de schimmel Candida guilliermondii is wijd verspreid in de natuur, inclusief de humane microbiota van de huid en de mucosale oppervlakken.Hoewel deze soort een verminderde virulentie vertoont in vergelijking met andere Candida-soorten,3 wordt het momenteel beschouwd als een opkomende ziekteverwekker, met een belangrijke incidentie in Latijns-Amerika.18C. guilliermondii is erkend als het etiologische agens van een breed scala aan klinische infecties, waaronder gedissemineerde infecties voornamelijk bij immunogecompromitteerde patiënten,22 en nosocomiale uitbraken bij operatiepatiënten met intravasculaire hulpmiddelen.Momenteel omvat de aanbevolen behandeling voor invasieve candidiasis bij neutropene patiënten caspofungine (CFG) of micafungine (MFG) als eerstelijnsbehandelingen, waarbij liposomale amfotericine B (LAMB) en anidulafungine (AFG) alternatieven zijn, terwijl fluconazol (FLC) alleen wordt aanbevolen wanneer de gevoeligheid voor dit geneesmiddel wordt bevestigd.Verscheidene studies hebben echter aangetoond dat C. guilliermondii een verminderde gevoeligheid heeft voor FLC8,15 en 19 en therapeutisch falen geassocieerd met isolaten met hoge amfotericine B (AMB) minimale remmende concentraties (MICs) zijn gemeld.9,12,24 hoewel bijna 90% van de isolaten Echinocandinen MICs vertoont die gelijk zijn aan of lager zijn dan klinische breekpunten (CBP) van gevoeligheid (2µg/ml),17 vergelijkbaar met andere soorten Candida, zoals C. parapsilosis, vertonen sommige isolaten van C. guilliermondii MICs aanzienlijk hoog.8,15 beschikbare gegevens over de werkzaamheid van AFG bij invasieve candidiasis zijn beperkt en de mogelijke rol van dat geneesmiddel in de klinische praktijk is slecht bekend.23 in dit verband kan dieronderzoek een belangrijke rol spelen voor een beter begrip van de in vitro–in vivo correlatie.11 daarom was ons hoofddoel om de in vitro en in vivo activiteiten van AFG tegen verschillende isolaten van C. guilliermondii te evalueren, waarbij de resultaten werden vergeleken met die van AMB en FLC.
materialen en methodenfungale isolaten
vier klinische isolaten van C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 en UTHSC 10-3207) werden gebruikt in de in vitro studie en twee van hen (UTHSC 11-685 en UTHSC 11-142) werden geselecteerd voor het muriene model op basis van hun verschillende in vitro gevoeligheden. De isolaten werden geïdentificeerd door het interne getranscribeerde spacer (ITS) gebied en de D1–D2 domeinen van de rRNA te rangschikken, waarbij de sequenties met die van de typestam van deze soort werden vergeleken.
in vitro studies
de in vitro gevoeligheid van de vier stammen voor AMB, FLC en AFG werd geëvalueerd met behulp van een referentiebouillon microdilutie methode,waarbij 6Candida parapsilosis ATCC 22019 en Candida krusei ATCC 6258 als kwaliteitscontrole werden opgenomen.
