w/v) IgG i wolną od proteazy bydlęcą albuminę surowicy (Jackson Immunoresearch) w nawilżonej komorze. Pierwotne przeciwciała rozcieńczone w buforze blokującym inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C:białko ludzkiego mitotycznego aparatu jądrowego (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore Mab5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) i CD56/NCAM1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, klon ) (dane uzupełniające 2). Przeciwciała wtórne (donkey anty-rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 i donkey anty-mysi IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, oba z Thermo Fisher Scientific) (Dane dodatkowe 2) rozcieńczone 1:200 w buforze blokującym inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sekcje były montowane z wektorowym Vectashield z dapi ((4′,6-diamidino-2-fenylindol)) nośnikiem montażowym (Vector Laboratories) pod pokrywą 24 × 50 mm2.

w przypadku immunohistochemii, slajdy poddano deparaffinizacji, a następnie pobrano antygen (roztwór ER2, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) i zabarwiono (protokół IHC F) przeciwciała CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) i CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, klon) (dane uzupełniające 2) na instrumencie Bond RXM (Leica Biosystems).

Zdjęcia wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Olympus Ix81 lub konfokalnego mikroskopu punktowego Zeiss Lsm710-NLO. Analiza po akwizycji zdjęć została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania ImageJ.

test fagocytozy

znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny bydlęce POS zostały wyizolowane i uprzejmie podane przez Dr E. F. Nandrot z Institut de la Vision, Paris37. komórki hPSC-RPE hodowano na błonie transwella (0,33 cm2, Corning) pokrytej hrLN-521 20 µg / mL przez 1 miesiąc po wysiewie. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C lub 4 °C przez 16 h z rozmrożonym POS/Transwell 2,42 × 106 rozcieńczonym w DMEM (Medium Dulbecco 's modified Eagle’ s) lub niezależnych od CO2 mediach (oba z Thermo Fisher Scientific), odpowiednio. Po inkubacji komórki hartowano roztworem Trypanu niebieskiego 0.2% (Gibco, Invitrogen) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, utrwalone 4% wolnym od metanolu formaldehydem (Polisciences) w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przenikane 0,3% Tritonem X-100 W D-PBS przez 15 minut. Do wizualizacji granic komórek wykorzystano barwienie falloidyną rodaminową (1:1000, 20 min w temperaturze pokojowej, Biotinum 00027) (dane uzupełniające 2). Jądra barwiono Hoechst 33342 (1: 1000, 20 min w temperaturze pokojowej, Invitrogen).

Zdjęcia uzyskano za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Zeiss Lsm710-NLO. Analiza po akwizycji zdjęć została przeprowadzona za pomocą Imaris (Bitplane), a kwantyfikacje POS wykonano za pomocą oprogramowania CellProfiler 2.1.1. Użyte Moduły: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages i ExportToSpreadsheet. Obiekty zidentyfikowano za pomocą typowej średnicy jednostek 10-40 pikseli przy użyciu dwóch klas, globalnej, Otsu, ważonej metody progowania wariancji z dolnymi i górnymi granicami 0,01 i 1,0 oraz współczynnika korekcji 2,1, z obiektami skupionymi wyróżnionymi intensywnością.

enzymatyczny test immunosorbentów

komórki hPSC-RPE hodowano na błonach Transwell (0,33 cm2, Millipore) pokrytych różnymi substratami. Supernatanty zarówno z wierzchołkowej, jak i podstawowej strony HPSC-RPE (czyli odpowiednio górnej i dolnej komory transwella) zbierano 60 godzin po zmianie pożywki. Poziomy wydzielania PEDF mierzono w trzech egzemplarzach dla każdego stanu za pomocą dostępnych na rynku ludzkich zestawów ELISA PEDF (BioVendor Rd191114200r), zgodnie z instrukcją producenta, po 60 dniach hodowli. Pomiary gęstości optycznej wykonano za pomocą czytnika mikropłytek SpectraMax 250 (Molecular Devices). Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM.

pomiary TEER

Rezystancja elektryczna Przezbłonowa ogniw RPE pokrytych Transwellami (0,33 cm2, Millipore) mierzono za pomocą woltomierza systemu oporu elektrycznego Millicell (Millicell ERS-2, Millipore), zgodnie z instrukcją producenta. Kultury sześćdziesięciodniowe równoważono poza inkubatorem w temperaturze pokojowej na 15-20 minut przed eksperymentem. Pomiary przeprowadzono w niezmienionych podłożach hodowlanych w trzech egzemplarzach dla każdego stanu, w trzech różnych pozycjach każdej studzienki. Średnie zostały wykorzystane do dalszej analizy. Rezystancję tła określono na podstawie pustej wkładki hodowlanej w tym samym podłożu pokrytym odpowiednim podłożem, ale bez komórek, i odjęto od odpowiedniego warunku eksperymentu. Pomiary są podawane jako rezystancja w omach razy powierzchnia w centymetrach kwadratowych (Ω × cm2). Wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM.

