Coxsackievirus B3 (CVB3) jest enterowirusem z rodziny Picornaviridae. Po związaniu z receptorem koksackiewirusa i adenowirusa (6, 64) wirusowe RNA wchodzi do cytoplazmy, gdzie jest przekształcane w pojedynczą poliproteinę przez maszynę translacyjną gospodarza. Poliproteina jest następnie proteolitycznie przetwarzana przez proteazy wirusowe w celu wytworzenia wszystkich białek strukturalnych i niestrukturalnych wirusa. Kodowana przez wirusa polimeraza RNA-zależna od RNA transkrybuje ujemne nici wirusowe RNA, które służą jako szablony do syntezy wielu genomów potomnych. Po zapakowaniu wirusa wirus jest uwalniany, potencjalnie pod wpływem kodowanego przez wirusa białka 2B (67). Podczas procesu replikacji i uwalniania potomstwa wirusowego dochodzi do efektu cytopatycznego (CPE) i dochodzi do uszkodzenia komórki gospodarza, z ewentualną utratą żywotności.

wiele procesów komórkowych gospodarza zmienia się podczas pasożytowania pikornawirusa. Białko wirusa 2apro bezpośrednio rozszczepia eukariotyczny czynnik inicjujący 4 gamma (eIF4G). Rozszczepianie tego czynnika inicjującego translację nie tylko znosi translację mRNA zależną od Kapu (19); uważa się, że produkty rozszczepiania stymulują translację nieograniczonego mRNA, takiego jak niekomórkowy Genom pikornawirusa (43), który wykorzystuje nowatorski wewnętrzny mechanizm wejścia rybosomu do rozpoczęcia translacji białek (31, 76). Wykazano, że białka poliowirusowe 2apro i 3cpro przecinają białko wiążące TATA, przy czym 3Cpro wyłącza również transkrypcję polimeraz RNA i, II i III (11, 72, 74). Czynniki transkrypcyjne TFIIIC (10), CREB (73) i Oct-1 (75) są również rozszczepiane przez 3Cpro podczas zakażenia pikornawirusem. Wykazano, że białko CVB3 2B modyfikuje retikulum endoplazmatyczne i przepuszczalność błony komórkowej (14), powodując zwiększenie stężenia wolnego wapnia w cytozolach (28, 67) oraz zmiany w błonie, które mogą ułatwić uwalnianie potomstwa wirusa. Spadają gradienty jonowe (40, 52), a aktywność fosfolipazy ulega zmianie (24, 29). Cvb3 zakażenie komórek HeLa powoduje fosforylację tyrozynową dwóch białek komórkowych w 4 h po zakażeniu, a hamowanie tych fosforylacji znacząco zmniejsza produkcję potomstwa wirusa (27). Oczywiste jest, że infekcja jest dynamicznym procesem komórkowym, w którym interakcje między wirusowymi i białkami gospodarza decydują o wyniku zarówno dla wirusa, jak i komórek gospodarza.

jest teraz jasne, że proteazy cysteinowe z rodziny enzymów kaspaz są kluczowymi cząsteczkami efektorowymi w apoptotycznej śmierci komórek. Po aktywacji kaspazy rozszczepiają specyficzne substraty, w tym polimerazę Poli (ADP-ryboza) (PARP) (35), czynnik fragmentacji DNA (DFF) (37), gelsolin (34), laminę a (58), białka wiążące sterol regulatorowy (68), α-fodrynę (12, 66), ogniskową kinazę adhezyjną (71) i mdm2 (18), wśród wielu innych. Takie rozszczepienia powodują istotne zmiany w prawidłowych homeostatycznych procesach komórkowych i odpowiadające im zmiany morfologiczno-strukturalne komórek.

