gospodarz grzybów
grzyby nitkowate mogą służyć jako gospodarze dla mikrobiologicznej fabryki komórek kwasu karminowego, ponieważ mają zdolność do dostarczania obfitych zapasów acetylo-CoA i malonylo-CoA do syntezy poliketydu rusztowanie. Oferują one również niezbędną infrastrukturę komórkową, aby pomieścić związaną z błoną ER C-glukozylotransferazę UGT28. Ponieważ A. nidulans posiada dobrze rozwinięty zestaw narzędzi do inżynierii genetycznej, wybraliśmy ten gatunek jako punkt wyjścia do rozwoju fabryki komórek grzybowych kwasu karminowego. Podobnie jak większość grzybów nitkowatych, A. nidulans jest w stanie wytworzyć mnóstwo biosyntetycznie zróżnicowanych metabolitów wtórnych, w tym znaczną liczbę aromatycznych poliketydów. Chiang et al. wcześniej wykazano, że delecja klastrów genowych, które są odpowiedzialne za tworzenie głównych endogennych produktów PKS w A. nidulans11, poprawiła potencjał A. nidulans jako fabryki komórek do heterologicznej produkcji poliketydów. W ten sposób zwiększa się Pula budulców acetylo-CoA i malonylo-Coa, a następnie upraszcza się analizy chemiczne w celu tworzenia nowych produktów. Jako pierwszy krok w kierunku fabryki komórek grzybowych do produkcji kwasu karminowego, wyeliminowaliśmy szlaki biosyntetyczne dla dominujących aromatycznych poliketydów, które mogłyby potencjalnie zakłócać produkcję kwasu karminowego i utrudniać analizę i dalsze oczyszczanie. W szczególności, klastry genów do produkcji aspertecyny, monodictyphenone i sterigmatocystin zostały wyeliminowane, jak również geny odpowiedzialne za tworzenie pigmentu zielonej konidia, wA i yA, zostały wyeliminowane w niehomologicznym endjoining defficient A. nidulans tła. Oprócz spodziewanego braku pigmentów stożkowych, powstały szczep, NID2252, nie wykazywał żadnego widocznego wpływu na morfologię i sprawność (plik uzupełniający, Fig. 1). Dlatego wykorzystaliśmy NID2252 jako szczep referencyjny i podstawę do budowy fabryki komórek grzybów do produkcji kwasu karminowego.
projekt półnaturalnej ścieżki tworzenia antronu kwasu flawokermesowego
główną przeszkodą w budowie fabryki komórek mikrobiologicznych kwasu karminowego był brak naturalnego PKS, który syntetyzuje Antron kwasu flawokermesowego, pierwszy domniemany związek pośredni w szlaku. Aby ominąć to ograniczenie, zastosowaliśmy alternatywną drogę biosyntetyczną do produkcji tego poliketydu. Antron kwasu flawokermesowego oktaketydu, ze wzorem cyklizacji C7-C12, C5-C14 i C2-C15, może teoretycznie zostać utworzony w jednym kroku przez iteracyjny PKS nie redukujący grzybów typu I, który posiada odpowiednią domenę szablonu produktu (Fig. 1 Lewa). Jednak w literaturze nie opisano dotąd takich enzymów. Alternatywnym mechanizmem tworzenia antronu kwasu flawokermesowego jest dwuetapowa reakcja, w której PKS syntetyzuje nie zredukowany liniowy łańcuch oktaketydu, który następnie jest cyklizowany do pożądanej struktury przez trans-działające cyklazy / aromatazy (Fig. 1 Prawo). Reakcje tego typu występują w naturze np. w szlaku aktynorhodiny (Act) u Streptomyces coelicolor12. W tym przypadku szkielet oktaketydu jest syntetyzowany przez wielopierścieniowy bakteryjny system PKS typu II, KSa, KSS i ACP (Act minimal PKS), który jest redukowany przez actKR w pozycji C9, a następnie składany przez aromatazę/cyklazę, actARO/CYC i cyklazę actCYC2, w celu uzyskania trójpierścieniowego związku kwasu 3,8-dihydroksy-1-metyloantrachinon-2-karboksylowego (DMAC)7. DMAC wykazuje taki sam fałd jak kwas flawokermesowy Antron, ale jest zredukowany w pozycji C9.
