ulepszony system ciągłej uprawy na małą skalę

w tym badaniu pokazujemy dalsze postępy i możliwości zastosowania systemu ciągłej uprawy na małą skalę, opracowanego wcześniej przez Kleina i wsp. , w celu zwiększenia stopnia równoległości i poprawy obsługi, a także monitorowania poszczególnych reaktorów. Kluczowe aspekty zmian wprowadzonych do systemu obejmują zwiększenie zestawu naczyń do hodowli równoległej z 8 do 24 reaktorów i zmniejszenie objętości roboczej z 10 do 6,5 mL. Niniejszy system składa się ponadto z niestandardowych pokrywek mieszczących cztery stałe porty służące do napowietrzania, dostarczania mediów, usuwania bulionu, a także szczepienia lub pobierania próbek (rys. 1). Poza czterema portami przez pokrywę wkładana jest sonda DO w kształcie pręta optycznego, która umożliwia monitorowanie bez zakłócania procesu uprawy i w ten sposób zastępuje miejsce czujnika fluorescencyjnego tlenu w poprzednim ustawieniu . Łaźnia wodna, która w poprzednim ustawieniu utrzymywała stałą temperaturę uprawy, została zastąpiona przez wykonany na zamówienie aluminiowy blok grzewczy, który jest połączony z mieszadłem mikropłytkowym. Ponieważ poprzednia wersja systemu bioreaktorów na małą skalę została zatwierdzona przy użyciu drożdży Rozszczepieniowych Schizosaccharomyces pombe, przedstawiamy ulepszoną konfigurację uprawy dla upraw S. cerevisiae.

przeprowadzono podstawowe czynności operacyjne, a także regulację szybkości rozcieńczania poprzez dobór odpowiedniej średnicy rury i szybkości pompy dopływu medium, jak opisano wcześniej . Tutaj masę zawartości cieczy w każdym bioreaktorze określono grawimetrycznie na końcu uprawy, umożliwiając dokładne obliczenie odpowiedniej szybkości rozcieńczania za pomocą 5.1% odchylenie. Bulion hodowlany i fazę gazową reaktora usunięto przez ten sam port pokrywy reaktora za pomocą pompy odpływowej (rys. 1). We wszystkich eksperymentach z uprawą stosowano pompę wypływu wynoszącą 7,5 mL min−1. Szybkość wypływu pompy była znacznie wyższa niż szybkość pompy zasilającej, generując niewielkie podciśnienie wewnątrz zbiornika do hodowli. Ta różnica ciśnień powodowała napływ powietrza przez port napowietrzania. Średni współczynnik przenikania masy tlenu Kla wynosił 110 h-1, co pozwalało na osiągnięcie poziomu znacznie powyżej 30% nasycenia w całym procesie uprawy. PH nie było monitorowane w trybie online ani kontrolowane podczas uprawy, ponieważ pożywka była a priori dostosowywana do pH 6,0, co dało końcowe pH 5,5 w bulionie hodowlanym. PH mierzono codziennie na linii od odpływu reaktorów i po zbiorach. Po osiągnięciu stanu stacjonarnego pH pozostawało na stałym poziomie, a odpływ reaktora wykazywał niewielkie odchylenie wynoszące 0,1 jednostki pH (nie przedstawiono danych).

badając produkcję 3-HP w małych chemostatach przy różnych szybkościach rozcieńczania w Warunkach ograniczających C

w celu określenia maksymalnego właściwego tempa wzrostu (µmax), S. cerevisiae ST938 uprawiano w Warunkach wsadowych z zastosowaniem nadmiernej dostępności składników odżywczych. Wykorzystując glukozę jako źródło węgla, µmax wynosił 0,265 h-1, Wydajność biomasy wynosiła 24,9 g mol−1, A Wydajność węgla 3 HP na glukozie wynosiła 0,6% C-mol (Tabela 1). W tym trybie uprawy większość węgla była metabolizowana do etanolu i CO2, jako wysokie topniki glikolityczne w dzikim typie S. cerevisiae są silnie związane z fermentacją alkoholową . Uprawa chemostatu jest kontrolowana przez dostarczanie podłoża ograniczającego wzrost. W stanie stacjonarnym dziki Typ S. cerevisiae nie wytwarza znaczących ilości metabolitów przelewowych poniżej określonej szybkości wzrostu, oznaczając krytyczną szybkość rozcieńczenia (Dcrit (h-1)) z powodu braku akumulacji źródła węgla. Przy lub powyżej tej krytycznej szybkości rozcieńczania źródło węgla gromadzi się w reaktorze i uruchamia się metabolizm przelewowy, co powoduje wytwarzanie różnych produktów ubocznych, takich jak etanol, octan i niewielkie ilości kwasów organicznych . W związku z tym, do badania zależności między tempem wzrostu a wytwarzaniem produktu 3-HP specyficznego dla biomasy w S. cerevisiae ST938 wykorzystano hodowle ciągłe. Cztery różne szybkości rozcieńczeń D (h−1): 0,04, 0,09, 0,17 i 0,21 wybrano tak, aby były niższe od µmax szczepu S. cerevisiae st938 oznaczonego w uprawie wsadowej. Zbadano wydajność biomasy na glukozie, jak również wydajność 3 HP, właściwą szybkość produkcji 3 HP i właściwą szybkość wychwytu substratu (rys. 2a-D, Tabela 1). Wszystkie istotne parametry uprawy, tj. plony i wskaźniki z odpowiednimi odchyleniami standardowymi, zestawiono w tabeli 1.

