wyniki

Modulacja komórkowych poziomów P107 poprzez kontrolowaną proteolizę. Wcześniej wykazaliśmy, że endogenny p107, członek rodziny białek RB, który nie jest naturalnym substratem SCFßTrCP, może być eliminowany w komórkach raka szyjki macicy c33a przez ektopową ekspresję chimerycznej ligazy ubikwitynowo–białkowej ßTrCP (ßTrCP-E7N), która niesie peptyd wiążący p107 pochodzący z N-końcowych reszt 35-aa onkoproteiny HPV, E7 (E7N) (1). Jednak funkcje wielu białek komórkowych są podyktowane ich wewnątrzkomórkową obfitością, a nie tylko ich obecnością lub nieobecnością. Do tej pory nie było wiarygodnej metody precyzyjnego modulowania wewnątrzkomórkowego poziomu białka w komórkach ssaków.

najpierw zbadaliśmy, czy poziomy p107 można systematycznie zmniejszać poprzez kontrolowaną ekspresję różnych ilości ßTrCP-E7N. ludzkie komórki raka szyjki macicy c33a zostały zainfekowane zwiększającymi się dawkami rekombinowanego adenowirusa przenoszącego ßTrCP-E7N lub kontrolnego adenowirusa przez 24 godziny. Zakażenie występowało w 100%, nawet przy najmniejszej zastosowanej dawce, co oceniono na podstawie ekspresji GFP przenoszonej przez adenowirusa we wszystkich komórkach biorcy (dane nie zostały przedstawione). Jak pokazano na Fig. 1 (Górna), stężenie endogennego p107 było systematycznie zmniejszane do 78%, 25% i 5% stężenia w stanie stacjonarnym, gdy komórki C33A były transdukowane rekombinowanym adenowirusem ßTrCP-E7N w mois 10, 35 i 80, ale nie w tych samych dawkach wirusa kontrolnego Ad1. Dlatego zaprojektowany SCFßTrCP-BP oferuje proste i powtarzalne środki do zmniejszenia ogólnych ilości białek docelowych na określonych poziomach w celu oceny wpływu dawkowania na aktywność biologiczną.

P107 stabilnie łączy się z cykliną a i Cdk2 poprzez miejsce wiązania o wysokim powinowactwie w komórkach proliferujących (13-15). Aby sprawdzić, czy te białka związane z p107 są również poddawane celowanej degradacji przez ßTrCP-E7N, przeprowadzono immunoblotting w komórkach C33A zakażonych wirusem Ad-F-TrCP-E7N. Jak pokazano na Fig. 1, poziomy endogennej cykliny a i Cdk2 pozostały niezmienione, podczas gdy p107 został drastycznie obniżony. Ponadto F-TrCP-E7N nie wpływał na poziomy nietargetowanej β-aktyny (Fig. 1). Wynik ten dostarczył mocnych dowodów na to, że zaprojektowana ligaza ubikwityny-białka ßTrCP–E7N specyficznie degraduje docelowy substrat p107, ale nie związane z nim białka.

selektywna degradacja specyficznej subpopulacji zmodyfikowanej Posttranslacyjnie białka docelowego. Modyfikacja białka komórkowego na poziomie posttranslacyjnym, taka jak fosforylacja, jest podstawowym środkiem wykorzystywanym przez komórki do regulowania funkcji lub nadawania nowych aktywności białka. Eksperymentalne narzędzia do analizy funkcji związanej z konkretnym wydarzeniem modyfikacji posttranslacyjnej są obecnie ograniczone. Ponieważ knockout białek działa na poziomie posttranslacyjnym, który bezpośrednio rozpoznaje białka docelowe, jednym z zastosowań jest zaprojektowanie specyficznego E3, który jest zdolny do wyboru subpopulacji białek zmodyfikowanych posttranslacyjnie do degradacji, zamiast niszczenia całej populacji.