szczególnie interesujące dla niniejszego badania są cyklazy ZhuI i aromatazy ZhuJ ze Streptomyces Sp. R1128, który katalizuje dwie sekwencyjne reakcje cyklizacji nie zredukowanych liniowych poliketydów w fałdy podobne do kwasu flawokermesowego an throne13. W szczególności cyklaza ZhuI jest odpowiedzialna za zamknięcie pierwszego pierścienia, C7-C12, a aromataza ZhuJ za zamknięcie drugiego pierścienia, C5-C14. Trzeci Pierścień, C2-C15, powstaje samoistnie. ZhuI i ZhuJ były wcześniej współwystępowane w S. coelicolor z oktaketydem tworzącym typ II działa minimalnie PKS, powodując powstanie kwasu flawokermesowego, znanego jako kwas 3,6,8-trihydroksy-1-metyloantrachinon-2-karboksylowy (TMAC) w literaturze bakteryjnej14. Niestety, identyczna strategia może być trudna do wdrożenia u A. nidulans, ponieważ Minimalne PKSs typu II nie zostały skutecznie wdrożone u heterologicznych gospodarzy spoza rodzaju Streptomyces pomimo kilku prób15. I rzeczywiście nasze próby odtworzenia minipków act W A. nidulans i Saccharomyces cerevisiae również okazały się nieskuteczne(dane nie zostały pokazane). Alternatywnym sposobem tworzenia wymaganego, nie zmniejszonego oktaketydu jest poleganie na enzymach PKS typu III, które z powodzeniem ulegały ekspresji w drożdżach, np. w połączeniu z biosyntezą flawonoidów16. Szczególnie interesująca jest syntaza oktaketydowa aloesu arborescens (OKS), która została opisana do wytwarzania nie zmniejszonych oktaketydów, które samoistnie składają się w SEK4 i SEK4b w witro17 (Fig. 2A). Jednakże w Aspergillus nie zostało zbadane, czy produkty PKSs typu III, które są enzymami niezależnymi od ACP, uwalniającymi kwasy karboksylowe, mogą być składane przez cyklazę typu ZhuI, która jak opisano, działa na substraty związane z ACP. W bieżącym badaniu postanowiliśmy zatem zbadać zgodność OKS roślinnego typu III z cyklaz / Aromataz z bakteryjnych systemów PKS typu II, w celu opracowania sztucznego de novo szlaku biosyntetycznego do tworzenia prekursora kwasu flawokermesowego antronowego do tworzenia kwasu karminowego.
Tworzenie nieskrępowanego oktaketydu. a) samoistne składanie się nieskrępowanych oktaketydów. B) fenotyp szczepu referencyjnego Aspergillus nidulans NID2252 i szczepów, które wykazują OKS przy użyciu kodonu natywnego lub zoptymalizowanego. C) profil metaboliczny szczepu referencyjnego A. nidulans NID2252 i szczepów wykazujących ekspresję OKS. Chromatogram piku bazowego (jasnoszary) ze wskazaniem wybranych metabolitów: SEK4 (niebieski), dehydro-SEK4 (ciemnoniebieski), SEK4b (fioletowy), dehydro-SEK4b (Ciemnofioletowy), mutaktyna (pomarańczowy) i kwas flawokermesowy (limonka).