uprawa S. cerevisiae ST938 w Warunkach ograniczających C wykazała przejście z metabolizmu głównie fermentacyjnego obserwowanego w trybie wsadowym na metabolizm oddechowy w chemostatach, co znajduje odzwierciedlenie w wyższych plonach biomasy, a także w znikomym tworzeniu etanolu i glicerolu (Tabela 1). Ponadto niewielkie ilości resztkowej glukozy poniżej 0.1 mM wykryto w próbkach pobranych z odpływu różnych reaktorów, sprawdzając, czy kultury są ograniczone do glukozy. Warunki ograniczone węglem występujące w hodowlach chemostatów w stanie stacjonarnym wydawały się sprzyjać powstawaniu 3-HP, ponieważ wydajność tego produktu była 20-25-krotnie wyższa niż wydajność określona w hodowli wsadowej(Tabela 1). Jest to najprawdopodobniej spowodowane bardziej efektywną konwersją węgla w energię w postaci ATP podczas oddychania w porównaniu do fermentacji w kulturach wsadowych. Co ciekawe, kultywacje S. cerevisiae ST938 w Warunkach ograniczających C ujawniło, że przy malejących wskaźnikach wzrostu swoistego można zaobserwować stały wzrost wydajności węgla 3-HP, przy czym najwyższą wydajność 3-HP wynoszącą 16,6% C-mol obserwowano przy szybkości rozcieńczania 0,04 h-1 (Fig . 2A). Wydajność 3−HP biomasy jest dziesięciokrotnie wyższa niż wydajność w hodowlach wsadowych i wzrosła ponad dwukrotnie z 0,19 do 0,43 g gCDW−1 poprzez obniżenie szybkości rozcieńczania z 0,21 do 0,04 h-1 (Tabela 1). Maksymalną wydajność właściwą dla 3-HP wynoszącą około 0,50 mmol gCDW-1 h-1 obserwowano przy współczynnikach rozcieńczenia wynoszących 0,17 i 0.21 h-1, czyli mniej więcej czterokrotnie więcej niż w uprawach wsadowych (rys. 2c, Tabela 1). Zgodnie z oczekiwaniami, właściwa szybkość wychwytu glukozy (qS) zwiększała się wraz z większymi szybkościami rozcieńczania z 0,51 do 2,1 mmol gCDW−1 h−1 (Fig. 2d). Wartości te są do 20 razy niższe od maksymalnej właściwej szybkości wychwytu glukozy wynoszącej 10,7 mmol gCDW−1 h−1 obserwowanej przy µmax w warunkach wzrostu ograniczonego glukozą w trybie wsadowym(Tabela 1). Wartości uzyskane dla współczynnika absorpcji specyficznego substratu i uzysku biomasy przy współczynniku rozcieńczenia równym 0.09 h-1 (Tabela 1) były zgodne z danymi z upraw chemostatu z dzikim typem S. cerevisiae przy szybkości rozcieńczania 0,10 H-1, stwierdzając odpowiednio 1,1 i 1,25 mmol gCDW−1 h−1 oraz 0,49 G g−1 . Stwierdzono, że wydajność biomasy na substrat wzrasta wraz ze wzrostem szybkości rozcieńczania, w przypadku S. cerevisiae typu dzikiego, jednak parametr ten jest na ogół stały poniżej Dcrit, o ile metabolizm podtrzymujący stanowi znaczny pochłaniacz węgla, zmniejszając wydajność biomasy przy niskich szybkościach rozcieńczania . W przypadku S. cerevisiae szczep ST938, jednak wydawało się, że węgiel, który nie jest ukierunkowany na powstawanie biomasy, w pewnym stopniu przyczynia się do powstawania zarówno 3-HP, jak i produktów ubocznych.