skaningowa mikroskopia elektronowa

komórki hPSC-RPE hodowano na wstawkach transwella pokrytych ln521 (20 µg/mL) przez 60 dni. Utrwalono je przez zanurzenie w 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 m buforze fosforanowym, pH 7,4. Membranę transwell wycięto i przemyto w Miliq wodzie przed stopniowym odwodnieniem etanolem i suszeniem w punkcie krytycznym przy użyciu dwutlenku węgla (Leica em CPD 030). Wkładki montowano na wycinkach próbek za pomocą karbonowych nakładek samoprzylepnych i sputter pokrytych cienką warstwą platyny (Quorum Q150T ES). Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego uzyskano przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Niemcy) przy 3 kV i detektora SE2.

transmisyjna mikroskopia elektronowa

komórki hPSC-RPE hodowano na wkładkach transwell pokrytych ln521 (20 µg/mL) przez 60 dni. Utrwalono je przez zanurzenie w 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 m buforze fosforanowym, pH 7,4. Błonę transwella wycięto i podzielono na cienkie paski, przepłukano w 0,1 m buforze fosforanowym, a następnie po utrwaleniu w 2% tetroksydzie osmu w 0,1 m buforze fosforanowym, pH 7,4, w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Paski membranowe poddano stopniowemu odwodnieniu etanolu i ostatecznie płasko osadzono w LX-112. Odcinki ultracienkie (~50-60 nm) przygotowano przy użyciu Leica EM UC7 i skontrastowano z octanem uranylu, a następnie cytrynianem ołowiu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa została wykonana na transmisyjnym mikroskopie elektronowym Hitachi HT7700 (Hitachi High-Technologies) pracującym przy 80 kV, a obrazy cyfrowe uzyskano za pomocą kamery CCD Veleta (Olympus Soft Imaging Solutions).

jednokomórkowe sekwencjonowanie RNA analiza bioinformatyczna

Sześćdziesięciodniowe komórki hPSC-RPE dysocjowano przy użyciu Tryple Select i przepuszczano przez sitko komórkowe (ø 40 µm, BD Biosciences). Zawieszono je w stężeniu 1000 komórek/µL w 0,04% BSA w PBS. Komórki przetransportowano w temperaturze 4 °C do Eukaryotic Single Cell Genomics Facility (ESCG, SciLifeLab, Sztokholm, Szwecja), gdzie przygotowano 3′ bibliotekę cDNA do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA za pomocą platformy 10x Genomics (10x Genomics) przy użyciu oprogramowania NovaSeq 6000. Cell Ranger 2.1.Potoczek 1 (10x genomika) został użyty do konwersji plików wywoławczych bazy Illumina do formatu fastq, wyrównania sekwencjonowania odczytów do transkryptomu hg19 przy użyciu STAR aligner38 i generowania macierzy kodów kreskowych. Cell Ranger quality-control filtrowane komórki (718, 810, 931 i 1129 kropelek zawierających komórki zostały wychwycone dla CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, replated 1:20 i hESC próbki, odpowiednio) analizowano w R wersji 3.5.1 (R Core Team)39, przy użyciu Seurat suite w wersji 2.3.440,41. Jako kolejny środek kontroli jakości wybrano komórki RPE o unikalnie wyrażonych genach (≥2000 do ≤5000), UMIs (≥10 000 do ≤30 000) oraz procent mapowania UMI do genów MT (≥0,025 do ≤0,10). Podobnie, hESC z genami o wyjątkowej ekspresji (≥2000 do ≤8000), UMIs (≥10 000 do ≤80 000) i odsetkiem mapowania UMI do genów MT (≥0,025 do ≤0,10). Ten etap filtracji zaowocował końcowym zestawem danych 616, 725, 779 i 905 komórek dla CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replated 1:20 i hESC próbki, odpowiednio. Przed redukcją wymiarowości za pomocą analizy głównego składnika (PC), zmienność komórek w ekspresji genów napędzana przez UMIs, ekspresję genów mitochondrialnych i etapy cyklu komórkowego ulegała regresji podczas procesu skalowania danych42. Zmienne geny w próbkach RPE wybrano na podstawie ich znormalizowanej średniej ekspresji i dyspersji (granica ekspresji = 0,0125-5 i granica dyspersji dolnej = 0,5). W przypadku wyboru PC oceniono wyniki PCHeatmap, jackStraw, odchylenia standardowe PC i analizę Clustree 43. Pierwsze 15 sztuk wykorzystano do analizy rzutów tsne44 i klastrów (Rozdzielczość = 0,1, rozdzielczość = 40).

