II Effect of Hyperthermia Alone in Vitro
w 1967 roku Harris zastosował test klonowania jednokomórkowego w celu uzyskania krzywych przeżycia termicznego pseudodiploidalnych komórek nerki świni. Krzywe składały się z początkowego ramienia, po którym następował wykładniczy spadek ocalałej frakcji i dlatego były podobne do krzywych uzyskanych w wyniku radiacyjnego zabijania komórek w hodowli (Puck And Marcus, 1955). Westra i Dewey (1971) oraz Palzer i Heidelberger (1973a) również wykazali to zjawisko. Nie oznacza to jednak podobieństwa śmiercionośnego mechanizmu obu modalności.
Wykres Arrheniusa odwrotności wskaźnika inaktywacji wyrażonej jako funkcja odwrotności temperatury bezwzględnej zarówno dla komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), jak i komórek nerki świni ujawnił energię aktywacji 141 kcal / mol dla obu typów w zakresie temperatur od 43,5° do 46,5°c (Westra i Dewey, 1971). Wielkość energii aktywacji jest podobna do tej zgłaszanej dla kilku enzymów i białek (Johnson et al., 1954) i jest znacznie większa niż energia aktywacji zgłoszona dla DNA (Eigner et al., 1961; Greer and Zambehof, 1962) sugerując, że denaturacja białek może być śmiertelną zmianą cieplną. Jednak Entropia aktywacji dla dwóch linii komórkowych była inna.
aktualna wiedza i zrozumienie celów i mechanizmów zabijania ciepła są ograniczone. Chociaż opisano szereg indukowanych przez ciepło zmian struktury komórkowej i metabolizmu, żadna z nich nie była związana wyłącznie ze śmiercią komórki. Nie znaleziono środków, aby ogrzewać selektywnie subkomórkowe organelle, aby uzyskać wgląd w krytyczny cel lub cele ciepła. Niemniej jednak zaproponowano kilka możliwości.
wielu badaczy stwierdziło, że szok cieplny zmniejsza zdolność komórek do włączenia tymidyny do DNA (Mondovi et al., 1970; Reeves, 1971; Plagemann i Erbe, 1972). Hamowanie wbudowywania tymidyny może być spowodowane uszkodzeniem mechanizmu transportu tymidyny, który uważa się za kontrolujący wbudowywanie DNA (Plagemann i Erbe, 1972). Wykazano jednak, że oznaczona Pula prekursorów nie zmniejszyła się wystarczająco, aby uwzględnić duży spadek wbudowywania tymidyny w komórkach nerek świń (Plagemann i Erbe, 1972).
(1971) odkrył, że ciepło indukuje aberracje chromosomalne w synchronicznych komórkach CHO. Częstość aberracji była zbyt niska, aby mogła odpowiadać za uśmiercenie komórek w komórkach M I G1 (mniej niż jedna aberracja na komórkę, gdy przeżywalność została zmniejszona do 37%), ale mogła odpowiadać za uśmiercenie komórek w fazie S. Ponadto ciepło i tymidynowa bromodeoksyurydyna (BUdR), działając razem, zabijały komórki addytywnie, co sugeruje, że te same struktury zostały uszkodzone przez oba czynniki. Następnie postawiono hipotezę, że zarówno heat, jak i BUdR powodują uszkodzenia w DNA, ale że heat powoduje uszkodzenia w białku chromosomowym, prawdopodobnie naprawiają enzymy, a BUdR powoduje uszkodzenia w DNA. Następnie, uszkodzenie w chromosomalnym proteinie może wchodzić w interakcję z BUdR uszkodzeniem w DNA lub może prowadzić do hamowania w naprawie uszkodzeń DNA. Hipotezę tę potwierdza podobieństwo energii aktywacji do zabijania ciepła (141 kcal / mol) i inaktywacji białek (Westra i Dewey, 1971). Pośredniczące w białkach uszkodzenia DNA występujące podczas G1 najwyraźniej nie przejawiały się jako aberracje chromosomowe, prawdopodobnie z powodu bardziej ustabilizowanego związku między tymi składnikami chromatyny podczas G1. Uważano, że mechanizmem zabijania komórek mitotycznych jest zniszczenie wrzeciona, co spowodowało wysoką częstotliwość występowania komórek tetraploidalnych obserwowaną w tych eksperymentach.
czułość cieplna różni się znacznie między liniami komórkowymi. Komórki gruczołu krokowego myszy nie były zabijane do 5 godzin w temperaturze 43°C, podczas gdy przeżywalność komórek gruczołu krokowego przekształconych węglowodorem wynosiła 0,37 po 2 i pół godziny obróbki cieplnej (Chen i Heidelberger, 1969). Wykazano, że liczba minut ciepła potrzebna do zmniejszenia przeżycia komórek białaczkowych l1210 i komórek HeLa do 37% na wykładniczej części krzywej przeżycia (D0) wynosi odpowiednio 12 minut i 30 minut w temperaturze 43°C (Palzer i Heidelberger, 1973a). Ponadto wskaźnik inaktywacji termicznej komórek CHO (Westra i Dewey, 1971) był dziesięciokrotnie większy niż wskaźnik inaktywacji komórek nerek świń (Harris, 1967).
ilość opóźnienia podziału po nagrzaniu (Westra i Dewey, 1971; Palzer i Heidelberger, 1973b) została uznana za znacznie dłuższą niż opóźnienie wytwarzane przez dawkę promieniowania, która zmniejsza przeżywalność o podobną ilość (Westra i Dewey, 1971). Sugeruje to, że albo zmiany odpowiedzialne za opóźnienie podziału lub zmiany odpowiedzialne za śmiertelność są różne dla dwóch trybów.
