projekt badania

badanie VX-765: 5-miesięczne wstrzyknięcie nośnika WT (WT + nośnik; n = 18) i myszy J20 (J20 + nośnik: N = 14) i myszy J20 wstrzyknięte VX-765 (WT + nośnik: J20 + VX-765: N = 13) myszy oceniano wzdłużnie w pięciu różnych punktach czasowych: przed rozpoczęciem leczenia (wyjściowe nieleczone J20 grupowano razem; n = 19), po trzech wstrzyknięciach IP w tygodniu VX-765 lub nośnika (leczenie 1), po sześciu dodatkowych wstrzyknięciach w ciągu 2 tygodni (leczenie 2), po 4-tygodniowym okresie wymywania (WO) i po dodatkowych trzech wstrzyknięciach w ciągu 1 tygodnia (leczenie 3) (rys. 1a). Wszystkie badane zwierzęta zostały włączone do analiz, chyba że (a) zwierzę padło podczas eksperymentu lub (b) zwierzę nie zareagowało behawioralnie. W sumie wykorzystano 25 miotów, rozlokowanych w czterech różnych kohortach i testowanych w różnym czasie. Trzy z tych kohort przeszły testy NOR i open field, podczas gdy kohort 4 był używany do Barnes maze. Po początkowym badaniu zwierząt w celu potwierdzenia, że zwierzęta J20 wykazywały deficyt behawioralny, zwierzęta J20 przydzielono losowo do leczenia nośnikiem lub VX-765 niezależnie od wyników behawioralnych. Spośród wszystkich użytych zwierząt cztery myszy J20 nie wykazywały żadnych deficytów behawioralnych na początku eksperymentu i nie były używane. Dwie myszy w pojeździe J20 + nie poruszały się w ogóle podczas eksperymentu, a ich dane behawioralne wykluczyły się; zwierzęta te były jednak trzymane i nadal były wykorzystywane do analizy pośmiertnej.

badanie walidacji Casp1: w celu potwierdzenia specyficznych dla Casp1 efektów VX-765, myszy J20 wygenerowano na tle Casp1 -/−. Wykorzystano siedemdziesiąt trzy myszy (N = 12-13 na genotyp, sześć różnych genotypów), z których wszystkie zostały wyhodowane przez zapłodnienie in vitro (IVF) od 35 samic-dawców. Szczegóły dotyczące hodowli opisano w części dotyczącej badań na zwierzętach poniżej. Wszystkie myszy oceniano behawioralnie między 7 a 8 miesiącem życia i żadne zwierzęta nie zostały wykluczone z tego badania.

wszystkie myszy poświęcono i poddano obróbce w wieku 8 miesięcy. Ocena behawioralna była zaślepiona pod względem genotypu myszy i leczenia, a wszystkie zwierzęta przydzielono losowo do analizy biochemicznej lub histologicznej i poddano ślepej analizie.

VX-765, VRT-043198 IC50 testy rekombinowanych kaspaz

badania na zwierzętach

wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi Canadian Council on Animal Care i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad zwierzętami Uniwersytetu McGill. Linia myszy transgenicznych J20 (Jax Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) wyraża mutacje aplikacji Szwedzkiej (670/671KM→NL) i Indiany (717V→F) pod PDGF-ßpromoter. Samce myszy J20 były używane jako hodowcy, a ich plemniki były używane do ekspansji Kolonii IVF.

genotypy oznaczono biopsją ogona i RT-PCR. Myszy były trzymane grupowo (2-4 zwierzęta w klatce) w standardowych klatkach macrolon w 12-godzinnym cyklu odwrotnego światła/ciemności i kontrolowanych warunkach środowiskowych. Żywność i woda były dostępne ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) rozpuszczono w 20% kremoforze w dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada) i podawano dootrzewnowo. Leczone pojazdem myszy J20 i WT otrzymywały tylko cremofor.

analiza przepuszczalności bariery krew–mózg

5-miesięczne myszy J20 i WT znieczulono izofluranem i oddzielono prawą tętnicę szyjną. Wykonano małe nacięcie wzdłuż ściany szyjnej i wstawiono mikro cewnik do wejścia do tętnicy szyjnej wewnętrznej. Cewnik zabezpieczono na miejscu za pomocą nici do szycia. VX−765 (50 mg kg−1) podawano w infuzji przy 50 µl min-1 (90-120 µl całkowitej objętości). Mikro cewnik pozostawiono dodatkowe 5 minut na dyfuzję, po czym pobrano krew przez nakłucie wewnątrzsercowe. Mysz była przezskórnie perfuzowana lodowatym roztworem soli fizjologicznej, a hipokamp i kora mózgowa zostały rozcięte. Próbki zostały wysłane do platformy Biofarmacy (Université de Montreal)do chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii masowej.

