wyniki

charakterystyka dendrytycznych komórek Plazmacytoidowych jelita cienkiego .

zastosowaliśmy standardowe procedury izolowania komórek odpornościowych znajdujących się w nabłonku (intraepithelial, IE) i LP z jelita. W obu preparatach komórkowych znaleźliśmy odrębną populację komórek CD11c + B220 + Ly6C+, które stanowiły do 1% wszystkich komórek. W przeciwieństwie do pDC, mieloidalne (M) DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) były obecne tylko w bardzo małych ilościach w preparacie IE (Fig. 1 A). Zarówno pDC preparatu LP, jak i IE wykazały niski poziom ekspresji powierzchniowej MHC klasy II (Fig. 1 A). Dalsza analiza wykazała, że komórki CD11c+B220+Ly6C+ obu preparatów równomiernie wyrażają markery pDC PDCA1, jak również 120G8 (Fig. 1 B). Cytospiny z posortowanego pDC (CD11c+B220 + Ly6C+) i mieloidalnego DC (mDC) preparatu IE wykazały okrągłą i gładką, podobną do komórek plazmatycznych morfologię pDC, podczas gdy mDC wykazały charakterystyczne dendryty (Fig. 1 C). W celu dalszego scharakteryzowania lokalizacji pDC w jelicie zastosowaliśmy anty-B220, anty-120G8 i anty-CD3 mAb w immunohistologii. Mikrografy zostały losowo pobrane z sekcji i, jak pokazano na Fig. 1 D, pozycjonowanie komórek 120g8+B220 + CD3 określono w stosunku do komórek nabłonkowych za pomocą analizy obrazu (analiza; Olympus, Hamburg, Niemcy). Oceniając położenie ≈150 pDC zaobserwowaliśmy, że 4,9% tych komórek było wyraźnie zlokalizowane w warstwie komórek nabłonkowych, podczas gdy kolejne 6,7% znajdowało się w odległości 5-10 µm od wierzchołka komórek nabłonkowych (Fig. 1 D). Dane te wykazują, że pewna ilość pDC znajduje się wewnątrz lub blisko nabłonka jelita, podczas gdy >80% analizowanych komórek było usytuowanych w odległościach >15 µm, co czyni je komórkami LP (Fig. 1 D). Ponieważ podobne liczby pDC były obecne w preparacie IE i LP po standardowych procedurach izolacji, obecnie nie jest jasne, czy pDC z LP zanieczyszcza preparat IE, czy też pDC lokalizujące się w nabłonku są skuteczniej izolowane. Ponieważ prawie nie znajdujemy żadnego mDC w przygotowaniu IE, faworyzujemy tę ostatnią możliwość. Pozostaje jednak ustalić, czy obie populacje pełnią różne funkcje, czy też należą do wspólnej populacji komórek. Ponieważ pDC preparatu IE, w przeciwieństwie do pDC preparatu LP, można wyizolować za pomocą raczej delikatnych procedur, wyłącznie pDC preparatu IE wykorzystano do testów funkcjonalnych w tym badaniu.

ekspresja CCR9 na jelitowym pDC.

aby zidentyfikować mechanizmy molekularne, które umożliwiają migrację pDC do jelita, przeanalizowaliśmy ekspresję cząsteczek naprowadzających. Chociaż ustalono, że integryna AE (CD103) pośredniczy w adhezji limfocytów do komórek nabłonkowych w jelicie, nie udało nam się zidentyfikować ekspresji tej integryny na jelitowym pDC. Podobnie CCR7 (rys. 1 E), zasadniczo zaangażowany w przenoszenie limfocytów do obwodowych narządów limfatycznych nie jest wyrażany przez pDC jelita. W przeciwieństwie do tego, zaobserwowaliśmy wysokie poziomy CD18 (β2-integryny)i pośrednie poziomy α4β7, podczas gdy ≈50% pDC express ligands P-selektyny (Fig . 1 E). Co ciekawe, zdecydowana większość jelitowego pDC wyrażała wysokie ilości receptora chemokin CCR9 (Fig. 1 E), podczas gdy mDC LP wyrażało no lub niskie poziomy CCR9 .

ekspresja CCR9 pDC wyizolowanego z różnych narządów limfatycznych.

biorąc pod uwagę równomierną ekspresję CCR9 na pDC jelitowym, analizowaliśmy ekspresję CCR9 na pDC wyizolowanym z drugorzędowych narządów limfatycznych, w tym śledziony, drenującego skórę LN, krezkowego LN i plastrów Peyera (PP; Fig. 2 A) i zastosowano CD4 + CD8 + tymocyty, o których wiadomo, że wyrażają wysokie poziomy CCR9, jako kontrolę pozytywną (11); Fig. 2 B). Co ciekawe, tylko ułamek pDC obecny w każdym z tych narządów wyrażony CCR9 (Fig. 2 A), podczas gdy ≈95% pDC wyizolowane z BM nosiło ten receptor (Fig. 2 C). Większość BM pDC również wyraża CCR5 i CXCR3, podczas gdy CCR2 jest obecny tylko w około 25% komórek. CXCR4, znany z zatrzymywania komórek do BM, jest tylko bardzo słabo wyrażony (Fig. 2 C). Łącznie dane te pokazują, że pDC są wyposażone w różne receptory chemokin przed uwolnieniem z BM. Ta cecha prawdopodobnie pozwala na kierowanie nie tylko do miejsc stanu zapalnego, ale także do niezapalnego jelita.