stwierdzono, że HPV16 E7 selektywnie wiąże się z PODFOSFORYLOWANĄ formą RB (16). Zbadaliśmy, czy chimeryczna ligaza ubikwityny-białka ßTrCP-E7N może odróżnić hipo-i hiperfosforylowany RB i wybrać tylko hipoform do degradacji. Ludzkie komórki kostniakomięsaka U2OS wyrażają obie formy RB, które można łatwo zidentyfikować na podstawie ich zróżnicowanej mobilności elektroforetycznej na stronie SDS / (Fig. 2A, pas 1) (17). Tożsamość tych dwóch gatunków RB została następnie zweryfikowana przez immunoblotting przy użyciu przeciwciał swoistych dla hipo-lub hiperfosforylowanych form RB (Fig. 2A, Pasy 2 i 3). Komórki U2OS zakażono rekombinowanymi ad-F-TrCP-E7n lub kontrolnymi adenowirusami AD1 przez 48 godzin, a poziomy RB-P i RB w stanie stacjonarnym analizowano jednocześnie przez Western blotting, przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-RB, które rozpoznaje obie formy. Zgodnie z preferencyjnym wiązaniem E7N z hipofosforylowanym RB, ektopowa ekspresja F-TrCP-E7N powodowała eliminację hipofosforylowanego RB, podczas gdy hiperfosforylowany RB-P pozostał nienaruszony (Fig . 2b górne, porównaj pasy 4-6 z pasami 1-3). Wynik ten podkreśla zdolność ligazy ubikwityny-białka f-TrCP-E7N do wyboru specyficznej subpopulacji RB do degradacji, która została oparta na statusie pewnej modyfikacji posttranslacyjnej białka docelowego.

Pełnej długości HPV16 E7 może wchodzić w interakcje z zależnymi od cyklin inhibitorami kinazy p21Waf1 i p27Kip1, ale domenę wiążącą zmapowano do domeny C-końcowej (reszty 40-98), zamiast fragmentu E7N (reszty 18-20). W celu dalszego zbadania swoistości F-TrCP-E7N, te same ekstrakty komórek U2OS przebadano również przeciwciałami przeciwko p21Waf1 i p27Kip1. Jak widać na Rys. 2b (środek), poziomy p21waf1 i p27Kip1 w stanie stacjonarnym pozostały niezmienione. Łącznie skonstruowany F-TrCP-E7N wykazał proteolityczną swoistość wobec białek z rodziny RB, ale nie wobec innych regulatorów cyklu komórkowego, takich jak Cdk2, cyklina a, p21Waf1 i p27Kip1.

mutageneza oparta na strukturze w celu wytworzenia wysoce specyficznej ligazy ubikwityny-białka ßTrCP-E7N. Chimeryczny ßTrCP-E7N jest nadal zdolny do wiązania endogennych substratów ßTrCP, w tym IkB, β-kateniny i ATF4 (3-7). Nadekspresja ßTrCP-E7N może zakłócać degradację tych rodzimych substratów. Odwrotnie, Wiązanie endogennego substratu z ßTrCP-E7N może zakłócać właściwe pozycjonowanie zamierzonego substratu w celu przyjęcia ubikwityny z enzymu sprzęgającego ubikwitynę, a tym samym zmniejszać skuteczność ukierunkowanej degradacji (Fig. 3AUpper). Ponadto ßTrCP oddziałuje z pseudo substratem hnRNP-U, który łączy ßTrCP i jego pochodne w jądrze i wyklucza ich interakcję z substratami (21). Wprowadzając specyficzne mutacje reszt aminokwasowych na ßTrCP w celu wyeliminowania ich wiązania z β-kateniną, IkB lub hnRNP-U, przewidujemy poprawę nie tylko specyficzności, ale także dostępności zaprojektowanego ßTrCP-E7N do rekrutacji zamierzonego substratu (Fig. 3ALower).

domena wiążąca substrat ßTrCP zawiera siedem powtórzeń WD40 w regionie C-końcowym, które składają się w typową siedmioramienną strukturę β-śmigła zachowaną wśród białek WD40 (3-7). Ponieważ ogólna integralność struktury β-śmigłowej białek WD40 ma kluczowe znaczenie dla ich funkcji, standardowe podejście do mutagenezy delecji prawdopodobnie spowoduje poważne zmiany strukturalne, a zatem nie ma zastosowania do definiowania miejsc wiązania substratów na ßTrCP. Jednak znana struktura krystaliczna białek WD40 może być wykorzystana do identyfikacji pozostałości powierzchniowych zaangażowanych w Wiązanie substratów ßTrCP. Podejście oparte na strukturze mutagenezy zostało zaprojektowane w celu identyfikacji i mutacji pięciu dodatnio naładowanych reszt (R285, K365, R474, R521 i R524), przewidywanych do rezydowania na górnej powierzchni śmigła β WD40, które są zaangażowane w wiązanie z białkami związanymi z WD40 (Fig. 3B) (22). Podejście to zostało szczegółowo opisane w metodach wspierających, które są publikowane jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS. Ponadto, patrz Rys. 6, który jest publikowany jako informacje uzupełniające na stronie internetowej PNAS. Ponadto podstawienia tych reszt Lys / Arg prawdopodobnie nie zmienią ogólnej struktury ßTrCP.