wiele wirusów posiada biochemiczne mechanizmy unikania i / lub indukowania apoptozy w komórkach, w których przebywają (recenzje, patrz referencje49 i 60). Różne wirusy oddziałują na różnych etapach szlaku śmierci apoptotycznej. Wirusy wyewoluowały strategie ukierunkowane na kompleks sygnalizacji receptora FAS ligand-FAS lub czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α)–receptora TNF, rodzinę regulatorów Bcl-2 lub rodzinę kaspaz (49, 60). Mechanizmy śmierci komórek zakażonych CVB3 pozostają do ustalenia; istnieją jednak ograniczone dowody morfologiczne dotyczące indukcji apoptozy w komórkach zakażonych pikornawirusem. Dowody uzyskane za pomocą mysich wirusów zapalenia mózgu (32, 65) i poliowirusa (63) wskazują, że komórki zakażone pikornawirusem ulegają apoptozie, w oparciu o kryteria morfologiczne, w tym kondensację jądrową i fragmentację DNA.

aby określić, czy kaspazy są aktywowane i odpowiedzialne za CPE obserwowane po zakażeniu CVB3, komórki HeLa (American Type Culture Collection, Rockville, Md. CVB3 (hojnie dostarczone przez Charles Gauntt, University of Texas Health Sciences Center, San Antonio) lub pozornie leczone minimum essential medium (mem) bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) przez 45 minut. Komórki przemyto roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie podstawiono kompletny MEM zawierający 10% FBS. Pozytywna Kontrola apoptozy składała się z komórek HeLa leczonych fotouczulającym pochodnym benzoporfiryny pierścieniem monoacid a (BPD-MA) przez 1 godzinę, a następnie wystawionych na działanie światła widzialnego, jak opisano wcześniej (22, 23). Kultury zbadano i zebrano w 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, i 12 h po zakażeniu. Komórki przemyto dwa razy w zimnym PBS i lizowano w 1 ml buforu do lizy (20 mm Tris , 137 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% Nonidetu P-40, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 0,15 U aprotyniny na ml) na 75 cm2 powierzchni hodowli. Po 20-minutowej inkubacji na lodzie supernatanty zebrano po odwirowaniu w temperaturze 10 000 ×g i przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych analiz biochemicznych.

czasowy wzorzec produkcji białek wirusowych CVB3, wirusa potomnego i ewolucji zmian morfologicznych zwyrodnieniowych komórek HeLa rozważano w połączeniu z badaniem białek śmierci komórek gospodarza. Próbki lizatu komórkowego rozdzielano elektroforezą w żelu poliakrylamidowym siarczanu dodecylu sodu. Białka przenoszono do nitrocelulozy (Hybond ECL nitrocelulose membranes; Amersham). Membrany inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w buforze blokującym (PBS z 0,1% Tween 20 i 5% sproszkowanego mleka beztłuszczowego). Po dwóch praniach w buforze myjącym (PBS z 0.1% Tween 20), membrany inkubowano z przeciwciałem przeciwko cvb3 (króliczy poliklonalny anty-cvb3, 1:1000; dokładne chemikalia). Membrany przemyto trzy razy w buforze do płukania i inkubowano z przeciwciałem wtórnym przeciw immunoglobulinie oślej anty-króliczej (Amersham). Membrany przemyto trzykrotnie, a sprzężone z peroksydazą chrzanu immunoglobuliny wtórne wykryto metodą enhanced chemiluminescence method (ECL, Amersham) i wystawiono na działanie filmu Autoradiograficznego Hyperfilm (Amersham). Znaczny wzrost syntezy białek wirusowych można wykryć między 3 a 5 h po zakażeniu (Fig.1B). Proteazy wirusowe rozszczepiają wirusowe, jak również białka gospodarza wcześnie po zakażeniu. Na podstawie analizy immunoblot z użyciem mysich monoklonalnych anty-eIF4G (1: 1000; laboratoria Transdukcyjne) stwierdzono, że eIF4G jest rozszczepiany przez proteazę wirusową 2A w ciągu 1 h po zakażeniu, z dalszą utratą wykrywalności białka 220-kDa przez 5 h po zakażeniu (Fig. 1C). Ilość cvb3 w supernatancie komórkowym (uwalnianym wirusie) oznaczono na monowarstwach komórek HeLa metodą oznaczania płytki nakładkowej agaru, jak opisano wcześniej (3). Krótko mówiąc, próbkę supernatantu rozcieńczano seryjnie 10-krotnie, rozcieńczenia nakładano na 90 do 95% monowarstw łączących komórki HeLa w płytkach sześciostopniowych (Costar), a nakładane komórki inkubowano przez 1 h (5% CO2, 37°C). Nośnik zawierający niebotyczny wirus został usunięty, a w każdej studzience nałożono ciepły kompletny MEM zawierający 0,75% agaru. Płytki inkubowano przez 36 do 48 godzin (5% CO2, 37°C ), utrwalono utrwalaczem Carnoya (95% etanol–kwas octowy) i zabarwiono 1% fioletem krystalicznym. Wirus potomny był obecny w supernatancie na poziomie podstawowym między 1 a 5 godziną. po 6 godz. po zakażeniu nastąpił wykrywalny wzrost poziomu wirusa supernatantu, a wykładnicza produkcja wirusa rozpoczęła się po 9 godz. po zakażeniu, co określono za pomocą testów płytki nazębnej (Fig. 1a). Komórki HeLa wykazywały znaczne zmiany w morfologii, w tym kondensację komórkową, zaokrąglanie i uwalnianie z monowarstwy hodowlanej, między 6 a 7 godziną po zakażeniu, jak zauważono w mikroskopii kontrastowej (Fig. 1D).