Analiza chemotaksji pDC rozszerzonego Flt3L.

opierając się na silnej ekspresji CCR9 na BM i jelitowym pDC, porównaliśmy zdolność migracji pDC i mDC do chemokiny CCL25/TECK, która jest jedynym znanym ligandem dla tego receptora (12). Częstość występowania pDC różni się w zależności od szczepów myszy i dobrze wiadomo, że na przykład myszy C57BL/6 (B6) posiadają znacznie mniej pDC niż myszy 129sv (13). Jednakże, niezależnie od tła genetycznego, liczba pDC, które można wyizolować z tkanek myszy, jest niewystarczająca do przeprowadzenia standardowych testów chemotaksji in vitro. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, rozszerzyliśmy populację DC in vivo poprzez wszczepienie linii komórek nowotworowych wydzielających Flt3-L (B16-FL) u myszy B6 na 14 dni (14).

w tym okresie odsetek komórek CD11c+ obecnych w śledzionie wzrósł z 3% do 30-35% (dane nie pokazane). Osiemdziesiąt procent ekspandowanego pDC in vivo wyrażonego CCR9, z poziomami bardzo podobnymi do tych obecnych na pDC BM (Fig. 2 C i Rys. 4 C) podczas gdy in vivo ekspandowany mDC wyrażał tylko niewielkie ilości tego receptora (si Fig. 6b). Śledzionę pDC wzbogacono sortowaniem CD11C + MACS, co dało Czystość 95% dla komórek CD11c+, które zawierały ≈15% Ly6C+B220+ pDC. In vitro testy migracji transwella wykazały silną chemotaktyczną odpowiedź pDC na CCL25, jak również na cxcl9, ligand dla cxcr3 i cxcl12, który jest ligandem dla CXCR4. Zaobserwowano tylko słabą odpowiedź w kierunku CCL19, który służy jako ligand dla CCR7. mDC wykazały niewielką odpowiedź chemotaktyczną w kierunku CCL25 i CXCL9 i umiarkowaną odpowiedź w kierunku CXCL12 i CCL19 (Fig. 3 A).

zmniejszona liczba pDC w jelicie cienkim myszy z niedoborem CCR9.

na podstawie tych obserwacji scharakteryzowaliśmy dystrybucję pDC u myszy z niedoborem CCR9. Znaleźliśmy podobne procenty pDC w płucach i wątrobie (si Fig. 7), jak również w pachwinowych i krezkowych węzłach chłonnych, podczas gdy liczba śledziony pDC była nieznacznie zwiększona u myszy CCR9 -/ -. W przeciwieństwie do tego, zaobserwowaliśmy>90% zmniejszenie jelita i 50% zmniejszenie PP pDC (rys. 3 B).

pDC preferencyjnie migrować do jelita cienkiego.

opierając się na dotychczasowych ustaleniach, wydaje się prawdopodobne, że pDC wymaga CCR9 do naprowadzania do jelita cienkiego. Aby udowodnić tę hipotezę, adopcyjnie przenosiliśmy komórki od dawców B6 i CCR9−/−, które nosiły guz wydzielający Flt3-L przez 14 dni. Pod wpływem flt3l pDC rozszerzył się w podobnym stopniu u myszy B6 i CCR9−/− (rys. 4 A I SI rys. 8) i były nie do odróżnienia w odniesieniu do ekspresji CCR2, CCR5 i CXCR3, podczas gdy CCR9 wykryto tylko na pDC pochodzącym z B6, ale nie na dawcach z niedoborem CCR9 (Fig. 4 C). Bez dalszego oczyszczania splenocyty tych dawców znakowano odpowiednio estrem N-sukcynimidylowym dioctanu 5 (6)-karboksyfluoresceiny(CFSE) i estrem N-sukcynimidylowym 5 (6) – karboksytetrametylorhodaminy (Tamra). Mieszaninę komórek z niedoborem WT i CCR9, dostosowaną do równej liczby pDC, przeniesiono dożylnie u biorców B6. Po 18 h transferu najpierw przeanalizowaliśmy skład adoptywnie przeniesionych komórek WT obecnych w IE oraz preparat LP i zauważyliśmy, że 54% i 25% wszystkich komórek odzyskanych odpowiednio z frakcji IE i LP było pDC (Fig. 4 B). Wyniki te pokazują, że wśród różnych populacji komórek przenoszone pDC domu najskuteczniej do jelita. Te konkurencyjne transfery wykazały również, że pDC z niedoborem CCR9 są w dużej mierze upośledzone w ich zdolności do domu w jelicie, co odzwierciedla niski współczynnik migracji PDC z niedoborem CCR9 w porównaniu z wt znaleziony w preparacie IE i LP (Fig. 4 D). Natomiast pDC z niedoborem CCR9 i B6 migrowały z podobną wydajnością do obwodowych i krezkowych węzłów chłonnych (Fig. 4 D). Charakter znakowania komórek nie miał wpływu na te eksperymenty, ponieważ wymiana barwników między komórkami B6 i CCR9−/− dała identyczne wyniki (DANE nie pokazano). Chociaż dane te wyraźnie pokazują, że pDC wymaga CCR9 do skutecznego naprowadzania do jelit, należy wspomnieć, że właściwości handlujące pDC z myszy leczonych FLT3-ligandem mogą się różnić od tych obecnych w sytuacjach fizjologicznych.