analiza behawioralna

otwarte pole: aktywność ruchową mierzono za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia hvs2100 (HVS Image, Hamptom, Wielka Brytania). Myszy umieszczano w otwartej komorze polowej (skrzynka z pleksiglasu o wymiarach 40 × 40 cm, bez sufitu i białej podłogi) i pozwalano na eksplorację przez 5 min.

nowe rozpoznawanie obiektów (NOR): myszy były wstępnie wystawione na działanie dwóch identycznych obiektów w komorze otwartego pola przez 5 minut. Dwie godziny po wstępnej ekspozycji myszy umieszczano z powrotem w komorze i wystawiano na działanie jednego znanego obiektu i jednego nowego obiektu na 5 minut. Myszy wystawiono na konkretny obiekt tylko raz w różnych sesjach testowych, a nowe rozmieszczenie obiektów zostało zrównoważone w każdej grupie badanej. Oceniono procentowe dotknięcia nowego obiektu podczas fazy testowej oraz wskaźnik dyskryminacji ((# dotknięcia powieści − # dotknięcia znane) / dotknięcia całkowite).

Barnes maze: Platforma Barnes maze (średnica 91 cm, Wysokość 90 cm od podłogi) składała się z 20 otworów (każdy o średnicy 5 cm). Wszystkie otwory były zablokowane, z wyjątkiem jednego otworu docelowego, który prowadził do zagłębionej skrzynki ratunkowej. Sygnały przestrzenne, jasne światło i biały szum były wykorzystywane do motywowania myszy do znalezienia ucieczki podczas każdej sesji. W fazie adaptacji każda mysz badała platformę przez 60 s. każda mysz, która nie znalazła skrzynki ratunkowej, była kierowana do niej i pozostawała tam przez 90 s. w fazie akwizycji każda próba przebiegała według tego samego protokołu, z celem wytrenowania każdej myszy, aby znalazła cel i weszła do skrzynki ratunkowej w ciągu 180 s. myszy pozostawały w skrzynce przez dodatkowe 60 s. cztery próby dziennie, w odstępie około 15 minut, były przeprowadzane przez 4 kolejne dni. W teście sondy (dzień 5) każda mysz wykonała jedną 90-sekundową próbę. Cel nadal znajdował się w tej samej pozycji, ale Skrzynka ewakuacyjna była zablokowana. Zmierzono opóźnienie i błędy dotarcia do celu, a także liczbę uderzeń myszą do każdego z otworów (preferencja celu). Labirynt Y składał się z symetrycznego labiryntu w kształcie litery Y Z trzema ramionami 120° od siebie, oznaczonymi A, B i C. zwierzęta zostały umieszczone na dalszym końcu ramienia a i mogły zwiedzać labirynt przez 5 minut. Rejestrowano całkowite wpisy ramion i spontaniczne zmiany, zdefiniowane jako kolejne wpisy w trzech różnych ramionach. Określono procentową zmianę.

przetwarzanie tkanek

w przypadku immunohistochemii myszy (n = 4-6 na Grupę) znieczulono izofluoranem i przezskórnie perfuzowano lodowatą solą fizjologiczną, a następnie lodowatą 4% paraformaldehydem (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) w 0,1 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej. Mózgi były utrwalane w 10% neutralnej buforowanej formalinie (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Kanada) przez 16 godzin i przenoszone do 70% etanolu. Mózgi były osadzone i podzielone na 4 µm.

w przypadku western blot i ELISA (n = 4-8 na Grupę) znieczulone myszy zwichnięto szyjką macicy, rozcięto hipokamp i korę mózgową i natychmiast zamrożono na suchym lodzie. Białka ekstrahowano w 5× Objętość/masę buforem testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% na-deoksycholan, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mm PMSF, 10 µl ml−1 koktajlu inhibitorów proteaz (Sigma-Aldrich)) na lodzie za pomocą homogenizatora tkankowego (OMNI International, Kennesaw, GA, USA). Próbki odwirowywano (20 000 × g, 4 °C) przez 20 minut, supernatant odzyskiwano i oznaczano ilościowo białko metodą BCA. Nierozpuszczalny osad RIPA ekstrahowano dalej w 70% kwasie mrówkowym w dH2O, odparowywano i resolubilizowano w 200 mM Tris-HCl, pH 7,5.