produkcja prekursorów poliketydów do produkcji kwasu karminowego w A. nidulans
aby przetestować działanie OKS in vivo u gospodarza grzyba, wprowadziliśmy OKS kontrolowane przez promotor gpdA A. nidulans jako pojedynczą kopię do określonego locus (miejsce integracji 5, IS5) w A. nidulans genom18. Skonstruowano dwa szczepy, jeden wyrażający natywną sekwencję kodującą OKS i jeden wyrażający kodon zoptymalizowany do ekspresji w A. nidulans. Po siedmiu dniach inkubacji na stałych nośnikach wzrostu, patrz sekcja Metody, aby uzyskać szczegółowe informacje, oba szczepy wykazywały silne czerwono-brązowe zabarwienie grzybni (Fig. 2b). Profilowanie metaboliczne szczepów za pomocą HPLC-HRMS nie ujawniło żadnych śladów nie zmniejszonego oktaketydu, ale raczej oczekiwane SEK4 i SEK4b wraz z kwasem flawokermesowym i trzema innymi obfitymi związkami o nieznanej tożsamości (Fig. 2c), które nie były obecne w szczepie referencyjnym NID2252. SEK4 i SEK4b zidentyfikowano na podstawie dokładnej analizy HPLC-HRMS / MS (plik uzupełniający, Fig. 2) i był zgodny z wcześniej zgłoszonymi wartościami19, podczas gdy kwas flawokermesowy porównano z autentycznym odniesieniem wyizolowanym z D. coccus9 (plik uzupełniający, Fig. 3). Metabolit eluuje się w czasie 13,0 min. miał jon pseudomolekularny + m / z 303.0867, odpowiadający wzorze cząsteczkowym C16H14O6, zgodnemu ze znanym produktem przetoki oktaketydowej, mutactin, opisanym wcześniej w eksperymentach opartych na Streptomyces z klastrem genów Act 7. Identyfikacja ta została potwierdzona poprzez szczegółową analizę widma UV i wsparta czasem retencji względem SEK4 i SEK4b (plik uzupełniający, Fig. 4). Dwa dodatkowe metabolity o wzorach cząsteczkowych C16H12O6 (- m/z 299.0566) wskazywały na produkty oktaketydu, ale jednak nie odpowiadały powszechnemu produktowi przetoki (plik uzupełniający, Fig. 5). W związku z tym metabolity wyizolowano i wyjaśniono strukturę w oparciu o eksperymenty 1D i 2D NMR zidentyfikowano je jako dehydro-SEK4 (znany również jako B26 w literaturze bakteryjnej) i dehydro-SEK4b20 (plik uzupełniający, Fig.6-11). Powstawanie sześciu nowych poliketydów zaobserwowanych w szczepie OKS można wyjaśnić trzema różnymi spontanicznymi reakcjami zamknięcia pierwszego pierścienia: C7-C12 (SEK4, dehydro-SEK4 i kwas flawokermesowy), C10-C15 (SEK4b i dehydro-SEK4b) i C7-C12 po redukcji ketonu C9 (mutaktyna) (Fig. 2a i plik uzupełniający, rys. 12). Spośród nich tylko pierwszy Typ zamknięcia pierścieniowego (C7-C12) pozwala na późniejsze tworzenie żądanego kwasu flawokermesowego antronu poprzez drugie zamknięcie pierścieniowe C5-C14 i trzecie zamknięcie pierścieniowe C2-C15. Wcześniej zgłaszano, że SEK4 i SEK4b samoistnie ulegają odwodnieniu, tworząc odpowiednio dehydro-SEK4 i dehydro-SEK4b, podczas gdy tworzenie mutaktyny zależy od enzymatycznej redukcji pozycji C9 łańcucha poliketydowego przed fałdowaniem 21. Tworzenie kwasu flawokermesowego, znanego związku pośredniego w szlaku kwasu karminowego (Fig. 1), było nieoczekiwane, ponieważ metabolit ten nie powstawał samoistnie z nie zmniejszonych łańcuchów oktaketydowych. Sugeruje to, że A. nidulans naturalnie wytwarza szereg cyklaz/Aromataz, które promują pożądany wzór składania. Profilowanie metabolitów dwóch szczepów ekspresyjnych OKS nie wykazało żadnych istotnych różnic w poziomach produkcji i zdecydowaliśmy się skupić na szczepie ekspresyjnym natywnej wersji OKS jako podstawie do dalszego rozwoju fabryki komórek grzybów do produkcji kwasu karminowego.
