Abstract

een directe en zeer specifieke chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay (CL-ELISA) methode voor de monitoring van chlooramfenicol (CAP) in cosmetica is ontwikkeld. Het anti-chlooramphenicol antilichaam (mAb) dat in dit werk voor directe immunoassay wordt goedgekeurd kon specifiek aan GLB, met verwaarloosbare kruisreactiviteit (CR) (minder dan 0.01%) met de meeste GLB-analogen, met inbegrip van structureel verwant thiamphenicol (TAP) en florfenicol (FF) binden. De detectielimiet (Lod), gemeten met IC10, was 0,0021 ng mL−1. Het detectiebereik (IC20-IC80) varieerde van 0,00979 tot 0,12026 ng mL−1. In spiked-cosmeticamonsters varieerde de gemiddelde terugvindingen van 82,7% tot 99,6%, met een intraday-en interday-variatie van respectievelijk minder dan 9,8% en 8,2%. Bovendien, met de hulp van HRP-geëtiketteerde anti-GLB mAb, zou de methode in snelle directe immunoreaction wijze kunnen worden verwerkt. Deze CL-ELISA methode kan worden toegepast voor specifieke, snelle, semiquantatieve en kwantitatieve detectie van CAP in cosmetica, het vergemakkelijken van de nauwkeurige kwaliteitscontrole van Cap verontreiniging.

1. Inleiding

chlooramfenicol (CAP) is een lid van de amphenicol-familie van antibacteriële middelen, en ze werden geproduceerd door Venezolaanse streptococcus (structuur weergegeven in Figuur 1) . Chlooramphenicol wordt gewoonlijk uitgevoerd als breedspectrumantibioticum met efficiënte antimicrobial activiteit. Het kan gewoonlijk tegen een verspreide verscheidenheid van grampositieve en gramnegatieve bacteriën, met inbegrip van de anaërobe organismen zijn . Wegens de hoge activiteit, wordt chlooramfenicol wijd toegepast in vee, aquicultuur, en schoonheidsindustrieën voor de preventie en behandeling van bacteriële besmetting. In recente publicaties, werd chlooramphenicol gemeld om voor de behandeling van epifolliculitis, acne, en andere huidvoorwaarde te worden gebruikt. Chlooramphenicol werd ook wijd goedgekeurd in schoonheidsmiddelen als antiseptisch om de groei van micro-organismen te remmen .

figuur 1

recente onderzoeken hebben echter aangetoond dat amphenicol-antibiotica potentieel nadelige effecten voor de menselijke gezondheid vertonen . Daarom zijn de toepassingen van chlooramfenicol verboden in vele landen, met inbegrip van EU-leden, de VS, en China . Hoewel er officiële voorschriften voor deze antibiotica zijn, wordt chlooramfenicol nog steeds illegaal toegevoegd aan cosmetica, vanwege de lage kosten en uitstekende antibacteriële werking. Om de veiligheid van schoonheidsmiddelen te verzekeren en de menselijke gezondheid te behouden, is het emergent om gevoelige, betrouwbare en beschikbare methodes voor chlooramfenicolopsporing op het volgen van niveaus in schoonheidsmonsters te ontwikkelen.

Er zijn talrijke analysemethoden gerapporteerd voor CAP en aanverwante antibioticadetectie, zoals hogedrukvloeistofchromatografie ( HPLC) , gaschromatografie (GC) en vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS). Deze methoden vereisen echter vooral dure instrumenten, ingewikkelde voorbehandelingsprocedures en goed opgeleid personeel, en ze waren niet geschikt voor het snel screenen van een groot aantal monsters. Immunoassays hoofdzakelijk gebaseerd op antilichaam-antigeen specifieke erkenning werden goedgekeurd voor high-throughput en snelle screening van doelanalytes. Chemiluminescent substraat met hoog-gevoeligheidskarakter zou in een direct chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay (CL-ELISA) platform kunnen worden aangewend. Vergeleken met conventionele colorimetrische protocollen, zou de gevoeligheid van immunoassays met minstens 2~3 keer met chemiluminescent als substraat kunnen worden verbeterd.