w celu ustalenia, czy mechanizm śmierci komórek gospodarza jest aktywowany po zakażeniu cvb3, przeprowadzono analizę immunoblotową lizatu zebranego w określonych punktach czasowych. Kaspaza 3, obecna w komórkach jako białko prekursorowe o masie cząsteczkowej 32 kDa, jest pierwotną cząsteczką biorącą udział w realizacji śmierci komórki. Stosując monoklonalną anty-kaspazę 3 Myszy (1:1000; laboratoria Transdukcyjne), ustalono, że niezakażone komórki zawierały białko prekursorowe 32-kDa. Po zakażeniu CVB3 poziom białka prekursorowego 32-kDa zaczął zmniejszać się między 7 a 8 h po zakażeniu i był prawie całkowicie niewykrywalny przez 12 h po zakażeniu (Fig.2). W celu ustalenia, czy zubożona Pro-kaspaza 3 została proteolitycznie przetworzona z jednołańcuchowego zymogenu do aktywnego dwułańcuchowego enzymu, lizaty komórek HeLa inkubowano z fluorescencyjnymi substratami kaspazy 3, jak opisano wcześniej (23). Krótko, lizaty komórkowe inkubowano z buforem reakcyjnym (20 mm Tris , 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% glicerol) zawierającym 100 µM substratu kaspazy 3 Acetylo-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-metylokumaryna (Ac-DEVD-AMC) (Calbiochem, Cambridge, Mass.) lub Z-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-trifluorometylokumaryna (z-DEVD-AFC) (Enzyme Systems Products, Livermore, Calif.). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny, a wzbudzenie fluorescencyjne AMC lub AFC przy odpowiednio 380 lub 400 nm mierzono odpowiednio przy 460 lub 505 nm cytofluorometrem 2350 (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Kanada). Stosując to podejście, aktywność kaspazy 3 była widoczna przez 5 godzin po zakażeniu. Zwiększenie aktywności kaspazy 3 z 7 do 10 h po zakażeniu, po osiągnięciu maksymalnego poziomu aktywacji, utrzymywało się do 12 h po zakażeniu (Fig. 2). Ten test proteazy wykazał, że kaspaza 3 jest w aktywnej postaci w zakażonych komórkach i że jest zdolna do proteolitycznego przetwarzania innych kaspaz i substratów.