Time-kill curven werden ontwikkeld voor alle stammen volgens eerdere studies.5,20 in het kort werd een stamoplossing van elk antischimmelmiddel bereid, AMB (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, USA) en AFG (Pfizer Inc., Madrid, Spanje) opgelost in dimethylsulfoxide en FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spanje)in gedestilleerd water. Verder werden verdunningen van het geneesmiddel bereid in 9 ml Standaard rpmi 1640 medium om concentraties van 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 en 32µg / ml van elk geneesmiddel. De isolaten werden 24 uur lang bij 35°C gesubcultureerd op aardappeldextrose agar (PDA) platen. Culturen van C. guilliermondii werden gesuspendeerd in een steriele zoutoplossing en de resulterende suspensies werden aangepast op 5×106 kolonievormende eenheden (CFU)/ml door hemocytometertellingen en door serieel plateren op PDA om de levensvatbaarheid te bevestigen. Verdunningen en controles (geneesmiddelvrij) werden geïnoculeerd met 1 ml van de schimmelsuspensies, resulterend in een begin entmateriaal van 5×105CFU / ml, en geïncubeerd bij 35°C. Een aliquot van 100µl van elke buis werd verzameld bij 0, 2, 4, 6, 8, 24, en 48 uur na inoculatie en verdund in gedestilleerd water; 30 µl daarvan werden gekweekt op PDA-platen en geïncubeerd bij 35°C gedurende 48 uur voor CFU/ml bepaling. Een afname van de CFU van ≥99,9% of 3 log10 eenheden ten opzichte van het begin entmateriaal werd als fungicide beschouwd, terwijl een afname van
log10 eenheden als fungistatisch werd beschouwd. De aantoonbaarheidsgrens was 50CFU / ml. Alle time-kill curve studies werden uitgevoerd in duplicate.In vivo studies
man van-1 muizen (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spanje) met een gemiddeld gewicht van 30 g werden gebruikt in het experiment. Muizen werden gehuisvest in standaarddozen met vrije toegang tot voedsel en water. Alle dierprocedures werden gecontroleerd en goedgekeurd door de Universitat Rovira i Virgili Animal Welfare and Ethics Committee.
muizen werden één dag vóór infectie neutropenisch gemaakt door een intraperitoneale (i.p.) injectie van 200 mg / kg cyclofosfamide (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Spanje) plus een intraveneuze (i.v.) injectie van 5-fluorouracil (Fluorouracilo; Ferrer Farma SA, Barcelona, Spanje) bij 150 mg/kg.10,14 op de dag van infectie werden muizen i.v. uitgedaagd met 1×108CFU/dier van elk van de twee stammen van C. guilliermondii, UTHSC 11-685 en UTHSC 11-142, in 0,2 ml steriele zoutoplossing in de laterale staartader.3,4
groepen van acht dieren werden willekeurig vastgesteld voor elke stam en elk geneesmiddel. De groepen werden als volgt behandeld: amfotericine B deoxycholaat (AMBd) (Xalabarder Pharmacy, Barcelona, Spanje) in doses van 0,8 mg/kg i.v. eenmaal daags (QD); liposomaal amfotericine B (LAMB) (Gilead Sciences S. A., Madrid, Spanje) at 10mg / kg i. v., QD; FLC (Pfizer Inc. , Madrid, Spanje) tegen 25 mg/kg oraal (p.o.) door middel van een maagsonde, tweemaal daags (BID); en AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Verenigd Koninkrijk) bij 10 mg / kg lichaamsgewicht / dosis i. p., QD. Alle behandelingen begonnen 24 uur na de uitdaging, en duurde 7 dagen. De controles kregen geen behandeling. Om bacteriële infecties te voorkomen, kregen alle muizen 5 mg/kg dag ceftazidim subcutaan van dag 1 tot 7 na infectie. Muizen werden dagelijks gecontroleerd en werden geëuthanaseerd op dag 8 na de infectie door CO2 anoxie. De werkzaamheid van elk geneesmiddel werd geëvalueerd door middel van weefsellastvermindering en histopathologische studies. De nieren werden aseptisch verwijderd, en één van hen werd gewogen en gehomogeniseerd in 2ml steriele zoutoplossing. Seriële 10-voudige verdunningen van de homogenaten werden op PDA geplateerd en gedurende 48 uur bij 35°C geïncubeerd voor de berekening van CFU/g. Voor de histopathologische studie werd de resterende nier gefixeerd met 10% gebufferde formaline, gedehydrateerd, ingebed in paraffine en gesneden in 2µm secties, die werden gekleurd met hematoxyline–eosine (H-E) en periodieke acid-Schiff (PAS) vlek voor onderzoek door lichtmicroscopie.
statistieken
kolonie tellingen van weefsel werden geanalyseerd met behulp van de Mann-Whitney u-test, met behulp van Graph Pad Prism 4.0 Voor Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Wanneer P-waarden lager waren dan 0,05 werden de verschillen statistisch significant geacht.