pDC są rekrutowane do zapalenia jelita.

ponieważ wiadomo, że pDC odgrywa ważną rolę w odporności przeciwwirusowej (4, 10), spekulowaliśmy, że pDC może być rekrutowany do jelita podczas procesów zapalnych w celu wzmocnienia obrony pierwszej linii. Wiadomo, że toksyna cholery (ct) po podaniu doustnym wywołuje zapalenie jelit i donoszono, że w ciągu 2 godzin po podaniu doustnym liczba przejściowo rekrutowanych mDC do jelita wzrasta 4-krotnie (15). Zaobserwowaliśmy, że oprócz mDC, liczba pDC wzrosła również 3-krotnie podczas karmienia myszy B6 10 µg CT (Fig . 4 E). Co ciekawe, identyczna konfiguracja eksperymentalna nigdy nie powodowała wzrostu pDC ani w IE, ani w preparacie LP myszy z niedoborem CCR9 po 1, 2 lub 3 godzinach leczenia CT(Fig . 4 E i nie pokazano danych). Szczególne zapotrzebowanie na CCR9 w pDC dla ich rekrutacji do jelita podczas procesów zapalnych zostało potwierdzone przez adopcyjne przeniesienie pDC z niedoborem WT i CCR9 do biorców z niedoborem CCR9, a następnie zastosowanie CT, jak opisano powyżej. Podczas gdy adoptywnie przeniesione pDC wt były wystarczająco obecne w preparacie IE i LP, pDC z niedoborem CCR9 zostały prawie całkowicie wyłączone z tych przedziałów (Fig. 4 F). Łącznie wyniki te pokazują, że podczas zdarzeń zapalnych pDC można zwerbować do błony śluzowej jelit i że mechanizm ten w dużym stopniu opiera się na CCR9.

rola jelitowego pDC w szybkiej mobilizacji LP Mieloidalnego DC.

wykazano ostatnio, że doustne zastosowanie resiquimodu ligandu TLR7 / 8 (R848) powoduje szybką mobilizację LP DC i że TNFa, prawdopodobnie uwalniany przez pDC, jest zaangażowany w ten proces (16). Spekulowaliśmy więc, że jelitowe pDC może być źródłem TNFa, które potencjalnie uruchamia mobilizację sąsiedniego mDC. Aby przetestować tę hipotezę, in vitro stymulowaliśmy B6 pDC preparatu IE i LP przez 16 godzin za pomocą R848. Rzeczywiście, pDC wydzielało znaczne ilości TNFa, ale nie dało żadnych wykrywalnych ilości IL-2, IL-4, IL-5 lub IFNy (Fig. 5 A). Następnie przeanalizowaliśmy mobilizację LP mDC in vivo po doustnym podaniu R848. Podczas gdy nieleczone myszy B6 i CCR9−/− nie różniły się obecnością jelitowego mDC (Fig. 5 B), w ciągu 2 godzin doustny R848 wywołał mobilizację ≈60% mDC w WT, ale tylko 10,8% u myszy CCR9 -/ -. Co ważne, gdy myszy z niedoborem CCR9 IV. otrzymały śledziony pDC dawców WT leczonych Flt3L 16 godzin przed doustnym zastosowaniem R848, niedobór mobilizacji MDC w jelitach można było całkowicie uratować (Fig. 5 C). Doświadczenia te pokazują, że zależne od CCR9 naprowadzanie pDC do jelita jest zaangażowane w szybką mobilizację jelitowego mDC po doustnym zastosowaniu ligandu TLR7 / 8. Ponieważ inni w modelu szczura wykazali, że zastosowanie LPS powoduje również mobilizację LP mDC (17), zastosowaliśmy 50 µg LPS i.p. dla zwierząt z niedoborem WT i CCR9. Co ciekawe, w tych warunkach eksperymentalnych nie udało się zaobserwować żadnej różnicy między zwierzętami z niedoborem WT i CCR9 w odniesieniu do mobilizacji LP mDC (si Fig. 9).