Kaspaza 3 rozszczepia specyficzne substraty przy resztach kwasu asparaginowego (42). Wykazano, że PARP, białko jądrowe zaangażowane w naprawę DNA (13, 69), jest substratem aktywowanej kaspazy 3, jak również innych kaspaz (35). W komórkach apoptotycznych PARP jest rozszczepiany z białka 116-kDa, dając fragmenty 85 i 25 kDa, oznaczane przeciwciałami odpowiednio dla końców aminowych i karboksylowych białka. W zakażonych CVB3 komórkach HeLa, degradację PARP, z pojawieniem się fragmentu 85-kDa, wykrywano przez 9 h postinfekcji, z dalszą redukcją poziomów peptydu 116-kDa przez 10 i 12 h postinfekcji, zgodnie z analizą immunoblot z monoklonalnym anty-PARP Myszy (1: 2000; Biomol) (Fig. 3).

DFF jest białkiem cytozolowym, które może być rozszczepione przez kaspazę 3 (37). Po rozszczepieniu białko to uwalnia endonukleazę, która migruje do jądra, gdzie może rozszczepiać DNA w miejscach internukleosomalnych, powodując fragmentację DNA (16). Wykazano wcześniej, że internukleosomalna degradacja DNA jest komórkową cechą zakażenia pikornawirusem (32). Jak określono za pomocą poliklonalnego anty-DFF królika (hojnie dostarczonego przez Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas), DFF jest rozszczepiany z białka 45-kDa, wytwarzając fragment 30-kDa rozpoczynający się o 9 h po zakażeniu, z ciągłym przetwarzaniem i utratą białka 45-kDa między 10 a 12 h po zakażeniu (Fig. 3).

w celu ustalenia, czy kaspazy bezpośrednio wytwarzają charakterystyczny CPE, który występuje po zakażeniu pikornawirusem lub jest aktywowany po zmianach morfologicznych, komórki leczono ogólnym inhibitorem kaspazy benzyloksykarbonylo-Val-Ala-ASP-fluorometyloketonem (ZVAD.fmk). Roztwór podstawowy (100 mM w dimetylosulfotlenku) ZVAD.fmk (Bachem) rozcieńczono w pełnym MEM do stężenia w zakresie od 0 do 200 µM, a rozcieńczenia inkubowano z komórkami przez 30 minut przed zakażeniem lub leczeniem światłem. Po zakażeniu CVB3 komórki przemyto PBS, A pełne MEM zawierające 10% FBS i świeży ZVAD.następnie podstawiono fmk (0 do 200 µM). Wykazano, że peptyd ten hamuje indukcję zmian morfologicznych przez wiele bodźców apoptotycznych (46, 54). ZVAD.fmk w stężeniach 50, 100 i 200 µM blokuje zarówno aktywność kaspazy, jak i rozszczepienie PARP i DFF W komórkach HeLa poddanych działaniu BPD-MA i światła (pozytywna Kontrola apoptozy) (Fig. 4). W zakażonych CVB3 komórkach HeLa inhibitor częściowo zapobiegał rozszczepieniu PARP i DFF w stężeniach 50 i 100 µM (Fig. 4). Przy najwyższym stężeniu inhibitora (200 µM) nie było dowodów na występowanie fragmentów rozszczepiania PARP lub DFF W komórkach leczonych CVB3 po 10 godzinach od zakażenia. Za zmiany morfologiczne obserwowane po indukcji apoptozy odpowiedzialne jest rozszczepienie kaspazy białek strukturalnych, takich jak aktyna, żelsolina, lamina B i ogniskowa kinaza adhezyjna (42, 45). Po 2 h po fotoaktywacji BPD-MA, komórki HeLa ulegały kondensacji, miały rozległe wyblaknięcie błony i uwalniały się z monowarstwy (Fig.5). W zwiększających się stężeniach ZVAD.fmk, ten apoptotyczny fenotyp nie był widoczny, a komórki utrzymywały morfologię podobną do morfologii komórek kontrolnych (Fig. 5). Zakażone CVB3 komórki HeLa ulegały kondensacji i uwalniały się z jednowarstwy, ale nie wykazywały wyblaknięcia błony po 10 godzinach od zakażenia (Fig. 5). Blokada aktywności kaspazy przez ZVAD.fmk w stężeniach do 200 µM nie zmieniało fenotypu cytopatycznego, mimo zahamowania rozszczepiania substratów (DFF i PARP).