używając zestawu quikchange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene), jednocześnie zmutowaliśmy te pozostałości do Glu. Ten oznaczony znacznikiem związek mutant, oznaczony F-TrCP (m1) – E7N, został przetestowany pod kątem jego wiązania zarówno z endogennymi (IkB), jak i zamierzonymi (p107) celami nokautującymi. Komórki HeLa transfekowano przejściowo za pomocą f-TrCP(m1)-E7N lub F-TrCP-E7N, a ich interakcje z IkB i p107 oznaczano przez koimmunoprecypitację. F-TrCP-E7N i F-TrCP wykazywały podobne powinowactwo do fosforylowanego białka IkB, podczas gdy mutacje związku M1 zniosły Wiązanie f-TrCP(M1)-E7N (Fig. 3C Środkowy). Natomiast podobne poziomy p107 wykryto w immunokompleksach f-TrCP-E7N lub F-TrCP (M1) – E7n (Fig. 3C niższe), co wskazuje, że ligaza ubikwityny-białka f-TrCP(m1)–e7n jest w pełni funkcjonalna w rekrutacji zamierzonych celów komórkowych. Wyniki te są zgodne z przewidywaniami strukturalnymi przedstawionymi na Rys. 3B i dalej definiują reszt aminokwasowych na ßTrCP krytycznych dla endogennego rozpoznawania substratów.

zmodyfikowany F-TrCP(m1)-E7N poddano dalszej analizie pod kątem jego siły działania w degradującym endogennym p107. Komórki C33A współwystępowano f-TrCP, F-TrCP-E7N lub F-TrCP(m1) – e7n wraz z plazmidem ekspresyjnym CD19. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji komórki pobrano i wzbogacono dla osób otrzymujących transfekowane plazmidy za pomocą kulek immunomagnetycznych sprzężonych z przeciwciałem monoklonalnym anty-CD19. Stężenia endogennego p107 oznaczano następnie metodą immunoblottingu. Jak pokazano na Fig. 3D, ektopowa ekspresja f-TrCP (M1)-E7N powodowała 95% zmniejszenie endogennego poziomu p107, podczas gdy dla F-TrCP-E7n obserwowano 82% obniżenie poziomu p107 (Fig. 3D Górna, porównaj pasy 4 i 3). Ponadto ekspresja F-TrCP (m1)-e7n nie miała obserwowalnego wpływu na indukowaną przez czynnik martwicy nowotworu (TNF)–α degradację IkB przez natywny SCFßTrCP, ani na niszczenie p27kip1 przez ligazy ubikwityny-białka SCFSkp2 (dane nie pokazane). W związku z tym ektopowa ekspresja wytworzonego F-TrCP(m1)-E7N nie wpływa na ogólną aktywność ubikwitynacji SCF poprzez squelching głównych składników SCF (Skp1, CUL-1 i Rbx1/Roc1) współdzielonych przez endogenne białka F-box.

ukierunkowany rozkład p107 oceniano dalej w poszczególnych komórkach C33A metodą pośredniego testu immunofluorescencyjnego. Konsekwentnie, p107 był w dużej mierze eliminowany w komórkach C33A wykazujących ekspresję F-TrCP-E7N lub F-TrCP(m1) – E7N, ale nie w samym f-TrCP (Fig. 3E). Łącznie wyniki te wskazują, że eliminując miejsca wiązania endogennych substratów ßTrCP, zaprojektowana ligaza ubikwityny-białka f-TrCP(m1)–e7n wykazała zwiększoną swoistość i silną aktywność proteolityczną w kierunku zamierzonego celu.

minimalna domena wiążąca jako peptyd celujący do skutecznej rekrutacji substratów. Aby osiągnąć wysoką specyficzność rekrutacji substratów i zminimalizować niespecyficzne ukierunkowanie na inne białka komórkowe, przetestowaliśmy, czy minimalna domena interakcji p107 / RB e7n (oznaczona E7m), która obejmuje reszty 21-29 E7 obejmujące motyw lxcxe (23), może osiągnąć skuteczne wiązanie i degradację p107. Zbudowano chimeryczną ligazę ubikwitynowo-białkową, w której ßTrCP i E7m były kowalencyjnie połączone ze sobą elastycznym dystanserem 20-aa składającym się z 10 kopii powtórzeń Gly-Ser (oznaczonych 10gs). F-TrCP-E7N lub F-TrCP-10gs-E7m przejściowo transfekowano do komórek C33A, a ich wiązanie z endogennym p107 oceniano przez immunoprecypitację w ekstraktach przygotowanych po leczeniu inhibitorem proteasomu MG132 w celu zahamowania degradacji w wyniku tej interakcji. Jak pokazano na Fig. 4A (Pasy 2 i 3), F-TrCP-10gs-E7m miał nieznacznie zwiększone powinowactwo do p107 niż pierwotne f-TrCP-E7N. f-TrCP-E7N i F-TrCP-10gs-E7m zostały dalej ocenione pod kątem ich skuteczności w degradacji p107 przez przejściową transfekcję w komórkach C33A, jak na Fig. 3D. jak pokazano na Rys. 4B, F-TrCP-E7N i F-TrCP-10GS-E7m indukowały do 92% I 95% downregulację p107, co wskazuje, że skonstruowany ßTrCP posiadający minimalną domenę wiążącą p107 działa tak wydajnie, jak oryginalny f-TrCP-E7N w degradujących białkach docelowych.