klastry komórkowe analizowano za pomocą dwóch metod. Górne geny różnicowe zostały po raz pierwszy zidentyfikowane dla każdego klastra za pomocą testu sumy Rang Wilcoxona. Wtórna, sygnaturowa ekspresja genów (wyniki modułu) została obliczona dla niezróżnicowanego hESC i kilku typów komórek obecnych w ludzkiej siatkówce. Komórki wyrażające markery MEZODERM zostały ręcznie podzielone w oddzielny klaster za pomocą interaktywnych funkcji kreślarskich Seurat. Dane są przesyłane w ArrayExpress (EMBL-EBI) – zobacz szczegóły poniżej.

Zwierzęta

Po zatwierdzeniu przez Komitet ds. etyki zwierząt w północnym Sztokholmie (DNR N25 / 14) w badaniu tym wykorzystano 10 nowozelandzkich królików albinosów białych (dostarczonych przez Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Szwecja) W wieku 5 miesięcy, o wadze od 3,5 do 4,0 kg. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie ze stwierdzeniem dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

transplantacja Podretinalna

monowarstwy hPSC-RPE przemyto PBS, inkubowano z Tryplem i dysocjowano do zawiesiny jednokomórkowej. Komórki zliczano w komorze hemocytometru Neubauera przy użyciu 0,4% błękitu Trypanowego (Thermo Fisher Scientific Corp.), odwirowywano w temperaturze 300 × g przez 4 minuty, a osad komórki ponownie zawieszono w świeżo sterylizowanym filtrze PBS do końcowego stężenia 1000 komórek/µL. Zawiesinę komórek następnie aseptycznie podzielono na 600 µL jednostek i trzymano w lodzie do czasu operacji.

Zwierzęta poddano znieczuleniu ogólnemu domięśniowo 35 mg / kg ketaminy (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) i 5 mg/kg ksylazyny (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), a źrenice rozszerzono mieszanką 0,75% cyklopentolanu/2,5% fenylefryny (APL). Mikrochirurgię przeprowadzono na obu oczach przy użyciu 2-portowej, 25-G transwitrealnej techniki pars plana (Alcon Accurus, Alcon Nordic), jak opisano poprzednio45. Zawiesinę komórek pobrano do strzykawki o pojemności 1 mL połączonej z rurką przedłużającą i kaniulą politip 38g (MedOne Surgical Inc). Bez uprzedniej witrektomii, kaniula została wprowadzona przez górny trokar skroniowy. Po odpowiednim ustawieniu końcówki, stwierdzonym przez ogniskowy rozbłysk siatkówki, 50 µL zawiesiny komórkowej (co odpowiada 50 000 komórkom) wstrzyknięto powoli podretinalnie ~6 mm poniżej dolnego marginesu głowy nerwu wzrokowego, tworząc jednolity pęcherz, który był wyraźnie widoczny pod mikroskopem operacyjnym. Podczas wstrzyknięcia należy zachować końcówkę w obrębie pęcherzyka, aby zminimalizować refluks. Po wyjęciu narzędzia do samouszczelniających się sklerotomii zastosowano lekki nacisk. Dwa mikrogramy (100 µL) triamcynolonu do ciała szklistego (Triescence, Alcon Nordic) podano na tydzień przed zabiegiem i nie podano pooperacyjnych antybiotyków.

Statystyka i odtwarzalność

w przypadku analiz statystycznych przeprowadzono dwukierunkową analizę wariancji i wielokrotne porównania post hoc z wykorzystaniem korekcji testu Tukeya w celu oceny różnic in vitro różnych ocenianych gęstości i sortowania w porównaniu z powtórnymi warunkami w testach sekrecji Teer i PEDF.

wszystkie kwantyfikacje wykonano bez zaślepienia. Parametry statystyczne, w tym definicje i dokładna wartość n (np. całkowita liczba eksperymentów, replikacji itp.), odchylenia, wartości P i rodzaje testów statystycznych są podawane na rysunkach, odpowiednich legendach liczbowych iw tej sekcji. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu Prism 7 (oprogramowanie GraphPad, Wersja 7.0 c). We wszystkich przypadkach analizę statystyczną przeprowadzono na danych z co najmniej trzech biologicznie niezależnych replik doświadczalnych. Porównania między grupami zaplanowano przed testami statystycznymi, a docelowa wielkość efektu nie została z góry określona. Paski błędów wyświetlane na wykresach reprezentują średnią ± SEM co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Wszystkie przedstawione mikrografy są reprezentatywnymi obrazami trzech niezależnych eksperymentów, o ile nie określono inaczej (np. 1c).

Podsumowanie Raportu

Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportu Przyrodniczego połączonym z tym artykułem.