klasyczną cechą wirusów z rodziny Picornaviridae jest komórkowy CPE po zakażeniu. Od czasu odkrycia techniki hodowli komórek pozaneuralnych do namnażania wirusa poliowirusa (17) odnotowano zmiany zwyrodnieniowe w morfologii komórek. Pierwszy opisany przez Robbinsa i wsp. (48) w 1950 r.te zmiany cytopatyczne obejmują skurcz jądrowy, kondensację chromatyny, zaokrąglenie komórek i uwolnienie z monowarstwy, z ewentualnym postępem do cytoplazmy acydofilnej, pyknozy jądrowej i fragmentacji chromatyny jądrowej (karyorrhexis) (47).

najnowsze zrozumienie mechanizmów śmierci komórek ustawia scenę dla badania białek śmierci komórek gospodarza i ich możliwej roli w CPE infekcji CVB3. Wiele wirusów hamuje lub aktywuje śmierć komórek, strategie, które przekazują charakterystyczne aspekty uszkodzenia komórek, odpowiedzi zapalne lub trwałość wirusa. Jak wspomniano powyżej, poprzednie badania nad pikornawirusem ujawniły cechy morfologiczne apoptotycznej śmierci komórek, w tym kurczenie się komórek, fragmentację DNA i kondensację jądrową (21, 32, 47).

Kaspaza 3, proteaza cysteinowa o homologii do białka CED-3 (77) theCaenorhabditis elegans, uważana jest za jedno z kluczowych białek biorących udział w etapie egzekucji komórki. Apoptoza wywołana przez wiele bodźców, w tym Fas, TNF, etopozyd, staurosporinę, terapię fotodynamiczną, promieniowanie jonizujące i odstawienie czynnika wzrostu, obejmuje przetwarzanie pro-kaspazy 3, a następnie aktywację (15, 23, 30, 33, 51). Począwszy od 7 do 8 godzin po zakażeniu CVB3, Pro-kaspaza 3 ulega wyczerpaniu, a testy aktywacji kaspazy wykazały, że białko to jest rozszczepiane do postaci aktywnej. Kilka białek może aktywować kaspazę 3, w tym kaspazę 8 (poprzez sygnalizację przez receptory TNF lub Fas) (55), granzyme B z limfocytów cytotoksycznych (62) i kaspazę 9 (poprzez uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c i montaż czynników aktywacji proteazy apoptotycznej) (36). Po aktywacji kaspaza 3 może degradować specyficzne substraty, co z kolei powoduje zmiany strukturalne i utratę homeostatycznej regulacji procesów komórkowych. Wykazano, że liczne białka są rozszczepiane przez aktywowane kaspazy. Zgodnie z aktywacją kaspazy 3, ZARÓWNO PARP, jak i DFF są rozszczepiane po zakażeniu CVB3. Aktywacja kaspazy i fragmentacja DNA są bezpośrednio powiązane poprzez rozszczepienie DFF (37). DFF jest ludzkim czynnikiem cytozolowym składającym się z dwóch podjednostek 45 i 40 kDa, z których większa rozkładana jest na mniejsze polipeptydy przez kaspazę 3. W ostatnich badaniach enari et al. (16) przy użyciu mysich komórek chłoniaka wyizolowano endonukleazę, Dnazę aktywowaną kaspazą (CAD). Mysi odpowiednik białka DFF wyizolowano i nazwano inhibitorem CAD (50). Kaspaza 3 rozszczepienie inhibitora CAD (DFF) umożliwia translokację jądrową CAD i degradację DNA. DFF jest rozszczepiany począwszy od 9 h po zakażeniu, w wyniku czego powstaje fragment 30-kDa (rys. 3) które mogą być dalej przetwarzane na fragment 11-kDa (37). PARP znajduje się w jądrze i bierze udział w naprawie DNA. Rozszczepienie PARP rozpoczyna się po 9 h po zakażeniu, co sugeruje, że po aktywacji kaspaz w cytozolu są one w stanie uzyskać dostęp do substratów zlokalizowanych w jądrze.