podsumowując, różnice doświadczane w ciągłych hodowlach przy różnych szybkościach rozcieńczania, jak również w porównaniu do podobnych zestawów z S. cerevisiae typu dzikiego sugerują, że zintegrowana ścieżka biosyntetyczna do produkcji 3-HP ma ogromny wpływ na fizjologię drożdży, która jest prawdopodobnie wzmacniana przez adaptacyjne reakcje stresowe. Wreszcie, C-ograniczona uprawa chemostatu przy najniższym współczynniku rozcieńczenia wynoszącym 0.04 h−1 zaowocowało najwyższą wydajnością 3-HP węgla.

badając ograniczenie azotu i fosforanów w celu zwiększenia wydajności 3-HP w hodowlach chemostatów na małą skalę

Po scharakteryzowaniu S. cerevisiae ST938 w Warunkach ograniczających C, przeprowadzono uprawy w Warunkach ograniczających azot i fosforan, ponieważ wcześniej udowodniono, że są korzystne dla produkcji różnych rodzimych i nienaturalnych metabolitów w różnych organizmach . W tym przypadku, odpowiednie uprawy pod ograniczeniem azotu (N) i fosforu (P) były badane w systemie ciągłej uprawy na małą skalę (Fig. 1) z ustaloną szybkością rozcieńczenia 0,04 h-1, która wcześniej dawała najwyższą wydajność węgla 3-HP w Warunkach C-limited (Tabela 1). Parametry i odpowiednie odchylenia standardowe od upraw ograniczonych do N I P szczepu drożdży st938 podsumowano w tabeli 2.

w warunkach uprawy ograniczonych N I P nie wykryto resztkowego amonu ani fosforanu w próbkach pobranych z odpływu różnych reaktorów, sprawdzając, czy kultury są ograniczone w odniesieniu do odpowiedniego ograniczenia substratu (Tabela 2). Jednakże niewielkie ilości pozostałości glukozy w zakresie 0,63 i 0,19 mM wykryto w ramach ograniczenia N I P (Tabela 2). Podczas C-limitation poziom resztkowy glukozy był znacznie poniżej 0,1 mM (Tabela 2). Uprawy z ograniczeniami N I P wykazały wydajność 3 HP wynoszącą odpowiednio 17,7 i 21,1% C-mol, wykazując znacznie wyższą wartość w warunkach ograniczonej P w porównaniu z wydajnością węgla 3 HP wynoszącą 16,6% C-mol obliczoną dla warunków uprawy ograniczonej C (tabele 1, 2). Podobnie, wydajność właściwa dla 3 – HP została znacząco zwiększona dla upraw N-I P-limited, ujawniając wartości 0,22 i 0,23 mmol gCDW-1 h-1 w porównaniu do 0,17 mmol gcdw−1 h−1 osiągniętych w kulturach C-limited. Ponadto wydajność biomasy o mocy 3 km wykazała porównywalne wartości 0,43 i 0.44 g gCDW – 1 w Warunkach ograniczających C i N, jednak w przypadku ograniczenia P zaobserwowano zwiększoną wydajność 0,50 g gCDW-1. Ze względu na ogólne niskie stężenia produktów ubocznych oznaczonych ilościowo są one nieistotne(Tabela 2). Wartości współczynnika wychwytu specyficznego substratu (QS) dla ograniczenia C I P były porównywalne i nieznacznie podwyższoną wartość 0,61 mmol gCDW-1 h−1 uzyskano w warunkach ograniczonych N. Wydajność biomasy na podłoże ujawniła dla warunków ograniczonych N I P podobne wartości odpowiednio 72,4 i 75,2 g mol−1. W porównaniu do wydajności biomasy 78.4 g mol−1 uzyskane w warunkach ograniczonych przez C, wartości te są podobne. Nasze badanie potwierdza uzasadnienie, że wyższe plony produktu na substrat uzyskano w Warunkach ograniczających N I p. W związku z tym wydaje się, że wyższy wskaźnik wychwytu specyficznego substratu w przypadku ograniczenia N w połączeniu z minimalnym tworzeniem produktów ubocznych ostatecznie faworyzował tworzenie produktów. W Warunkach ograniczających P powstawały najmniejsze ilości produktów ubocznych, co mogło sprzyjać syntezie produktów. Można dalej spekulować, że niektóre zmiany metaboliczne mogą prowadzić do zmniejszenia ilości węgla uwalnianego jako CO2.