eerdere literatuur over immunoassay detectie van CAP kan CAP niet onderscheiden van zijn analogen uit de amphenicol familie (figuur 1), waaronder thiamfenicol (TAP) en florfenicol (FF), vanwege de zeer brede specifieke antilichamen . In deze onderzoeken is het moeilijk om te bepalen of de verontreinigingskap, de analogen ervan of de som ervan bij een positief resultaat. In dit onderzoek, gebruikten wij een hoog-specifiek anti-cap monoclonal antilichaam (mAb) dat aan GLB specificiteit en verwaarloosbare CR waarden voor de meeste geteste analogen kan binden. Op basis van deze zeer mAb werd een zeer specifieke en directe CL-ELISA methode ontwikkeld voor de bepaling van sporen van CAP in cosmetica. Dit ontwikkelde protocol vereist geen complexe indirecte vervoegingsreactie met HRP-geëtiketteerd secundair antilichaam. Bij chemiluminescent substraat zou de gevoeligheid aanzienlijk kunnen worden verbeterd (schematisch schema weergegeven in Figuur 2). Met het gebruik van HRP-geëtiketteerde anti-CAP mAb, werd de analyse uitgevoerd in snelle directe immunoreaction wijze zonder complexe immunoreaction procedures. Deze CL-ELISA methode kan worden toegepast voor specifieke, snelle, semiquantatieve en kwantitatieve detectie van CAP in cosmetica, en dit werk zal bijdragen aan de kwaliteitscontrole en regulering van CAP.

Figuur 2

2. Materialen en methoden

2.1. Chemische stoffen en reagentia

chlooramfenicol (CAP), ciprofloxacine (CIP), florfenicol, (FF), penicilline (PEN), ractopamine (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiazine (SUL) en thiamfenicol (TAP) normen werden gekocht bij Sigma Aldrich (99% zuiverheid, St.Louis, MO, USA). Cap-geconjugeerd antigeen en HRP-gelabeld cap antilichaam werden verkregen uit ZeYang Co. (Peking, China). SuperSignal chemiluminescence substrate solution werd gekocht bij Thermo Fisher (USA). Milli-Q synthese systeem werd verkregen uit Millipore (Bedford, MA, USA) voor waterzuivering. Andere reagentia (analytische kwaliteit) werden gekocht bij Beijing reagens Corp. (Beijing, China).

2.2. Apparatuur en instrumentatie

costar witte opake 96-wells polystyreen microtiterplaten (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) werden gebruikt in dit werk. SpectraMax M5 microplaatlezer werd verkregen uit moleculaire apparaten (CA, USA). MIKRO 22R centrifuge werd verkregen van Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Duitsland).

2.3. Buffers en oplossingen

voor deze ontwikkelde CL-ELISA-test werden verschillende buffers en oplossingen bereid voor immunoassay.

fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, 0,01 M, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4 en 0,2 g KCl werden opgelost in 1 L gedeïoniseerd water.

Blokkeringsbuffer (pH 7,4): 0,5% caseïne in 0,01 M PBS.

Coatingbuffer (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3 en 2,93 g NaHCO3 werden opgelost in 1 L gedeïoniseerd water.

Enzymverdunningsbuffer (pH 7,4): 5% foetaal runderserum in 0,01 M PBS.

Wasbuffer (PBST): 0,01% Tween-20 in 0,01 M PBS.

2.4. Competitieve Chemiluminescente ELISA (CL-ELISA) Procedure

costar witte ondoorzichtige 96-wells polystyreen microtiterplaten werden gebruikt voor immunoassay reactie. 100 µL cap-geconjugeerd antigeen werd opgelost in coatingbuffer in een eindconcentratie van 0,00042 ng mL−1, die werd toegevoegd en geïncubeerd bij 4°C gedurende 20 uur voor coating. Na driemaal wassen met wasbuffer werd aan elk putje een blokkeringsbuffer (150 µL per putje) toegevoegd en geïncubeerd om gedurende 1,5 uur overtollige actieve plaatsen bij 37°C te bezetten. de beklede platen werden vóór gebruik bij 4°C bewaard.

voor de CAP-analyse werden de gecoate microtiterplaten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voorgeconditioneerd. Vervolgens werden 30 µL verwerkte monsters of CAP-standaard en 70 µL HRP-gelabeld anti−cap antilichaam (2,46 ng mL−1) verdund door enzym verdunning buffer toegevoegd aan elk putje op zijn beurt. De platen werden gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd voor directe concurrentiereactie. Na het vijfmaal wassen van de plaat met wasbuffer werd een supersignale chemiluminescentiesubstraatoplossing (100 µL/putje) toegevoegd en werd de chemiluminescentieintensiteit van elk putje gemeten met een SpectraMax M5 microplaatlezer.