należy zauważyć, hamowanie kaspazy z ogólnym inhibitorem kaspazy ZVAD.fmk nie zapobiegał CPE wywołanemu przez CVB3 w następstwie zakażenia. W okresie od 6 do 7 godzin po zakażeniu CPE stało się widoczne w mikroskopie kontrastowym w naszym modelu infekcji CVB3. Czas pomiędzy zakażeniem a pojawieniem się CPE, obserwowany w mikroskopie kontrastowym, był zgodny w przypadku ZVAD.stężenia fmk od 50 do 200 µM. Oprócz tego, że nie wpływa na czas do CPE, ZVAD.w wyniku leczenia fmk uzyskano komórki o morfologicznym wyglądzie podobnym do komórek nieleczonych, zakażonych (Fig. 5). Zastosowaliśmy leczenie BPD-MA i światłem jako alternatywną metodę indukowania apoptozy w komórkach HeLa (22, 23). Hamowanie aktywacji kaspazy inhibitorem ZVAD.fmk zapobiegł fenotypowi apoptotycznemu (rys. 5). Z tych wyników wnioskujemy, że aktywność kaspazy i rozszczepienie substratów nie odpowiadają charakterystycznemu CPE powiązanemu z zakażeniem pikornawirusem, ale są aktywowane po zmianach morfologicznych.

punkt przecięcia wirusowego cyklu replikacyjnego i aktywacji szlaku śmierci komórek gospodarza pozostaje do ustalenia. Zakażenie pikornawirusem powoduje wkrótce zahamowanie komórkowej syntezy RNA i białek (19, 74). Wczesne badania związków między indukowanymi pikornawirusami zmianami metabolicznymi a indukowanym przez wirus CPE wykazały, że hamowanie syntezy białek i RNA nie było bezpośrednio związane ze zmianami morfologicznymi komórek (4). Inhibitory syntezy białek i RNA opóźniały śmierć komórek, ale komórki wykazywały mniej zmian morfologicznych niż komórki zakażone pikornawirusem (5). Hamowanie syntezy białek i RNA za pomocą jednego z wielu czynników, takich jak aktynomycyna D, puromycyna i Toksyna błonicy, powoduje apoptozę (39). Wczesne badania przeprowadzone w systemach infekcji poliowirusem wykazały, że puromycyna, inhibitor translacji zarówno białek wirusowych, jak i białek gospodarza, opóźnia wystąpienie zmian cytopatycznych, co sugeruje, że niektóre białka wirusowe mogą być bezpośrednio cytotoksyczne (4). Zwiększenie MOI prowadzi do szybszego początku CPE (niepublikowane obserwacje), chociaż prawie cała translacja białek gospodarza jest wyłączona w ciągu 3 godzin przy stosunkowo niskim MOI (25), takim jak ten używany w tym badaniu (MOI = 5). Niedawno wykazano, że białko 2B kodowane przez coxsackievirus i poliovirus wiąże się z frakcjami błon komórkowych, w tym plazmalemmą i retikulum endoplazmatycznym, i zakłóca ruch jonów, w tym ruch Ca2+ do cytozolu (1, 67). Napływ Ca2+ występuje w apoptozie (7, 44), ale nie jest jasne, czy napływ występuje przed aktywacją kaspazy, czy po jej aktywacji. Badając zapotrzebowanie jonowe kaspaz, ustalono, że stężenie jonów wapnia ma niewielki wpływ na aktywność kaspazy (56). Wczesny napływ wapnia po zakażeniu wirusem coxsackievirus może wynikać z wpływu białka 2B na przepuszczalność błony, a odnotowany duży późny napływ wapnia (>6 h po zakażeniu) (67) może być kolejnym efektem aktywacji kaspazy.