retrowirusowe dostarczanie zaprojektowanych ßTrCP w celu trwałej degradacji celów endogennych. Następnie zbadaliśmy, czy zaprojektowane ligazy ubikwityny-białka mogą być stabilnie wyrażone w celu osiągnięcia trwałej degradacji zamierzonego celu. Komórki białaczki promielocytowej HL-60 transdukowano rekombinowanymi retrowirusami z ekspresją PBMN-GFP, F-TrCP (M1)-E7N lub kontrolną f-TrCP-E7N(ΔDLYC), w której usunięto miejsce wiązania RB/p107 (1). Zakażone komórki z chromosomalnie zintegrowanymi chimerycznymi transgenami F-TrCP wyizolowano przez sortowanie FACS, oparte na ekspresji GFP z wirusów, a degradację endogennego p107 oceniono z zakażonych komórek HL-60 bezpośrednio po zakażeniu (Fig. 5A) lub po 3 miesiącach hodowli w pożywce wzrostowej (rys. 5b). Ponadto, ponieważ dwa inne białka z rodziny RB, RB i p130, również ulegają ekspresji w komórkach HL-60, zbadaliśmy, czy pojedynczy F-TrCP-E7N może jednocześnie celować w degradację całej rodziny białek RB, które oddziałują z tym samym motywem LXCXE e7n. ektopowa ekspresja retroviralnie transdukowanego f-TrCP-E7N indukowała dramatyczną regulację w dół hipofosforylowanej formy RB, jak również p107 (Fig. 5A) i p130 (dane nie pokazane) w komórkach HL-60, bezpośrednio po zakażeniu i sortowaniu FACS (Fig. 5A) lub 3 miesiące po zakażeniu i ciągłym hodowaniu (rys. 5B, lane 3). Natomiast stabilna ekspresja F-TrCP-E7N (ΔDLYC) w komórkach HL – 60 nie miała wpływu na zmianę p107, RB (Fig. 5A, pas 3) i poziom p130 (dane nie są pokazane). Zgodnie z obserwacją, że F-TrCP-E7N preferencyjnie rozkłada hipofosforylowany RB w komórkach U2OS (Fig. 2), redukcja hiperfosforylowanych gatunków RB przez stabilną ekspresję F-TrCP-E7N była mniej wyraźna w porównaniu z formą hipofosforylowaną w komórkach HL – 60 (Fig . 5A, porównaj pas 2 PRB i pRB-p).

podczas leczenia kwasem all-trans retinowym (ATRA) komórki HL-60 wychodzą z cyklu komórkowego i przechodzą różnicowanie końcowe. Zaobserwowano nagromadzenie hipofosforylowanego RB, które wcześniej zgłaszano, że przyczynia się do zahamowania wzrostu wywołanego ATRA, podczas gdy hiperfosforylowany RB nie był wykrywalny (24, 25). W celu zbadania, czy mechanizm SCFßTrCP może być również wykorzystany podczas wyjścia z cyklu komórkowego, komórki HL-60 stabilnie wyrażające F-TrCP-E7N lub F-TrCP(M1) – E7N potraktowano 1 µM ATRA przez 72 h i oceniono degradację białek z rodziny RB. Komórki HL-60 ze stabilną ekspresją F-TrCP-E7N powodowały odpowiednio 95%, 98% i 85% spadek poziomów RB, p107 i p130 w porównaniu z komórkami zakażonymi kontrolnym wirusem pBMN-GFP (Fig. 5B, lane 2). Ponieważ ATRA aktywuje również transkrypcję genów pod kontrolą wirusa Moloney murine leukemia LTR pbmn-GFP (26), zwiększona ekspresja F-TrCP-E7N w leczeniu ATRA prawdopodobnie przyczyniła się do skutecznej regulacji P107, p130 i hipofosforylowanego RB (Fig. 5b).