immunohistologiczne zabarwienie

epitopy demaskowano w cytrynianie (10 mM cytrynian Tris-Na, pH 6,0) lub EDTA (10 mM Zasada Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) bufor pobierania antygenu i immunostained za pomocą DAKO Autostainer Plus automated slide processor i EnVision Flex system (Dako, Burlington, ON, Kanada). Po deparaffinizacji i ponownym nawodnieniu, sekcje leczono peroksydazą, blokowano w blokach białek wolnych od surowicy i immunosterowano następującymi przeciwciałami rozcieńczonymi w rozcieńczalniku przeciwciała Envision Flex: 1:2000 rabbit anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 rabbit anti-GFAP (Dako z-0334), 1:2000 rabbit anti-Aß1-40 (F25276, opracowane laboratoryjnie) i 1:1000 mysi antysynaptofizyna (Sigma-Aldrich s5768). Sekcje leczono odpowiednim, sprzężonym z HRP mysim lub króliczym przeciwciałem wtórnym dostarczonym w zestawie i wizualizowano DAB. Sekcje były przeciwstawiane hematoksyliną, odwodnione i pokrywane Permount (Fisher Scientific). Sekcje zostały zeskanowane cyfrowo za pomocą MIRAX SCAN do analizy (Zeiss, Don Mills, ON, Kanada). Po deparaffinizacji i ponownym nawodnieniu szkiełka zabarwiono przefiltrowaną 1% wodną Tioflawiną-s (Sigma-Aldrich).

ilościowa analiza immunohistologiczna

komórki iba1-dodatnie w korze i przedniej części regionu CA1 hipokampa oznaczono ilościowo przy użyciu zmodyfikowanej wersji ramki liczenia obszarów48. Krótko mówiąc, co piąty slajd był oznaczany ilościowo (w wyniku czego cztery sekcje na mózg). Wiele ×80 zdjęć zostało wykonanych skanowaniem MIRAX w obszarze zainteresowania, a liczba komórek iba1-dodatnich została ręcznie policzona. Oszacowano gęstość liczbową (liczba komórek mm−3)w obszarze przedniego CA1 i kory mózgowej. Aby dokonać wiarygodnych szacunków, potrzebna była minimalna liczba 150 trafień na obszar. Dodatkowe sekcje były liczone, jeśli nie byliśmy w stanie osiągnąć naszej minimalnej liczby. Oznaczanie ilościowe przeprowadzono ślepo pod kątem leczenia i genotypu. Oprogramowanie ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA)zostało użyte do pomiaru akumulacji Aß, GFAP i immunopozytywnego barwienia synaptofizyny w regionie CA1 i korze mózgowej. Analizowano cztery sekcje na mózg i wykonano wiele obrazów w każdej sekcji, aby objąć obszar CA1 i korę mózgową. Próg był jednakowo regulowany we wszystkich mózgach w celu podkreślenia zabarwionego obszaru, a cząstki analizowano w celu określenia całkowitego obszaru zabarwienia. Wyniki są wyrażone jako całkowita powierzchnia barwiona na całkowitą powierzchnię analizowaną (µm2 mm-2). Reprezentatywne obrazy zostały przycięte tylko w celu dostosowania do ograniczeń rozmiaru i nie zostały poddane żadnej obróbce końcowej.