określając zmniejszenie przeżycia spowodowane stałą dawką ciepła na zsynchronizowanych komórkach, wykazano dla komórek CHO (Dewey et al., 1971; Westra i Dewey, 1971), drożdże (Schenberg-Frascino i Moustracchi, 1972), komórki HeLa (Palzer i Heidelberger, 1973b) i komórki merystematyczne (de la Torre et al., 1971), że komórki s-fazowe (de la Torre et al., 1971; Dewey et al., 1971; Westra i Dewey, 1971; Schenberg-Frascino i Moustacchi, 1972; Palzer i Heidelberger, 1973b) i komórki fazy M (Westra i Dewey, 1971) były najbardziej wrażliwe w stosunku do komórek w innych fazach cyklu komórkowego. To odkrycie jest w bezpośrednim kontraście do badań napromieniowania, gdzie zarówno in vitro (Sinclair, 1968; Dewey et al., 1970) i in vivo (Gillette et al., 1970; Dawson et al., 1973), Faza S jest najbardziej promieniotwórczą fazą. Ze względu na specyficzność cyklu komórkowego śmiertelności cieplnej sugerowano indukcję częściowej synchronizacji po powtarzanych zabiegach cieplnych(de la Torre et al., 1971) i Obserwowani (Martin i Scloerb, 1964).
kilku badaczy donosiło, że komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na ciepło niż normalne komórki (Mondovi et al., 1969; Levine and Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle and Dickson, 1971). Może to wynikać z niedoborów żywieniowych lub innych czynników, które mogą uczynić tkankę złośliwą bardziej wrażliwą na ciepło. Istnieją jednak wyjątki (Chen i Heidelberger, 1969; Kachani i Sabin, 1969), a w większości przypadków zmieniona morfologia lub metabolizm są utożsamiane z zabijaniem komórek. Dlatego w danych sugerujących selektywną wrażliwość cieplną komórek nowotworowych (Mondovi et al., 1969, 1970; Levine and Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle and Dickson, 1971; Overgaard and Overgaard, 1972a; Kim et al., 1974), nie udowodniono, że dla kryterium śmierci reprodukcyjnej komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na ciepło niż normalne komórki, z których powstał guz.
frakcjonowane zastosowanie ciepła zostało zbadane tylko krótko. Palzer i Heidelberger (1973a) badali odzyskiwanie asynchronicznych komórek HeLa między podzielonymi dawkami ciepła. Ich dane wskazują, że komórki były zdolne do naprawy uszkodzeń cieplnych w 6 godzin. Również fluktuacja w przetrwałej frakcji sugerowała częściową synchronizację populacji asynchronicznej w wyniku pierwszej dawki. Nastąpił spadek przeżywalności po początkowym wzroście z powodu naprawy uszkodzeń cieplnych subletalnych. Zmniejszenie przeżywalności interpretowano jako wynik redystrybucji komórek w bardziej wrażliwą fazę cyklu komórkowego z powodu częściowej synchronizacji wywołanej pierwszą dawką śmiertelnego środka.
Gerweck i in. (1974) badał zdolność ciepła do zabijania komórek niedotlenienia in vitro. Hipoksja była wytwarzana w komórkach CHO techniką szybkiego gazowania. Krzywe przeżycia promieniotwórczego zarówno dla tlenowych, jak i niedotlennych komórek CHO wykazały współczynnik wzmocnienia tlenu (Oer) wynoszący 2,5, co wskazuje na osiągnięcie hipoksji radiobiologicznej. Ogrzewanie odbywało się przez zanurzenie w wodzie o temperaturze 45,5°c dla zmiennych przedziałów czasowych. Następnie skonstruowano krzywe przeżycia cieplnego komórek tlenowych i niedotlennych, które wykazały, że komórki niedotlenne były co najmniej tak samo wrażliwe na ciepło i być może nieco bardziej wrażliwe na ciepło niż komórki tlenowe. D0 dla komórek niedotlenienia wynosił 1,2 min, a dla komórek tlenowych 1,8 min.
Schulman i Hall (1974) odkryli, że niedotlenione komórki chomika chińskiego V79 są bardziej wrażliwe na ciepło niż tlenowe komórki V79. Czterdzieści trzy stopnie Celsjusza były niezbędne do wywołania uszkodzeń w komórkach tlenowych, podczas gdy 41°C powodowało uszkodzenia w komórkach niedotlenienia.
podsumowując, zabijanie cieplne komórek ssaków w hodowli ma następujące cechy: w danej temperaturze Wykres logarytmu przetrwałej frakcji jako funkcji czasu leczenia jest zwykle wykładniczy poprzedzony początkowym ramieniem, co wskazuje, że komórki mają zdolność do gromadzenia subletalnych uszkodzeń cieplnych, a następnie są zabijane wykładniczo wraz ze wzrostem czasu leczenia. Badania z zastosowaniem podzielonej dawki wskazują, że komórki mają również zdolność do naprawy tego subletalnego uszkodzenia cieplnego. Wśród różnych linii komórkowych występują znaczne różnice w wrażliwości na ciepło. Wrażliwość na wiek komórki występuje, gdy komórki fazy S I Fazy M są najbardziej wrażliwe na ciepło. Cel uszkodzony przez ciepło nie jest znany, ale interakcja białko-DNA jest co najmniej prawdopodobną możliwością. Komórki niedotlenione wydają się być bardziej wrażliwe na ciepło niż komórki natlenione.