wpływ białek z rodziny RB na prawidłową progresję cyklu komórkowego został zbadany u fibroblastów zarodków myszy z zakłóceniami w genach RB, p107 i P130 i stwierdzono, że nie reagują na sygnały indukujące zatrzymanie G1, takie jak wycofanie czynnika wzrostu lub uszkodzenie DNA (27, 28). Nie badano jednak zbiorowego wpływu członków rodziny RB na proliferację komórek nowotworowych ze względu na brak skutecznych narzędzi genetycznych. Stabilne komórki HL-60 wyrażające F-TrCP(m1)-E7N z tego badania pozwoliły nam ocenić, w jaki sposób komórki nowotworowe z niedoborem wszystkich trzech białek z rodziny RB zareagowały na sygnały zatrzymania G1. W wykładniczo rosnących komórkach HL-60 wyrażających F-TrCP(m1)-E7N, które indukowały konstytutywną degradację białek z rodziny RB, zaobserwowano znaczne przyspieszenie progresji cyklu komórkowego w porównaniu z zakażonymi kontrolnym wirusem pBMN-GFP (Fig. 5c po lewej). Wynik ten jest zgodny z zaburzeniami kontroli przejść G1– s obserwowanymi u fibroblastów zarodków myszy z potrójnym nokautem RB–/–, p107–/– i P130–/ – (27, 28).

leczenie ATRA hamowało Przejście fazy G1 do S w komórkach HL-60 zakażonych kontrolnym pBMN-GFP (Fig. 5c) lub wirusa F-TrCP-E7N(ΔDLYC) (brak danych), co jest zgodne z tym, co zgłoszono dla niezakażonych komórek HL – 60 (Fig. 5C) (24). Początkowe opóźnienie przejścia G1-s obserwowano również w komórkach pBMN-F-TrCP(M1)-E7N/HL-60 po 48 godzinach od ATRA. Jednak całkowite zatrzymanie G1 nie było możliwe w późniejszym etapie (72-96 h) i komórki kontynuowały przebieg progresji cyklu komórkowego (Fig. 5C). W przeciwieństwie do tego, wszystkie komórki kontrolne pbmn-GFP/HL-60 zostały zablokowane w G1 między 72 A 96 godziną. obserwacje te sugerują, że degradacja członków rodziny RB za pośrednictwem F-TrCP(m1)-E7N upośledza późną reakcję ATRA niezbędną do zakończenia zatrzymania wzrostu, podczas gdy wczesne tłumienie progresji G1-s było w dużej mierze nienaruszone. Ponadto zaobserwowano dramatyczne zmniejszenie liczby komórek między 72 A 96 godziną po leczeniu ATRA z powodu masywnej śmierci komórek podczas wywołanego Atra wyjścia z cyklu komórkowego i różnicowania (29). Uderzająco, komórki HL-60 z ekspresją F-TrCP(m1) – E7N wykazywały średni wzrost od 2 do 3 razy w populacjach subG1 w porównaniu z komórkami HL-60 zakażonymi wirusem kontrolnym (dane nie pokazane), co jest zgodne ze zwiększoną śmiercią komórek w embrionalnych fibroblastach RB -/–, p107–/– i P130–/– w Warunkach hamujących wzrost (28). Łącznie, konstytutywna ekspresja F-TrCP (m1)-E7N indukuje down-regulację całej rodziny białek RB, co prowadzi do zahamowania zatrzymania wzrostu i zwiększenia śmierci komórki podczas leczenia ATRA.

indukowane Atra zatrzymanie G1 obejmuje skoordynowaną regulację wielu sygnałów/składników komórkowych, które negatywnie kontrolują cykl komórkowy (recenzja w ref. 30). Dimberg et al. (31) poinformował, że ATRA wywołuje sekwencję zdarzeń w komórkach mieloidalnych, obejmujących wczesne zwiększenie ekspresji p21waf1, stabilizację p27kip1 i, Później, defosforylację RB na początku zatrzymania G1. Ponieważ ßTrCP(m1)-E7N degraduje tylko członków rodziny RB i nie ma wpływu na stabilność p21waf1 i p27kip1, jest prawdopodobne, że tylko późna, zależna od RB odpowiedź ATRA jest zaburzona, co jest zgodne z odpornością komórek pBMN-F-TrCP (M1)-E7n/HL-60 na ukończenie zatrzymania g172-96 h (Fig. 5C). Obserwowane wczesne zahamowanie wzrostu przez ATRA po 48 h (Fig. 5C) można przypisać, przynajmniej częściowo, regulacji up p21waf1 i p27kip1, których stabilność nie ma wpływu na konstytutywną ekspresję F-TrCP (M1) – E7N (Fig. 2 i 5).