dyskusja

niniejsze badanie odkryło rolę białka wiążącego SR luminal Ca, CSQ2 w regulacji sprzężenia pobudzająco-skurczowego i cykli w sercu. W szczególności, pokazujemy, że mediowana przez Ad nadekspresja CSQ2 dramatycznie zwiększyła wielkość zarówno uśrednionych przez komórki stanów przejściowych ca wywołanych ICa, jak i spontanicznych iskier Ca w izolowanych komórkach serca. Analiza fazy wzrostu i szybkości zmian tych sygnałów Ca wykazała, że ich zwiększony rozmiar był spowodowany spowolnionym zakończeniem podstawowych strumieni uwalniających Ca z SR. oprócz wydłużania aktywnego uwalniania Ca, dynamika funkcjonalnego ładowania magazynów SR Ca była również spowolniona w komórkach z podwyższonym poziomem białka CSQ2, na co wskazuje spowolniony czas odzyskiwania powtarzających się iskier Ca. Zasadniczo otrzymaliśmy przeciwne wyniki w miocytach, w których poziomy CSQ2 zostały zmniejszone przez transdukcję antysensowną za pośrednictwem Ad. Miocyty te wykazywały krótsze uwalnianie Ca, ale przyspieszały restytucję miejsc uwalniania Ca. Ponadto, w okresowo stymulowanych miocytach o obniżonym poziomie CSQ2, zastosowanie izoproterenolu powodowało arytmogenne oscylacje wewnątrzkomórkowe . Wyniki te pokazują, że CSQ2 jest kluczowym wyznacznikiem funkcji uwalniania SR Ca, która działa poprzez regulację czasu trwania uwalniania Ca i refrakcyjności miejsca uwalniania. W świetle obserwowanych zaburzeń zależnych od izoproterenolu w rytmicznym cyklu Ca w miocytach z niedekspresją CSQ2, nasze wyniki są istotne dla zrozumienia mechanizmów komórkowych arytmii indukowanych katecholaminą związanych z mutacjami genu CSQ2.

molekularne mechanizmy działania CSQ2. Obserwowany wpływ CSQ2 na uwalnianie SR Ca przypisujemy zdolności tego białka do działania jako bufor molekularny, który kontroluje wolny w przestrzeni luminalnej SR (patrz proponowany schemat na Fig. 5). Z badań dwuwarstwowych lipidów wiadomo, że Wiązanie Ca z aspektem luminalnym kompleksu RyR (tj. czujnikiem Luminalnym Ca) zwiększa aktywność kanału, podczas gdy przy obniżonym luminalu aktywność kanału jest zmniejszona (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Ponieważ wiele RYR byłoby w stanie aktywowanym przy normalnym spoczynkowym poziomie luminalu Ca (≈1 mM), obniżenie luminalu podczas procesu uwalniania zmniejszyłoby zatem ogólną aktywność kanału (proces określany jako dezaktywacja zależna od luminalu Ca; ref. 3). Nasze wyniki sugerują, że stabilizując lokalny wolny luminal w pobliżu RyRs podczas procesu uwalniania, CSQ2 spowalnia zależne od luminalu zamknięcie kanału RyR, zwiększając w ten sposób ilość Ca uwalnianego z SR do cytozolu. CSQ2 kontroluje również dynamikę odzyskiwania wolnego wewnątrz-SR podczas ponownego wychwytu Ca, służąc jako pochłaniacz dla Ca w świetle SR. Tak więc CSQ2 nie tylko nasila wypływ SR Ca, ale także stabilizuje cykl poprzez modulowanie restytucji funkcjonalnej lub gotowości miejsc uwalniania Ca po każdym uwolnieniu. Niedawno powołaliśmy się na podobny mechanizm wyjaśniający wpływ chelatorów Ca o niskim powinowactwie (soli organicznych) załadowanych do SR na uwalnianie Ca (3). Znaczenie naszych obecnych ustaleń jest to, że pokazują one, w jaki sposób proces uwalniania jest kontrolowany przez endogenne, rezydujące w SR białko wiążące Ca, CSQ2. Ujawniają również patologiczne konsekwencje zmniejszenia ilości CSQ2 w komórkach serca.

zaproponowano, że CSQ2 może wpływać na funkcję kanału uwalniania Ca poprzez bezpośrednie interakcje z białkami zawierającymi kompleks kanału uwalniania Ca (tj. RyR, junctin i / lub triadin) (ref. 13; w celu zapoznania się z ref. 9). Nasze badania nie wykazały znaczących różnic w parametrach uwalniania SR Ca między komórkami zawierającymi około 3-krotnie podwyższony poziom białka CSQ2 a komórkami, w których bufory organiczne zostały załadowane do SR (3). Tak więc, najprostszym wyjaśnieniem dla naszych ustaleń jest to, że dominujący wpływ CSQ2 na uwalnianie SR Ca wynika z buforujących działań tego białka wewnątrz SR. Wyjaśnienie szczegółowego mechanizmu, za pomocą którego CSQ2 i powiązane białka, takie jak junctin i triadin, regulują uwalnianie Ca, musi poczekać na badania obejmujące manipulację poziomami i ekspresją zmutowanych form tych białek o zmienionych zdolnościach do interakcji między sobą a RyR.