Inżynieria ścieżki fałdowania nie zmniejszonych oktaketydów
rozwiązłe fałdowanie nie zmniejszonego oktaketydu zmniejsza wydajność pożądanego kwasu flawokermesowego. Dlatego przewidzieliśmy, że produkcję kwasu flawokermesowego można zwiększyć poprzez usprawnienie procesu składania w pożądanym kierunku poprzez wyrażenie zoptymalizowanych kodonowo wersji ZhuI i ZhuJ. Aby zbadać, czy ZhuI i ZhuJ zakłócają natywny metabolizm A. nidulans, najpierw skonstruowaliśmy szczepy wyrażające ZhuI i ZhuJ indywidualnie i w kombinacji z określonych loci genomowych (IS6 i IS7) w A. nidulans nid2252 szczep referencyjny. Profilowanie metaboliczne trzech szczepów metodą HPLC-HRMS nie wykazało żadnych wykrywalnych różnic metabolicznych (Fig. 3b). Następnie skonstruowaliśmy szczep współekspresujący OKS z ZhuI, który koduje cyklazy katalizujące tworzenie pierwszego zamknięcia pierścienia C7-C12 (Fig. 3A). W porównaniu ze szczepem wykazującym jedynie OKS, szczep ten wykazywał 2,5-, 2,2-i 2,1-krotne zwiększenie stężenia kwasu flawokermesowego, 4 sek i dehydro-4 sek. W zgodzie z Zhui przewodnie składanie w pożądanym kierunku, te zmiany metaboliczne towarzyszyły obniżone poziomy metabolitów zawierających niepożądane fałdy pierwszego pierścienia (Fig. 3b i Tabela 1). Szczep współwyrażający OKS i ZhuJ, który koduje aromatazy katalizujące Zamknięcie drugiego pierścienia C5-C14 (Fig. 3a), powodował 2,7-krotny wzrost poziomu kwasu flawokermesowego. Wzrostowi temu towarzyszyło zmniejszenie stężenia metabolitów z pierwszym fałdem pierścieniowym C7-C12 (SEK4 i dehydro-SEK4), podczas gdy, zgodnie z oczekiwaniami, nie miało to wpływu na poziom metabolitów z niepożądanym fałdem pierścieniowym C10-C15 (SEK4b i dehydro-SEK4b) (Fig. 3b i Tabela 1). Wreszcie, analiza szczepu wyrażającego ZhuI, ZhuJ i OKS wykazała 4,1-krotny wzrost produkcji kwasu flawokermesowego w porównaniu do ekspresji samego OKS. Ponadto wzrost ten jest o 60% wyższy niż obserwowany w przypadku szczepów wykazujących ekspresję OKS w połączeniu odpowiednio z ZhuI lub ZhuJ (Tabela 1). Wynik ten wskazuje, że cyklaza i aromataza, w sposób addytywny, są w stanie zwiększyć strumień w sztucznym szlaku de novo w kierunku pożądanego produktu, kwasu flawokermesowego (Fig. 3b).
kierowanie składaniem szkieletu oktaketydy. a) etapy biosyntetyczne od nie zredukowanego oktaketydu do antronu kwasu flawokermesowego. B) ukierunkowana analiza chemiczna szczepów referencyjnych Aspergillus nidulans NID2252 (szczep z usuniętymi klastrami PKS) i NID2252 wyrażających ZhuI, lub ZhuJ, lub ZhuI + ZhuJ, lub OKS, lub OKS + ZhuI, lub OKS + ZhuJ i OKS + ZhuI + ZhuJ. Chromatogram piku zasadowego (jasnoszary) ze wskazaniem wybranych metabolitów: SEK4 (niebieski), dehydro-SEK4 (ciemnoniebieski), SEK4b (fioletowy), dehydro-SEK4b (Ciemnofioletowy), mutaktyna, (pomarańczowy) i kwas flawokermesowy (wapienny). C) morfologia Kolonii szczepów rozmnażanych przez siedem dni na pożywce minimalnej.
zaskakująco i bardzo zachęcająco, dalsza analiza metaboliczna szczepu współekspresującego OKS, ZhuI i ZhuJ ujawniła, że zwiększonemu tworzeniu się kwasu flawokermesowego towarzyszyło wytwarzanie kwasu kermesowego (Fig. 4). Stąd A. nidulans dostarcza niezbędnej monooksygenazy do przekształcania kwasu flawokermesowego w kwas kermesowy, który może służyć jako końcowy związek pośredni w szlaku kwasu karminowego (Fig. 1).