2.5. Standaardcurve

tien verschillende concentratieniveaus werden getest voor de evaluatie van kalibratiecurves. De hoogste concentratie was 1000 ng mL-1 en de volgende concentraties werden achtereenvolgens verdund met een derde van de vorige. Elke concentratie werd driemaal uitgevoerd volgens het CL-ELISA-protocol.

B / B0 is gedefinieerd voor de chemiluminescentieverhouding van de resultaten. B staat hier voor de chemiluminescentieintensiteit van verschillende cap-standaardconcentraties en B0 staat voor chemiluminescentieintensiteit zonder CAP-standaard in elke test.

Standaardcurves werden geëvalueerd door B/B0 uit te zetten bij verschillende cap-standaardconcentratie en de gegevens toe te passen op de volgende logistische vergelijking met vier parameters met gebruikmaking van Origin (versie 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA):in deze vergelijking staat A voor de bovenste asymptoot (chemiluminescentieverhouding B/B0 zonder CAP-standaard). B is de helling van de kromme op het buigpunt. C, die 50% van de maximale absorptie vertegenwoordigt, is de x-waarde op het buigpunt. En D is de onderste asymptoot (achtergrondsignaal).

2.6. Monstervoorbereiding voor CL-ELISA analyse

Cosmeticamonsters (2,00 g ± 0,02 g) werden nauwkeurig gewogen en overgebracht in 50 mL polypropyleen centrifugebuizen. Vervolgens werd 20 mL PBS toegevoegd en gedurende 30 s vortexed, en vervolgens gedurende 3 min ultra-sonication voor de extractie van CAP. Elk monster werd gecentrifugeerd bij 12000 g gedurende 10 min bij 4°C, en het supernatans werd verzameld en gefilterd door een membraan van 0,22 µm. Dertig microliter aliquots van het supernatans van elk monster werden toegevoegd aan een gecoate 96-wells plaat voor analyse volgens de ontwikkelde CL-ELISA procedure.

2.7. Nauwkeurigheid en precisie

negatieve primer lotion cosmeticamonsters werden eerder bevestigd door UPLC-MS/MS-analyses. Vervolgens werd elk monster verrijkt met CAP−standaard in drie verschillende concentraties van 5, 20 en 100 ng L-1. De analyse werd verwerkt volgens het ontwikkelde CL-ELISA protocol met elk vijf replicaten (n = 5). De concentraties van de monsters werden berekend volgens de kalibratiekromme en de nauwkeurigheid en precisie werden beoordeeld op basis van de terugvindingen van alle monsters.

3. Resultaten en discussie

3.1. De specificiteit van de methode werd bepaald door de mate van kruisreactiviteit (CR) met structureel verwante verbindingen van CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL en TAP te evalueren. De CR-waarden werden geëvalueerd met de volgende vergelijking:In deze vergelijking is IC50 de halfmaximale remmende concentratie van een stof. De specificiteitsresultaten van de anti-CAP mAb werden weergegeven in Tabel 1. Uit de resultaten werden verwaarloosbare CR-waarden (minder dan 0,01%) verkregen voor alle in dit onderzoek onderzochte analogen, inclusief de meest structuurgerelateerde TAP en FF. Men kan concluderen dat deze ontwikkelde CL-ELISA analyse voor specifieke GLB opsporing zou kunnen worden toegepast.

Analogue IC50 (ng mL−1) CR (100%) CAP 0.034 100 TAP >1,000 <0.01 FF >1,000 <0.01 SAL >1,000 <0.01 RAC >1,000 <0.01 SUL >1,000 <0.01 CIP >1,000 <0.01 PEN >1,000 <0.01

Table 1

IC50 and cross-reactivity (CR) value of cap analogen.