maksymalna szybkość uwalniania Ca ze stymulowanych miocytów była podobna niezależnie od ilości CSQ2 wyrażonej w SR (Fig. 2B i 3D). Wyniki te wspierają tezę, że CSQ2 kontroluje zakończenie procesu uwalniania, ale wyniki te nie są tym, co trzeba by przewidzieć w oparciu o oczekiwane efekty buforowania tego białka w SR. rzeczywiście, oczekuje się, że maksymalna szybkość uwalniania będzie wyższa w komórkach o zwiększonej sile buforowania Luminalnego Ca spowodowanej spowolnionym spadkiem wolnego wewnątrz SR, ponieważ w tych komórkach oczekuje się, że opóźniony spadek gradientu Ca w całej błonie SR spowoduje większe natężenie strumienia Ca. Kilka możliwych powodów wyjaśnia, dlaczego tego nie zaobserwowano. Jedną z możliwości jest to, że początkowy wolny intra-SR może być niższy w komórkach csq2-nadekspresja niż w komórkach CSQ2-niedekspresja. Chociaż w stanie stacjonarnym liczba miejsc wiążących Ca nie powinna wpływać na wolny stan w zamkniętym przedziale, takim jak SR, nie powinna wpływać na kinetykę, przy której osiąga się stan stacjonarny wewnątrz SR, możliwe jest, że prawdziwy stan stacjonarny nie został osiągnięty w naszych doświadczeniach (tj. miocyty poddawane niskiej szybkości stymulacji). Inną możliwością jest to, że obecność podwyższonych poziomów białka CSQ2 spowalnia dyfuzję Ca w przestrzeni luminalnej, spowalniając tym samym exodus Ca przez otwarte kanały. Wyraźnie potrzeba więcej badań, zarówno eksperymentalnych, jak i teoretycznych, aby rozwiązać ten problem.

Jak CICR, proces z wrodzoną skłonnością do samo-regeneracji, jest przedmiotem intensywnych badań, najpierw przy użyciu pomiarów globalnych ca transjentów, a ostatnio, badając iskry Ca (3, 27-30). Jedną z rozważanych możliwości jest to, że kanały RyR ulegają zależnej od Ca inaktywacji lub adaptacji w wyniku wzrostu po cytozolicznej stronie kanału (27-29). Inną możliwością jest to, że spadek intra-SR zapewnia aktywny sygnał do zamknięcia RYR po ich otwarciu (3, 30-32). Niedawno znaleźliśmy bezpośrednie eksperymentalne dowody na rolę zmian indukowanych przez luminal Ca w aktywności RyR (tj. dezaktywacji zależnej od luminal ca) w zakończeniu uwalniania SR Ca poprzez zaciskanie poziomów wewnątrz SR buforami Ca o niskim powinowactwie załadowanymi do cystern SR (3). Korzystając z tych buforów, znacznie wydłużyliśmy czas aktywnego uwalniania Ca leżącego u podstaw ogniskowych i globalnych przemian Ca w miocytach. Zgodnie z tymi ustaleniami, nasze obecne wyniki pokazują, że zwiększenie poziomu buforu SR luminal Ca O Dużej Pojemności CSQ2 wydłuża czas uwalniania Ca, podczas gdy zmniejszenie ilości tego endogennego buforu skraca czas uwalniania, najwyraźniej spowalniając lub przyspieszając odpowiednio zależne od luminalu zamknięcie RyRs. Łącznie te wyniki dostarczają przekonujących dowodów na rolę Luminal ca-dependent dezaktywacji RyRs w zakończeniu CICR. Chociaż wykazujemy znaczenie zmian w Luminal Ca w zakończeniu uwalniania SR Ca, nasze wyniki niekoniecznie wykluczają możliwość, że dodatkowe mechanizmy, takie jak inaktywacja RyR lub adaptacja w cytozolowych miejscach regulacyjnych Ca, mogą również wpływać na zakończenie uwalniania Ca.

chociaż istnieją wyraźne dowody na rolę zmian Luminal Ca w przerwaniu iskier sercowych (ref. 3; obecne badanie), wcześniejsze badania wskazywały, że iskrom Ca w mięśniach szkieletowych może nie towarzyszyć znaczne uszczuplenie SR . Lacampagne et al. (33) wykorzystano analizę kinetyczną nagrań Ca spark o wysokiej rozdzielczości czasowej, aby zasugerować, że strumień uwalniania ca leżący u podstaw iskry Ca jest stały w włóknach mięśni płazów. Ponieważ strumień SR Ca musi spadać, gdy SR spada, wynik ten może oznaczać, że poziomy Luminal Ca pozostają stabilne podczas iskrzenia Ca. Istnieje więc możliwość, że podstawowe mechanizmy odpowiedzialne za zakończenie iskry są różne w mięśniach sercowych i szkieletowych. Wyniki badań uzupełniających w tych dwóch typach komórek (tj. modulacja poziomu białka CSQ we włóknach mięśni szkieletowych i szybkie pomiary kinetyki ca spark w miocytach serca) powinny pomóc w wyjaśnieniu tego problemu.

