autor: Paul Barber
DNA Extraction via Chelex
Chelex jest znany jako kapryśny, ponieważ jest tani i łatwy. Oto kilka wskazówek dotyczących dobrych wzmocnień: 1. Czasami próbkipracuj najlepiej, jeśli używasz ich natychmiast, czasami lepiej jest poczekać na noc przed ich użyciem. Eksperymentuj i znajdź to, co działa na twój gatunek. Wyniki mogą się różnić w zależności od taksonów.2. Podczas wykonywania początkowych PCRs, wykonaj seryjne rozcieńczenie szablonu.Ilość Chelex DNA ekstrakcji stosowanej w PCR może być tak wysoka, jak połowa objętości PCR lub tak niska, jak 1 mikrolitr rozcieńczenia 1:10 000. Uważam, że 1 mikrolitr 1: 1 jest dobry dla większości zastosowań.3. Jeśli nie uzyskasz amplifikacji z PCR za pierwszym razem z ekstraktem Chelex, powtórz procedurę Vortex, spin, incubate, vortex, spin, usiądź na noc opisaną powyżej. Często spowoduje to ujemny PCR pracy.
metoda
- z wybielaczem, sterylizuj suchą szpatułkę odczynnika i mały mieszadło magnetyczne.
- przygotowanie zawiesiny 5-10% wagowych żywicy Chelex100 (część Biorad 143- 3832,100-200 Mesh Chelex, forma sodowa) i sterylizowana UV Woda HPLC. Najskuteczniejszym sposobem jest wzięcie sterylnej tubki falcon o pojemności 50 ml, umieszczenie na skali wewnątrz małej zlewki i zerowanie skali. Następnie dodaj 5 gramów Chelex i wypełnij do 50 ml mark wodą.
precyzja nie jest krytyczna. Sterylna technika jest.
- umieścić sterylny mieszadło w tubie i umieścić na mieszadle magnetycznym. Chelex szybko osiada, więc jeśli zawiesina nie jest dobrze wymieszana, Twoje stężenia i wyniki będą zmienne. Utrzymując zawiesinę dobrze wymieszaną, podziel 300-500micro litrów na 0,6 lub 1,6 ml probówki eppendorfa (ponownie sterylne) i natychmiast nakrętkę. Jeśli masz dostęp do okapu laminarnego, jest to dobre miejsce do zrobienia tego wszystkiego. Przed użyciem należy wytrzeć skalę i mieszadło 10% roztworem wybielacza i/lub sterylizować UV.
- Włącz blok grzewczy. Ustaw na 95°C. wypełnij otwory wodą.
- używając sterylnych kleszczy (kilka razy Płomień nad palnikiem alkoholowym w celu sterylizacji), Usuń mały kawałek tkanki z próbki. Ten kawałek tkanki powinien być wystarczająco duży, aby był widoczny, ale nie tak duży, aby był łatwo widoczny. Wyobraź sobie cięcie sekcji 0,2 mm standardowego zszywka. To jest bardzo duże. Zbyt duża ilość tkanki może hamować reakcje.
sterylizuj kleszcze między próbkami.
- po zakończeniu wykonaj negatywną kontrolę Chelex, zanurzając sterylizowane kleszcze w rurce zawiesiny Chelex.
- próbka Vortex i zawiesina chelex przez 10-15 sekund.
upewnij się, że pokrywki są mocno zatrzaskane przed rozpoczęciem.
- Spin próbki krótko z dużą prędkością w mikrocentryfuge
- inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 95°C
*temperatura bloku może nieznacznie spaść podczas wykonywania tego kroku. Ten spadek jest normalny. Sprawdź probówki podczas inkubacji, aby upewnić się, że pokrywki nie pękły.*
- próbki Vortex ponownie przez 10-15 sekund.
Becareful as steam may pop lid off of centrifuge tube. Przytrzymaj pokrywki.
- ponownie Zakręć rurki z dużą prędkością w mikrokrążeniu.
- próbki są gotowe do użycia.
używaj tylko supernatu do reakcji PCR. Koralik Chlex dezaktywuje Taq!
ta metoda jest oparta, za pozwoleniem, na oryginalnym protokole dostępnym tutaj.
