notatki laboratoryjne dla BIO 1003

© 30 August 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland

enzymy

białka, które działają jako katalizatory

(kliknij tutaj, aby uzyskać: materiały, motywy, zasoby internetowe)

komórki nie mają opcji ogrzewania i energicznego mieszania, aby przyspieszyć reakcje chemiczne, powodując, że atomy i cząsteczki wpadają na siebie częściej i z większą siłą. Zamiast tego wytwarzają katalizatory białkowe zwane enzymami, które zapewniają powierzchnie, na których reagenty spotykają się ze sobą we właściwej orientacji, a enzymy mogą nawet osłabiać wiązania, które mają być zerwane. Enzymy mają wysoką swoistość – tylko specyficzne reagenty zmieszczą się na ich powierzchni i zrównoważą lokalne ładunki powierzchniowe miejsca zwanego miejscem aktywnym. Szczególny zestaw reagentów dla enzymu nazywa się jego substratem(substratami). Enzymy, podobnie jak wszystkie katalizatory, nie ulegają zmianie w reakcji, którą katalizują; tak więc, gdy wszystkie reagenty zostały przekształcone w produkty, oryginalne cząsteczki enzymu pozostają.

funkcja enzymu zależy od środowiska, w którym zachodzi reakcja. Takie czynniki jak temperatura i pH mogą w znacznym stopniu wpływać na zdolność enzymu do wykonywania swojej pracy. Poniższa seria eksperymentów ilustruje Zasady reakcji katalizowanych enzymatycznie w układach biologicznych. Będziemy używać enzymu katecholazy (lub oksydazy katecholowej), który jest powszechny w roślinach; jest obecny w świeżo wyciśniętym soku ziemniaczanym, który został dostarczony. Substratami katecholazy są katechol i tlen. Substraty reagują ze sobą w miejscu aktywnym enzymu. Produkty powstałe w wyniku tej reakcji to benzochinon i woda; ponieważ benzochinon ma brązowy kolor, widać, że reakcja miała miejsce. Nazywa się to reakcją brązowienia owoców. Benzochinon hamuje wzrost mikroorganizmów i zapobiega gniciu uszkodzonych owoców. W nieuszkodzonych komórkach katecholaza jest przechowywana w pęcherzykach i nie wchodzi w interakcje z katecholem.

w obecności enzymu katacholazy:

catechol + ½O2 benzochinon + H2O

we wszystkich poniższych doświadczeniach wymieszaj składniki zgodnie ze specyfikacją i wymieszaj mieszaninę z Vortex genie lub dotykając boku rurki blisko dna; inkubuj mieszaniny w temperaturze 40 stopni C, O ile nie określono inaczej.

Jeśli wątpisz w czystość enzymu, jak możesz dowiedzieć się, czy w ekstrakcie z ziemniaków jest coś innego poza katecholazą?

I. Tworzenie i wykrywanie Benzochinonu

ten eksperyment ustanawia standardy dotyczące wyglądu, gdy reakcja miała miejsce lub nie miała miejsca. Używaj wody destylowanej, w której wskazano H2O.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (sterowanie)

Jak zdefiniować pojęcia sterowania i eksperymentu?

II. specyficzność enzymatyczna

Hydrochinon jest strukturalnie podobny do katecholu, ale nie taki sam. W tym eksperymencie zobaczymy, czy enzym może również przekształcić go w benzochinon, lub czy enzym jest po prostu zbyt specyficzny w swojej konstrukcji, aby oddziaływać z podobną, ale nie identyczną cząsteczką.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (control)

czy enxyme może przekształcić hydrochinon w benzochinon? Jak doszedłeś do tego wniosku?

Uwaga: twoja grupa zrobi albo III albo IV-nie oba.
zapytaj instruktora laboratorium, czy Twoja grupa zrobi III temperaturę, czy IV pH.

III. wpływ temperatury na aktywność enzymów

enzymy są zaprojektowane do działania w określonym zakresie temperatur. Możesz zgadywać, co do wyniku dla następujących temperatur poniżej. Należy pamiętać, że struktury, które produkują enzym to owoce i ziemniaki; w skali Celsjusza 0 stopni to zamarzanie, 22 stopnie to temperatura pokojowa, a 100 stopni to gotowanie. Im goręcej jest, tym szybciej cząsteczki wibrują i poruszają się. Zderzenia cząsteczek wody z enzymem mogą cofnąć jego złożoną strukturę, która jest utrzymywana na miejscu przez wiązania wodorowe; kiedy to się stanie, cząsteczka została skażona. Co stanie się z aktywnym miejscem w tym przypadku? W niskich temperaturach cząsteczki poruszają się bardzo wolno, a szansa ich zderzenia i reakcji ze sobą jest bardzo niska. Należy pamiętać, że ekstrakt z ziemniaków był przechowywany w lodzie. Dlaczego?

Zapisz swoją hipotezę o wpływie temperatury na aktywność enzymu:

Ustaw 6 par probówek z 10 kroplami ekstraktu z ziemniaka w jednym zestawie i 10 kroplami 1% katecholu w drugim. Inkubować je przez 5 minut, po jednej parze w każdym z 5 środowisk temperaturowych wskazanych poniżej. Następnie wymieszać ekstrakt ziemniaka i katechol razem; Zapisz początkowy kolor i umieść tę rurkę z powrotem w kontrolowanej temperaturze. Nagraj Kolor ponownie po 5 minutach.

Temperatura	początkowy kolor	zmiana koloru (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 stopni C
100 stopni C

czy wyniki potwierdzają twoją wstępną hipotezę?

które temperatury denaturują enzym tak, że nie można go odzyskać.

Co to jest biały osad, który tworzy się w temperaturze 100 stopni C?

IV. wpływ pH na aktywność enzymu

skala pH mierzy liczbę jonów wodorowych (każdy z ładunkiem +1) obecnych w roztworze. Skala w systemach biologicznych wynosi od 0 (silnie kwaśny) do 14 (silnie zasadowy). 7, punkt neutralny, to pH czystej wody. Przypomnijmy, że złożona struktura cząsteczek białka jest w dużej mierze spowodowana wiązaniem wodorowym między przeciwstawnie naładowanymi częściami łańcucha polipeptydowego. Inne jony w roztworze mogą zastąpić pasujące części łańcucha i spowodować jego cofnięcie. Kiedy tak się stanie, co stanie się z aktywnym miejscem?

napisz swoją hipotezę o wpływie zakresu pH na aktywność enzymu:

Ustaw 7 probówek z 40 kroplami innego buforowanego roztworu pH w każdej. Dodaj 10 kropli ekstraktu z ziemniaków do każdej i wymieszaj. Następnie dodaj 10 kropli 1% katecholu do każdej i wymieszaj.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

przy jakim pH lub zakresie wartości pH enzym działa najlepiej?

Dlaczego nałożenie soku z cytryny na świeżo pokrojone owoce opóźnia jego brązowienie?

V. konieczność kofaktorów dla aktywności enzymów

wiele enzymów działa tylko wtedy, gdy jest z nimi związany kofaktor. Katecholaza wymaga miedzi jako kofaktora. PTU jest substancją chemiczną, która ma większe powinowactwo do miedzi niż katecholaza i odbiera miedź enzymowi. Można obserwować, co dzieje się z funkcją enzymu po usunięciu kofaktora. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. po 5 minutach dodaj 10 kropli 1% katecholu.

która lampa, A lub B, jest kontrolowana w tym eksperymencie?