Jednym z najważniejszych aspektów naszych wyników jest to, że pokazują one, jak obniżony poziom CSQ2 może powodować arytmie serca na poziomie komórkowym. CPVT jest chorobą arytmogenną charakteryzującą się omdleniem i nagłą śmiercią indukowaną przez ćwiczenia fizyczne i wlew katecholaminy (34). Do tej pory cztery mutacje były związane z CPVT. Trzy z tych mutacji wydają się skutkować zmniejszoną ekspresją CSQ2 (17), a jedna mutacja została zaproponowana, aby doprowadzić do przerwania wiązania Ca (16). Nasze wyniki sugerują, że przyczyna CPVT może być związana z nieprawidłową restytucją mechanizmu uwalniania Ca spowodowaną zmniejszonymi poziomami CSQ2 (rys. 5). Ze względu na mniejsze stężenie miejsc wiązania Ca w SR komórek niedoekspresujących CSQ2, uzupełnianie magazynu Ca przez pompę SERCA następuje szybciej niż w normalnych komórkach. Ładowanie magazynowe staje się jeszcze szybsze, gdy aktywność SERCA jest stymulowana przez kinazę białkową a, co może być związane z zależnością epizodów klinicznych CPVT od katecholamin. W miocytach ze zmniejszonym poziomem CSQ2 przedwczesne odzyskiwanie kanałów uwalniania Ca z zależnego od Luminalnego Ca stanu opornego doprowadziło do spontanicznych, pozasystolicznych wyładowań zapasów SR Ca. Wiadomo, że samoistne uwalnianie Ca może wywoływać prądy wewnętrzne i oscylacje w potencjale błonowym, powodując arytmię wywołaną (4-7). W związku z tym zaobserwowane zaburzenia w obchodzeniu się z Ca mogłyby przynajmniej częściowo wyjaśnić patogenezę CPVT związaną z defektami genetycznymi, które skutkują albo zmniejszoną aktywnością wiązania Ca (16), albo zmniejszonym poziomem ekspresji CSQ2 (17).

porównanie z wcześniejszymi badaniami na myszach transgenicznych. Nasze wyniki różnią się od poprzednich wyników uzyskanych u transgenicznych myszy nadekspresujących CSQ2 (14, 15). W badaniach tych, 10-do 20-krotna nadekspresja CSQ2 zwiększała zdolność do przechowywania SR Ca izolowanych miocytów serca; jednakże, Luminal Ca nie był dostępny do uwolnienia, co prowadziło do zahamowania globalnych i lokalnych sygnałów uwalniania Ca. Tym zmianom w obchodzeniu się z Ca towarzyszyło kilka zmian strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych na poziomie komórkowym i subkomórkowym oraz rozwój przerostu i niewydolności serca. Z drugiej strony, niniejsze badanie utrzymuje poziomy białka CSQ2 bliżej fizjologicznych poziomów w ostrych, a nie przewlekłych warunkach; tak więc, dane te prawdopodobnie dokładniej odzwierciedlają bezpośrednie fizjologiczne konsekwencje zmian poziomu białka CSQ2 dla wewnątrzkomórkowego leczenia Ca. Wyniki te podkreślają potencjalne problemy w interpretacji skutków konstytutywnej ekspresji białek wysokiego poziomu w transgenicznych modelach zwierzęcych i wartość badań uzupełniających w bardziej ostrych warunkach.

wnioski. Podsumowując, odkryliśmy, że CSQ2 jest istotnym wyznacznikiem zdolności SR do przechowywania i uwalniania Ca w mięśniu sercowym. CSQ2 wydaje się służyć jako zbiornik dla Ca, który jest łatwo dostępny dla CICR, a także jako aktywny bufor Ca, który moduluje lokalne zależne od Luminalnego Ca zamknięcie RyRs. W tym samym czasie CSQ2 stabilizuje mechanizm CICR, spowalniając funkcjonalne Ładowanie magazynów SR Ca. Nieprawidłowe zachowanie kanałów uwalniających Ca może odpowiadać lub przyczyniać się do komorowych zaburzeń rytmu serca związanych z mutacjami w genie CSQ2.