Western blotting

próbki białka myszy (25-100 µg) przygotowano w Laemmli (5% 2-β-merkaptoetanolu, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 koktajlu inhibitorów proteaz (Sigma-Aldrich)), gotowano przez 5 minut i oddzielano elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Próbki przebadano z następującymi przeciwciałami pierwotnymi, rozcieńczonymi w 5% suchym mleku beztłuszczowym w roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris i 0,1% buforem blokującym Tween-20 lub PBS (Thermoscientific): 1:1000 mysz anty-ludzka aß1-16 (6e10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1: 1000 mysz anty-ludzka aß1-16 (6e10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA):2000 rabbit anti-APP C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 rabbit anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 rabbit anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 rabbit anti-Caspase-3 (Sygnalizacja komórkowa 9665), 1:1000 mysi Antyactive Caspase-8 (Sygnalizacja komórkowa 8592), 1:1000 rabbit Anti-anty-kaspaza-9 (sygnalizacja komórkowa 9504) i mysi anty β-aktyna 1:5000 (Sigma-Aldrich a5441). Plamki wykryto z przeciwciałami drugorzędowymi przeciw myszy (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) lub przeciwciałami przeciw królikom (Dako P0217) w stosunku 1:5000 HRP, a następnie ECL (GE Amersham). Zespoły immunoreaktywne wizualizowano za pomocą ImageQuant LAS 4000 imaging system (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), a analizy densytometryczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy wskaźników obrazu (Fujifilm USA). Jasność / kontrast plam raw zostały jednakowo dostosowane na całym obrazie za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) w celu generowania reprezentatywnych obrazów. Nie wprowadzono żadnych dodatkowych modyfikacji. Oprogramowanie CanvasTM X (System Acd, Plantation, FL, USA) zostało użyte do stworzenia ostatecznych figur. Surowe plamy dla zachodnich plam są dostępne na rysunku uzupełniającym 11.

Elisa

cytokiny Pro – i przeciwzapalne oraz poziomy Aß w mózgu myszy oznaczano za pomocą zestawów do testu immunologicznego elektrochemiluminescencyjnego z Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Normy i próbki zostały przygotowane zgodnie z protokołami producenta i uruchomione w dwóch egzemplarzach. Do badań hipokampu i kory myszy oraz próbek wykorzystano płytkę prozapalną z plexu. Do pomiaru osocza myszy użyto pojedynczego zestawu Il-1β. W próbkach HPN zastosowano czteropłytowy ludzki panel prozapalny (patrz poniżej). Czteroczęściowy ludzki zestaw aß 6E10 był używany do próbek hipokampa i kory myszy oraz HPN.

ekstrakcję RNA i syntezę cDNA

całkowite RNA ekstrahowano z hipokampa myszy i kory (N = 3 na Grupę) za pomocą Qiazolu (Qiagen, Valencia, CA, USA), a następnie homogenizację za pomocą igły 20-gauge. Mini kit miRNeasy, zawierający kolumnowy etap leczenia Dnazą, został użyty do oczyszczenia całkowitego RNA (Qiagen). Jakość i ilość RNA oznaczano za pomocą spektrofotometru (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Produkty zostały zobrazowane na żelu agarozowym 2% firmy RedSafe (Froggabio, North York, ON, Kanada). Eksperymenty PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono z użyciem SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) na maszynie Applied Biosystems 7500 Fast real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Amplifikację genów przeprowadzono za pomocą następujących starterów: (18s) 5′-GTAACCCGTGAACCCCAT-3′ i 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′- ACTAACCTGGTGGTGAAG – 3′ i 5′-GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ i 5′- CTCCCACAGCATTCTCCAT-3′. Wyniki są wyrażane jako wartości indukcji krotnie znormalizowane do oznaczania genów referencyjnych HPRT i 18s przy użyciu metody Pfaffl.

Mysia plastyczność synaptyczna RT2-Profiler PCR Array

Mysia plastyczność synaptyczna RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profiluje ekspresję 84 genów biorących udział w zmianach synaptycznych podczas uczenia się i pamięci oraz pięciu genów domowych (β-aktyna; β-2-mikroglobulina; dehydrogenaza 3-fosforanowa glyceraldehydu, GAPDH; β-glukuronidaza, Gusb; Białko szoku cieplnego 90 Alfa (cytosolic), Hsp90ab1) z PCR w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA (465 ng dla każdej próbki) poddano odwrotnej transkrypcji (obejmującej etap eliminacji genomowego DNA) zgodnie z protokołem producenta (zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA, Qiagen). Reakcja PCR w czasie rzeczywistym została przeprowadzona w czasie rzeczywistym cycler ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) przy użyciu RT2 SYBR Green/ROX PCR Master mix (Qiagen). Warunki jazdy na rowerze były następujące: 2 min w temperaturze 50 °C, 10 min w temperaturze 95 °C, 40 cykli, po 15 s każdy w temperaturze 95 °C i 1 min w temperaturze 60 °C. Próg i linię bazową ustawiano ręcznie zgodnie z instrukcjami producenta. Dane znormalizowano do średniej geometrycznej pięciu genów i przeanalizowano metodą porównawczą Ct (2-ΔCT).