ResultsIn vitro studies
Mic ‘ s van AMB waren 0,25–1µg/ml, 0,06–0,25 µg/ml voor AFG en 0,5–1µg/ml voor FLC. Na de cut-offs van de gevoeligheid voor AMB, FLC en AFG tegen C. guilliermondii waren 16 alle isolaten gevoelig voor de drie geneesmiddelen. De gevoeligheden van de kwaliteitscontrolestammen lagen binnen de aanvaarde marges.6
de dodende kinetiek van AMB vertoonde een snelle fungicide activiteit die toenam met de geneesmiddelconcentratie. Bij concentraties die gelijkwaardig zijn aan de MIC, vertoonde dat geneesmiddel een fungicide werking tegen drie van de vier geteste isolaten (Fig. 1). Deze activiteit begon onmiddellijk na inoculatie bij concentraties boven 1µg/ml, waarbij het fungicide eindpunt na 4 uur bij 32µg/ml werd bereikt. AFG bij concentraties hoger dan 0,5 µg/ml vertoonde fungicide activiteit vanaf 4 uur incubatie. Het fungicide eindpunt werd bereikt na 12-24 uur incubatie bij 32µg / ml (Fig. 2). FLC vertoonde fungistatische activiteit tegen alle vier de isolaten (Fig. 3).
Time-doding kinetics assays van AMB tegen vier stammen van C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( □ ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, ( ▿ ) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg/ml, ( ● ) controle. Gestippelde lijnen geven een afname van de KVE van 3log10 eenheden in groei ten opzichte van het initiële entmateriaal (fungicide activiteit), stippellijnen geven de kwantificatielimiet van de test aan.
Time-doding kinetics assays van AFG tegen vier stammen van C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ ml, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( □ ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, ( ▿ ) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg/ml, ( ● ) controle. Gestippelde lijnen geven een afname van de KVE van 3 log10 eenheden in groei ten opzichte van het initiële entmateriaal (fungicide activiteit); stippellijnen geven de kwantificatielimiet van de test aan.
Time-doding kinetics assays van FLC tegen vier stammen van C. guilliermondii. ( ■ ) 0,03 µg/ mL, ( ▴ ) 0,12 µg/ml, ( □ ) 0,5 µg/ml, ( ● ) 1µg/ml, (Δ) 2µg/ml, (▿) 8µg/ml, ( ♦ ) 32µg/ml, ( ● ) controle. Gestippelde lijnen geven een afname van de KVE van 3log10 eenheden in groei ten opzichte van het initiële entmateriaal (fungicide activiteit), stippellijnen geven de kwantificatielimiet van de test aan.
In vivo studies
LAMB bij 10 mg / kg was het enige geneesmiddel dat in staat was de schimmelbelasting in de nieren van muizen die geïnfecteerd waren met elk van de twee stammen te verminderen, omdat de afname significant hoger was dan die van de andere therapieën (P≤0,04). AMBd en FLC konden slechts de weefsellast in muizen verminderen die met de stam worden besmet die de laagste MICs voor deze twee drugs toonde, d.w.z., 0.25 µg/ml voor AMB en 0.5 µg/ml voor FLC (p≤0.008). In het geval van AFG was de vermindering van de schimmelbelasting bescheiden en lager dan die van AMBd, en het verminderde significant de weefselbelasting in de nieren alleen met betrekking tot de controlegroep voor stam UTHSC 11-685 (P=0,002) (Fig. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 en FLC 50; cP0. 05 versus AFG 10 en FLC 50.
het histologische onderzoek toonde focale infiltratie van schimmelcellen aan in de nieren van onbehandelde dieren en bij muizen behandeld met AMBd, FLC of AFG. Nieren van muizen behandeld met lamsvlees vertoonden slechts een milde schimmelinvasie. Tekenen van necrose, ontstekingsreactie of veranderingen in parenchym werden noch waargenomen in de controlegroep, noch bij behandelde dieren (Fig. 5).