we wczesnych fazach infekcji korzystne byłoby dla wirusa hamowanie śmierci komórek gospodarza, umożliwiając w ten sposób maksymalną produkcję potomstwa wirusa. W późnych etapach cyklu życia wirusa korzystne byłoby również wywołanie apoptozy zamiast martwicy. Taki mechanizm śmierci jest potencjalnym środkiem uchylania się układu odpornościowego gospodarza przez wirusa podczas jego uwalniania do otaczającej tkanki. Apoptoza charakteryzuje się szybką fagocytozą dotkniętych komórek bez uwalniania prozapalnych cytokin (53).

wirusy wykazują interakcje na różnych poziomach szlaku apoptotycznego. Kilka gammaherpeswirusów (w tym ludzki herpeswirus 8 związany z mięsakiem Kaposiego), jak również nowotworowy mięczak zakaźny zawierają białka hamujące Flisy, które wchodzą w interakcje z białkiem adaptera FAS i konkurują o hamowanie rekrutacji kaspazy 8 i późniejszej aktywacji (61). Ekspresja wirusa ospy krowiej serpin CrmA blokuje aktywację za pośrednictwem kaspazy 8 kolejnych kaspaz, takich jak kaspaza 1 i kaspaza 3 (55). Białka IAP (dla inhibitorów apoptozy) stanowią rodzinę białek ulegających ekspresji przez bakulowirusy, które blokują apoptozę wywołaną infekcją wirusową lub przez kaspazę 1 (78). Ponadto odkryto kilka homologów wirusowych z rodziny białek Bcl-2(2, 8, 20, 70). Adenowirus (9, 20, 57), wirus afrykańskiego pomoru świń (41) i wirus Epsteina-Barr (26, 41, 59) kodują białka (odpowiednio E1B-19K, LMWS-HL i BHRF1), które wykazują homologię sekwencji do genów pro-survival rodziny Bcl-2.

identyfikacja białek wirusowych, które bezpośrednio indukują apoptozę, nie jest tak szeroko udokumentowana jak identyfikacja białek wirusowych, które hamują śmierć komórek. Lentywirusy ludzkiego wirusa niedoboru odporności i ludzkiego wirusa białaczki limfocytów T typu 1 kodują regulatory transkrypcji Tat i Tax, które, jak wykazano, zwiększają ekspresję ligandu Fas, zmniejszając ekspresję członków rodziny Bcl – 2 (79, 80). Ludzkie kodowane adenowirusem produkty genów E1A, E3 i E4 powodują śmierć komórki po ekspresji w hodowli komórkowej. Geny powodujące śmierć adenowirusa ulegają ekspresji pod koniec cyklu infekcji i ostatecznie przytłaczają kodowane przez wirusa geny hamujące śmierć (38).

nasze dane pokazują, że aktywacja kaspazy 3 następuje, a nie poprzedza, wywołane cvb3 zwyrodnieniowe zmiany morfologiczne w zakażonych komórkach HeLa. Aktywowane kaspazy przetwarzają specyficzne substraty, w tym PARP i DFF. Hamowanie aktywności kaspazy nie eliminuje jednak wyglądu morfologicznego (CPE) komórek zakażonych wirusem, co określono za pomocą mikroskopii kontrastowej. Przetwarzanie kaspazy i rozszczepianie substratów może mieć istotne znaczenie dla ostatecznej zmiany prawidłowych procesów homeostatycznych w zakażonych komórkach i może ułatwiać ostateczne usuwanie komórek zakażonych wirusem. Wirusowe proteazy 2A, 3C i 3CD mogą rozszczepiać specyficzne białka strukturalne, powodując zmiany morfologiczne zgodne z CPE, w sposób analogiczny do działania kaspaz, które rozszczepiają oddzielne substraty w celu uzyskania odrębnego fenotypu apoptotycznego.

• Copyright © 1998 American Society of Microbiology