3.2. Optimalisatie van de CL-ELISA Procedure

de verhouding antigeen / antilichaam in een competitief reactiesysteem beïnvloedt de immunoreactie significant. In dit CL-ELISA-protocol werd de antigeen-antilichaamverhouding geëvalueerd en geoptimaliseerd. Verhouding antigeen / antilichaam van 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, en 30: 70 werden onderzocht. De resultaten werden geoptimaliseerd volgens IC50 en RLUmax (maximale relatieve lichteenheden) en weergegeven in Tabel 2. De IC50-waarde nam significant toe met toenemende antilichaamverhouding. Wanneer de antigeen-antilichaamverhouding 70:30 was, werd het gevoeligste resultaat met de laagste IC50-waarde verkregen. Bovendien leidde een hoog percentage antilichamen tot een hoge rlumax-waarde. Voor de geteste antigeen / antilichaamverhoudingen waren alle RLU-waarden echter geschikt voor de detectie van CAP. Vanwege de hoge gevoeligheid van chemiluminescent substraat was er geen duidelijk verschil in de RLUmax-waarde. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. Gevoeligheid

IC50, LOD (gemeten door IC10), en het detectiebereik (IC20−IC80) werden verkregen uit de sigmoidale kalibratiecurve om de gevoeligheid van het voorgestelde CL-ELISA-protocol te evalueren (Figuur 3). In dit onderzoek was LOD 0,0021 ng mL−1 terwijl de IC50−waarde 0,016 ng mL-1 was voor CAP. Het detectiebereik van deze methode was 0,00979−0,12026 ng mL-1. Vergeleken bij gevestigde immunoassays, vertoonde deze methode hogere gevoeligheid en lagere LOD voor GLB .

Figuur 3

3.4. Nauwkeurigheid en precisie

voor nauwkeurigheids-en precisieonderzoek werden eerst de terugvindingen van de dop in verrijkte monsters berekend. En de nauwkeurigheid en precisie werden geëvalueerd met vijf replicaten elk op drie validatiedagen. Bij drie verrijkte niveaus van 5, 20 en 100 ng L-1 varieerde de gemiddelde terugvinding voor CAP in monsters van verrijkt primer lotion cosmetica van 82,7% tot 99,6%. Intraday en interday variatie waren minder dan respectievelijk 9,8% en 8,2% (resultaten werden getoond in Tabel 3).

Analyte Spiked level (ng L−1) Recovery (%) Intra-day variation (%) Inter-day variation (%) CAP 5 82.7−99.6 9.8 8.2 20 85.3−98.9 7.9 6.4 100 88.6−96.9 6.1 5.5

Tabel 3

4. Conclusies

In dit onderzoek werd een nieuwe en zeer gevoelige CL-ELISA methode voor CAP detectie in cosmetica ontwikkeld. MAb die in de analyse wordt gebruikt vertoonde hoge specificiteit aan GLB met verwaarloosbare CR-waarden aan zijn analogen, vooral voor de meeste structuur verwante kraan en FF. Op basis van deze mAb zou de voorgestelde CL-ELISA methode kunnen worden toegepast voor de detectie van CAP specifiek in plaats van mengsels van CAP en andere analogen. Dit is het eerste rapport van een CL-ELISA voor de bepaling van CAP in cosmetica. De LOD-methode was 0,0021 ng mL-1, IC50 was 0,016 ng mL−1 en het detectiebereik was 0,00979−0,12026 ng mL−1. In spiked cosmeticamonsters varieerde de gemiddelde recovery van 82,7% tot 99,6%, waarbij de intraday-en interday-variatie respectievelijk minder dan 9,8% en 8,2% bedroeg. De analyse biedt de voordelen van hoge specificiteit, eenvoud, snelle analysetijden, en kosteneffectiviteit. Met betrekking tot de gevoeligheid en specificiteit is de ontwikkelde CL-ELISA methode superieur aan de meeste gerapporteerde immunoassays voor CAP detectie. Men kan concluderen dat deze ontwikkelde CL-ELISA methode voor specifieke, snelle, semiquantative, en kwantitatieve opsporing van GLB in schoonheidsmiddelen kan worden toegepast.

beschikbaarheid van gegevens

de gegevens die zijn gebruikt ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn op verzoek verkrijgbaar bij de overeenkomstige auteur.

belangenconflicten

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

We willen LetPub bedanken (www.letpub.com) voor het verlenen van taalkundige bijstand bij de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het National R&D Key Programme of China (no. 2017YFE0110800), de National Natural Science Foundation of China (no. 31871718), en de EU Horizon 2020 Research and Innovation action (no. 727864-EU-China-Safe).