jest to pierwsza z trzyczęściowej serii na temat transformacji E. coli. Pod koniec tego powinieneś być ekspertem w zakresie transformacji E. coli i wyboru szczepów do różnych zastosowań. Jeśli jesteś już ekspertem, mam nadzieję, że będzie to dla Ciebie przyjemne odświeżenie. W obu przypadkach prosimy o komentarz poniżej, jeśli masz coś do dodania.

wykorzystując energię elektryczną do transformacji

obce DNA można wprowadzić do właściwego E. coli za pomocą elektroporacji lub transformacji chemicznej. Podczas korzystania z elektroporacji można zastosować prąd elektryczny w całej komórce. Uważa się, że prąd tworzy chwilowe „pory” w błonach komórkowych, co zmusza ujemnie naładowane DNA do komórek poprzez efekt typu elektroforezy. Aby wytworzyć elektro-kompetentną E. coli, dokładnie umyć komórki, aby usunąć wszystkie średnie sole. Zapewnia to, że ładunek nie jest prowadzony przez medium. Wykonaj również galwanizację w temperaturze 0°C, aby zminimalizować uszkodzenie ogniw cieplnych.

chemikalia: działają również

, aby komórki kompetentne chemicznie, zawiesić E. coli w roztworze CaCl2 w temperaturze 0°C. W tych warunkach uważa się, że Jon Ca2+ tworzy pory w błonie, pomaga wiązać DNA z błoną komórkową i maskuje ładunek ujemny na DNA. Razem ułatwiają one przejście DNA przez hydrofobową błonę komórkową. Wymuś DNA do komórek, stosując krótki szok cieplny 42°C, który powoduje prąd termiczny, który zmiecie DNA do komórek.

plusy i minusy każdej

elektroporacja jest mniej uciążliwa niż transformacja chemiczna i ogólnie daje wyższą wydajność transformacji (mierzoną w koloniach utworzonych na mikrogram DNA). Jest jednak droższy. Wymaga specjalistycznego urządzenia do dostarczania ładunku i kuwet do przenoszenia ładunku do zawiesiny komórki. Elektroporacja jest wrażliwa na sól – możesz stracić cenne Próbki, jeśli nadmiar soli zostanie przeniesiony do kuwety.

osobiście wolę transformację chemiczną. Chociaż trwa to około pół godziny dłużej, uważam, że wyniki są bardziej przewidywalne i podoba mi się fakt, że większa objętość DNA może być dodana, jeśli stężenie jest zbyt niskie. Nie można zwiększyć objętości DNA za pomocą elektroporacji ze względu na ryzyko dodania zbyt dużej ilości soli do roztworu. Chociaż powszechnie wymienianą wadą transformacji chemicznej jest jej niższa wydajność, można teraz kupić ultra-kompetentne komórki, takie jak XL10-gold Stratagene, więc nie jest to już tak duży problem.

artykuły z tej serii:

• elektroporacja E. coli a transformacja chemiczna (ten artykuł)
• kompetentna E. coli: kupić czy nie kupić?
• wybór właściwego szczepu E. coli

Data aktualizacji: 11 lipca 2016 r.