podsumowując, uprawy chemostatu w ramach ograniczenia N I P wykazały wzrost wydajności 3 HP i specyficzne tempo produkcji w porównaniu z warunkami ograniczonymi C, z ograniczeniem P umożliwiającym uzyskanie najwyższych plonów produktu.

przenoszenie parametrów fizjologicznych mierzonych w małych chemostatach do hodowli wsadowych w bioreaktorach 1-L w Warunkach ograniczających C I P

ponieważ badanie to miało na celu ocenę możliwości przenoszenia i porównywalności parametrów fizjologicznych mierzonych w różnych warunkach uprawy, parametry uprawy uzyskane z warunków ograniczających C I P określonych w hodowlach chemostatów przeniesiono do reaktorów 1-L w mieszanych reaktorach wsadowych pracujących w trybie wsadowym. Koncepcja tego podejścia polegała zatem na utrzymaniu kluczowych warunków i parametrów na stałym poziomie dla chemostatu i hodowli wsadowych w celu zapewnienia porównywalności. Warunki te obejmowały (i) taki sam stosunek C:P jak w uprawach chemostatu ograniczającego P, (ii) identyczne warunki procesowe, takie jak pH i temperatura, oraz (iii) takie same właściwe tempo wzrostu, jak w chemostatach, osiągnięte dzięki wykładniczemu profilowi posuwu. Aby zoptymalizować miano produktu, parametry z maksymalną wydajnością produktu na substrat z eksperymentów z chemostatem (D = 0.04 h−1) w ramach ograniczenia C I P wybrano przeniesienie do systemu wsadowego fed-batch. Ze względu na ograniczenia techniczne w ustawieniu, uprawa wsadowa prowadzona była w tempie wzrostu 0,05 h−1, co jest nieco wyższe w porównaniu z ustalonym tempem rozcieńczenia 0,04 h-1 w uprawach chemostatu. Uprawa wsadowa składała się z początkowej fazy wsadowej w celu wytworzenia biomasy, po której następowała wykładnicza, ograniczona składnikami odżywczymi Faza karmienia w celu kontrolowania tempa wzrostu. Tylko faza karmienia została uznana za istotną dla oceny przenoszenia parametrów uzyskanych z systemu ciągłej uprawy, ponieważ tylko w tej fazie stężenie substratu kontrolowało, a tym samym ograniczało wzrost drobnoustrojów. Profile uprawy wsadowej S. cerevisiae ST938 z zastosowaniem warunków ograniczających C I P przedstawiono na Fig. 3, a odpowiednie parametry uprawy z ich odpowiednim odchyleniem standardowym podsumowano w tabeli 3.

w przypadku warunków ograniczających P, jednak nasze badania wykazały znaczny wzrost wydajności węgla 3-HP o 25,6% (rys. 4a). Obserwowana wydajność biomasy o mocy 3 km wynosiła odpowiednio 0,38 i 0,65 g gCDW−1 dla warunków ograniczających C i P. Dla ograniczenia C potwierdziło to wartości obserwowane w ustawieniu chemostatu (rys. 4B). Ze względu na wzrost wydajności 3 HP na substrat w Warunkach ograniczających P i jednocześnie niewielki spadek wydajności biomasy na substrat, wydajność 3 HP na biomasę została znacznie zwiększona w porównaniu do eksperymentu chemostat. W przeciwieństwie do upraw prowadzonych w chemostatach nie stwierdzono znaczącej akumulacji etanolu ani glicerolu w uprawach wsadowych. Zamknięty bilans węglowy dla warunków ograniczających C I P wskazywał, że nie powstały odpowiednie ilości innych (ubocznych)produktów(Tabela 3). Ta różnica w spektrum produktów ubocznych może wyjaśnić wzrost wydajności 3 HP na glukozę.