hodowlę komórek neuronalnych i test zwyrodnienia aksonalnego

tkankę korową płodu w wieku od dwunastu do szesnastu tygodni uzyskano z Laboratorium Badań nad wadami wrodzonymi (University of Washington, Seattle, USA) zgodnie z zatwierdzonym protokołem przez McGill institutional review board. HPN hodowano z mózgów, które zostały poddane dysocjacji trypsyną, potraktowano deoksyrybonukleazą I i przesączono przez siatkę nylonową 130, 70 i 30 µm 21. Dysocjowane komórki odwirowywano przez 10 minut przy 300 × g i zawieszano w minimal essential medium (mem) z solami Earle ’ a i uzupełniano 5% dekompletowanym BCS, 1× penicyliną-streptomycyną, 1 mM pirogronianem sodu i 2 mM l-glutaminą (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komórki wysiewano z gęstością 3×106 komórek ml-1 na 5 µg mL−1 pokrytych Poli-L-lizyną sześciostopniowych płytkach do hodowli tkankowych (Sigma-Aldrich). Pożywkę MEM zmieniano co 2 dni, a proliferację astrocytów ograniczano za pomocą fluorodeoksyurydyny (FdU) w leczeniu antymitotycznym (1 mM, Sigma) przez pierwsze 4 dni. Kultury neuronalne hodowano 7-10 dni przed przeprowadzeniem eksperymentów. Testowano cztery różne preparaty neuronów w różnym czasie. Jeden z preparatów neuronu nie był stabilny, a kultura, w tym surowica + kontrola, która nie otrzymała żadnego leku, zmarła w trakcie eksperymentu. W związku z tym zastosowano trzy różne preparaty neuronów od trzech genetycznie różnych dawców.

toksyczność VX-765 oceniano bromkiem 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT). Neurony leczono 25-200 µM VX-765 lub 0,1% DMSO (najwyższe zastosowane stężenie DMSO) przez 72 godziny. następnie neurony inkubowano z 0,5 µg ml−1 MTT (Sigma-Aldrich) przez 4 godziny w 37 °C (5% CO2). Kryształy formazanu rozpuszczono w 100 µl DMSO przez 30 minut. Absorbancję mierzono przy 560 i 670 nm za pomocą czytnika płyt Synergy H4.

zwyrodnienie aksonalne wywołano albo przez transfekcję APPWT, albo przez stres deprywacji w surowicy. VX-765 podawano albo jako strategię leczenia wstępnego (1 h przed stresorem), albo jako strategię leczenia postbeadingowego (48 h po stresorze). Neurony były transfekowane przez Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Kanada) za pomocą złotych kulek pokrytych pBudCE41-eGFP w celu wizualizacji fluorescencji. Neurony, które były zestresowane APPWT, transfekowano za pomocą pBudCE41-eGFP/APPWT. Krótko, neurony leczono pożywką uzupełnioną 25 lub 50 µM inhibitorem VX-765, 5 µM inhibitorem Casp1 z-YVAD-fmk lub DMSO. Zdjęcia fluorescencyjne wykonywano co 24 godziny (do 72 godzin po zabiegu) przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse ti (Nikon, Mississauga, ON, CA) i Kamery CCD Photometrics COOLSNAP HQ2 (Photometrics, Tucson, AZ, USA) przy użyciu oprogramowania NIS Elements AR 3.10 (Nikon). Procentowe Wiązanie neuronów mierzono, licząc liczbę zroszony EGFP-dodatnich neuronów nad całkowitą liczbą EGFP-dodatnich neuronów w każdym punkcie czasowym. Dla każdego stanu liczono co najmniej 150 neuronów EGFP-dodatnich. Pobrano pożywkę kondycjonowaną (uzupełniono 1 mM Na3VO4, 1 mM NAF, 1 mm PMSF, 10 µl ml-1 koktajlu inhibitorów proteaz (Sigma-Aldrich)), a neurony zebrano w buforze do lizy komórek (50 mm HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mm EDTA) do analizy.

analizy statystyczne

liczba zwierząt lub niezależnych eksperymentów oraz zastosowana analiza statystyczna (porównania ANOVA i post-hoc) są wskazane na rysunku. Wszystkie wartości są wyrażone jako średnia ± s. e. m., z wartościami F I p wskazanymi na rysunku. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).