aanwezigheid van schimmelinfiltratie (zwarte pijl) in het niergedeelte van een controle muis geïnfecteerd met C. guilliermondii, 8 dagen na infectie (periodieke zure Schiff kleuring, vergroting 1000×). Bar = 10µm.
discussie
De in vitro studies toonden geen verminderde gevoeligheid aan van C. guilliermondii isolaten voor FLC of AFG. In overeenstemming met eerdere studies toonden de time-kill curves van AMB een concentratie-afhankelijke fungicide activiteit tegen alle isolaten, 4,5, 7 en FLC een fungistatisch effect ongeacht de geteste concentratie.Het is bekend dat AMBd een hogere werkzaamheid vertoont dan zijn lipidische formulering, vooral in de nieren, wanneer beide in dezelfde doses worden toegediend.1 farmacokinetische studies toonden echter aan dat na toediening van 0,75 mg/kg AMBd de Cmax van AMB bereikt in muizen serum 0,30 µg/ml was.25 echter, de AMB MIC van een van de twee geteste isolaten is hoger dan deze waarde; daarom hebben we een hoge dosis Lam gebruikt om hogere concentraties te bereiken.1 inderdaad, de toediening van lam met 10 mg / kg was effectief in het verminderen van de schimmelbelasting van beide stammen. Dit feit correleerde met dodende krommen, waar AMB zijn fungicide werking bereikte tegen de twee in vivo geteste isolaten, bij concentraties van 1µg/ml. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die een relatie probeerde vast te stellen tussen de dodende kinetiek en de in vivo experimentele werkzaamheid van AFG en FLC tegen klinische isolaten van C. guilliermondii. Er bestaat slechts een eerder onderzoek naar echinocandinen, met name naar caspofungine (CFG) bij gedissemineerde infectie door C. guilliermondii. CFG bij 1 mg / kg was effectief in het verminderen van de schimmelbelasting in de nieren bij muizen die geïnfecteerd waren met één stam van C. guilliermondii met een MIC van 8µg/ml, terwijl uit de tijd van het doden bleek dat er geen fungicide activiteit werd bereikt bij concentraties van 64µg/ml.4 omgekeerd, toonde onze studie een concentratie-afhankelijke activiteit van AFG, die bij 32µg / ml een fungicide activiteit, zoals eerder gemeld,17 bij 24h en bij 8µg/ml uitoefende. Eerdere studies meldden AFG-concentraties in serum en nieren van ongeveer 13 µg/ml na 7 dagen behandeling met doses van 10 mg/kg.21 hier kon AFG de schimmelbelasting in de nieren van neutropene muizen die geïnfecteerd waren met een van de twee geteste stammen, slechts bescheiden verminderen, wat niet gerelateerd lijkt te zijn aan het lage AFG MICs-verschil tussen de twee geteste stammen (1 verdunning), wat suggereert dat de respons op AFG-behandeling stamafhankelijk is. Op dezelfde manier kon FLC ook slechts de schimmelbelasting in de nier van muizen die met één van de twee stammen werden uitgedaagd enigszins verminderen,ondanks de toegediende dosis die serumconcentraties boven de MICs bereikte (2), wat ook niet verwonderlijk was vanwege zijn fungistatische activiteit.concluderend bleek uit ons onderzoek dat lamsvlees een hogere activiteit en werkzaamheid had tegen de twee stammen van C. guilliermondii, in tegenstelling tot het slechte effect van FLC en AFG. Er moeten echter verdere studies worden uitgevoerd met meer isolaten van C. guilliermondii, die een bredere reeks AFG-MICs vertegenwoordigen, om te beoordelen of er een verband bestaat tussen MIC-waarden en AFG-werkzaamheid.
belangenconflict
geen aan te geven.