w porównaniu z uprawami prowadzonymi w chemostatach, właściwe wskaźniki wychwytu glukozy określone w hodowlach wsadowych wykazują znacznie wyższe wartości 0,75 i 0,77 mmol gCDW-1 h-1 odpowiednio dla warunków C-I P-ograniczających. Jak wspomniano powyżej, wartość zadana współczynnika wykładniczego profilu posuwu została ustawiona na 0,05 h – 1 i wahała się do 0,059 h−1, co skutkowało o 30-45% wyższym właściwym tempem wzrostu w uprawach wsadowych w porównaniu do eksperymentów z chemostatem z 0.04 h-1 (Tabela 3), co powoduje zwiększenie swoistego wychwytu glukozy. Niemniej jednak, w przypadku fermentacji z ograniczeniem C, wydajność biomasy na glukozie była porównywalna między chemostatem a uprawą wsadową. Podobnie, w uprawach wsadowych zwiększono wydajność produkcji właściwej o 3 km, odpowiednio o 0,24 mmol gCDW-1 h-1 i 0,38 mmol gcdw−1 h−1. Plony 3-HP na podłoże były porównywalne między chemostatem a uprawą wsadową, co sugeruje, że plony są solidnym parametrem uprawy, który jest odporny na perturbacje wywołane mniejszymi wahaniami w konfiguracji uprawy. W próbkach pobranych z różnych reaktorów w Warunkach ograniczających P nie wykryto pozostałości fosforanu, jak również glukozy, potwierdzając, że kultury są ograniczone w odniesieniu do odpowiedniego ograniczenia. Podobnie w przypadku ograniczenia C w próbkach nie wykryto pozostałości glukozy.

tutaj przedstawiono ulepszenia systemu chemostatu na małą skalę, wcześniej opracowanego przez Klein et al. , polegał m.in. na zwiększeniu liczby reaktorów do 24 oraz zmniejszeniu objętości upraw do 6,5 mL. Ten zwiększony stopień równoległości sprawia, że system jest odpowiednim narzędziem przesiewania o wysokiej przepustowości, ponieważ różne porównywalne systemy chemostatów na małą skalę działają z większą objętością roboczą i mniejszą liczbą reaktorów: system ciągłego równoległego wstrząśniętego bioreaktora (CosBios )wykorzystuje sześć odpowiednio ośmiu równoległych naczyń do hodowli o objętości 20-25 mL. Do uprawy ciągłej zmodyfikowany system bioreaktorów jednorazowego użytku z mieszadłem (bioREACTOR, 2MAG AG) współpracuje z ośmioma równoległymi reaktorami o objętości roboczej 10 mL . System mini-chemostat (MC) opracowany przez Bergenholm et al. składa się z 16 równoległych reaktorów i wymaga objętości roboczej 40 mL. Nasz system jest zatem dobrze stosowany do prostego i ekonomicznego przesiewania wydajności mikrobiologicznej w trybie ciągłym. Może to jednak mieć znaczenie w dalszym zakresie systemu poprzez monitorowanie dodatkowych parametrów, takich jak spaliny, w celu umożliwienia szczegółowej analizy rozkładu węgla, co ma szczególne znaczenie dla fizjologicznej charakterystyki szczepu.

ponieważ nasze badania sugerowały, że ograniczenie N I P jest korzystne dla tworzenia 3 – HP w S. cerevisiae, przyszłe eksperymenty mogą obejmować dalsze badania przesiewowe tempa wzrostu z zastosowaniem ograniczenia N I P w celu znalezienia optymalnej produkcji 3-HP z każdym odpowiednim ograniczeniem. Nasze badania wykazały również możliwość przenoszenia parametrów fizjologicznych z chemostatu do upraw wsadowych. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy podczas uprawy wsadowej nie gromadzą się żadne toksyczne lub hamujące związki, ponieważ parametry fizjologiczne zmieniałyby się w czasie i odbiegały od parametrów nabytych w chemostatach. Jako ogólne podejście, eksperymenty z chemostatem mogą służyć jako narzędzie do badania wpływu potencjalnego toksycznego lub hamującego związku poprzez dodanie substancji do samej paszy. Ponieważ wszystkie inne parametry są stałe, wpływ związku i jego stężenie można bezpośrednio ocenić i ocenić. W naszych badaniach nie wykryto powstawania produktu ubocznego w uprawach wsadowych i prawdopodobnie podobna reakcja na stres została wywołana przez słabe kwasy, co pozwoliło na podobieństwo warunków fizjologicznych w małych chemostatach do tych w Warunkach wsadowych.

podsumowując, badanie to wykazało, że koncepcja warunków ograniczających C i P do produkcji 3 – HP była badana w nowym równoległym systemie uprawy chemostatu i mogła być z powodzeniem przeniesiona do 1-L bioreaktorów stołowych pracujących w trybie wsadowym. W związku z tym parametry fizjologiczne uzyskane w chemostatach mogą być wykorzystywane do projektowania i oceny wydajności upraw wsadowych przy użyciu parametrów opartych na plonach do przygotowania procesu.