etapy oksydacyjne związane z powstawaniem kwasu kermesowego. a) etapy utleniania od antronu kwasu flawokermesowego do kwasu kermesowego. B) ukierunkowana analiza metaboliczna do produkcji kwasu flawokermesowego (FK) i kwasu kermesowego (KA) w szczepie referencyjnym NID2252 (szczep z usuniętymi klastrami PKS), szczepie wyrażającym OKS i szczepie OKS + ZhuI + ZhuJ. Chromatogram przedstawia podstawowy chromatogram pikowy (jasnoszary) ze wskazaniem kwasu flawokermesowego (wapno) i kwasu kermesowego (niebieski).
produkcja kwasu karminowego w A. nidulans
ostatni etap tworzenia kwasu karminowego obejmuje glukozylację kwasu kermesowego (rys. 5A). Enzym odpowiedzialny za ten etap w szlaku biosyntetycznym kwasu karminowego został wcześniej zidentyfikowany U D. coccus i charakteryzuje się ekspresją heterologiczną U S. cerevisiae8. W związku z tym wstawiliśmy gen kodujący UGT2, zoptymalizowany pod kątem ekspresji w A. nidulans, do locus IS4 szczepu referencyjnego NID2252 i w celu uzupełnienia półnaturalnego szlaku biosyntetycznego kwasu karminowego w A. nidulans, do tego samego locus w szczepie współekspresującym ZhuI, ZhuJ i OKS. Ekspresja samego UGT2 w szczepie referencyjnym nie miała wpływu na wygląd podłoża wzrostu ani na profil metaboliczny A. nidulans w porównaniu do szczepu referencyjnego NID2252 (Fig. 5b,c). W przeciwieństwie do tego, współekspresja OKS, ZhuI, ZhuJ i UGT2 doprowadziła do czerwonego zabarwienia podłoża, co sugeruje, że powstał bardziej rozpuszczalny w wodzie barwnik(s) (Fig. 5b). Ukierunkowana analiza LC-HRMS tego szczepu potwierdziła powstawanie kwasu karminowego22 (plik uzupełniający, Fig. 13), wraz z dcII9, 23 i izomerem DCII (plik uzupełniający, rys. 14), wykazując, że UGT2 funkcjonował w A. nidulany i mógł z powodzeniem ukończyć szlak biosyntetyczny (rys. 5c). Pozytywną identyfikację kwasu karminowego i dcII oparto na podobnych czasach retencji, widmach UV, schematach fragmentacji MS I MS/MS dla czystych wzorców obu związków. Trzy izomery kwasu karminowego zostały opisane w literaturze (kwas karminowy, DCIV i DCVII) przez Stathopoulou i wsp.23, wszystkie trzy pokazują różne czasy retencji w analizie opartej na LC-MS / MS. W naszej analizie wykryto tylko kwas karminowy, a nie DCIV i DCVII na podstawie czasu retencji i wzoru fragmentacji autentycznego wzorca kwasu karminowego wyizolowanego z D. coccus (plik uzupełniający, Fig. 13). Razem nasze dane wyraźnie pokazują, że możliwe jest wytwarzanie kwasu karminowego w A. nidulans w oparciu o półnaturalny szlak.
etap Glukozylacji do formowania kwasu karminowego. a) glukozylotransferaza DACTYLOPIUS coccus UGT2 przyjmuje zarówno kwas kermesowy, jak i kwas flawokermesowy jako substraty, w wyniku czego powstaje odpowiednio kwas karminowy i dcII. B) fenotypowy efekt ekspresji samego UGT2 i w połączeniu z syntetycznym PKS w tle Nid2252 Aspergillus nidulans, zdjęcia wykonane po siedmiu dniach inkubacji. C) ukierunkowana analiza metaboliczna do wytwarzania związków glukozylowanych, np. kwasu karminowego (czerwonego) i DCII (pomarańczowego) nałożonego na siebie chromatogramu piku zasadowego (jasnoszarego).
