CPZ verzwakt ulcerosa onafhankelijk van TRPV1

Om de uitdaging van het mechanisme waarmee CPZ klysma ‘ s verzachten experimentele colitis, we geïnduceerde dextraansulfaat natrium (DSS), colitis ulcerosa in het wild-type (WT) en TRPV1-deficiënte muizen (elke groep n = 8). Hoewel er tegenstrijdige rapporten bestaan, ontwikkelden TRPV1-deficiënte muizen DSS-colitis en gewichtsverlies in dezelfde mate als de congenische WT-muizen in ons laboratorium, dat voldoet aan onze resultaten van het model van TNBS-colitis dat we eerder hadden gepubliceerd7,8,9,10,11,12. Voor CPZ klysma behandelingen gebruikten we dezelfde concentratie van CPZ (531 µM) die eerder werd gemeld om DSS (5%) colitis bij rats8 te verzwakken. Het verloop van colitis werd dagelijks gecontroleerd door middel van metingen van het lichaamsgewicht en endoscopie. Tweemaal daagse toepassingen van CPZ (531 µM) klysma ‘ s verzwakten DSS colitis in dezelfde mate in zowel WT als TRPV1−/− muizen, wat werd weerspiegeld door een verbeterde endoscopische score en verminderd verlies van lichaamsgewicht (Fig. 1A-C). H&e vlekken van het distale colon aan het einde van het 7-daagse DSS-experiment onthulden vernietigde mucosale weefselarchitectuur met talrijke infiltrerende immuuncellen in de colonen van de controlegroepen. Dit was in schril contrast met een wijd intact mucosa en de afwezigheid van significante immune celinfiltratie in de colons van CPZ-behandelde muizen van beide genotypes (Fig. 1D). In overeenstemming met deze bevindingen was de histologische score sterk verlaagd bij de met CPZ behandelde muizen van beide genotypen (Fig. 1E).

CPZ activeert TRPA1

De in vivo observatie dat CPZ klysma ‘ s colitis effectief remde bij TRPV1 nul mutant muizen stelde de vraag op TRPV1-onafhankelijke neuronale effecten van CPZ. Aangezien TRPA1 cruciaal bleek te zijn in verschillende ontstekingsmodellen,waaronder colitis6,12 en 14, hebben we getest of CPZ inwerkt op TRPA1.

CPZ-geïnduceerde Ionische stromen door hTRPA1

Patch clamp experimenten werden uitgevoerd in spanningsklem modus op HEK293t cellen die recombinant hTRPA1 uitdrukken (htrpa1-HEK293t cellen). Bij een houdingspotentiaal van -60 mV, veroorzaakte CPZ (10 µM) een binnenstroom die bijna volledig werd geremd (93% remming, n = 5) door de selectieve TRPA1-antagonist HC-030031 (HC, 10 µM) (Fig. 2 bis). In alle cellen waarin een CPZ-geïnduceerde inwaartse stroom werd geregistreerd, riep carvacrol (100 µM), een gevestigde TRPA1-agonist, ook grote inwaartse stromen op bij hetzelfde houdingspotentieel, wat de functionele expressie van hTRPA1 demonstreerde. Deze htrpa1-HEK293 cellen werden ook onderworpen aan spanningshellingen van -100 tot +100 mV van 400 ms duur elke 4 s (Fig. 2B). De CPZ-geïnduceerde, stroom-voltagerelatie vertoonde licht naar buiten gerichte rectificatie en een omkeerpotentiaal dicht bij 0 mV (Fig. 2C). De stromen opgeroepen door CPZ (10 µM) werden geremd door HC (10 µM). Het effect was meer uitgesproken bij negatieve potentialen (89% ± 5% remming bij -80 mV, gemiddelde ± SD, n = 7) dan bij positieve potentialen (80% ± 9% remming bij +80 mV).

CPZ-geïnduceerde calcium-influx door hTRPA1

selectieve werking van CPZ op TRPA1 werd bevestigd door gebruik te maken van de calcium microfluorimetrie techniek. hTRPA1-HEK293 cellen werden gestimuleerd door twee toepassingen van CPZ (50 µM) gedurende 10 s met intervallen van 5 minuten (Fig. 2D). De selectieve antagonisten HC (20 µM) en A-967079 (10 µM) werden gedurende 1 min voor en tijdens de eerste CPZ-test toegepast. De CPZ-respons werd door beide antagonisten volledig afgeschaft. Het is vermeldenswaard dat de verwijdering van HC leidde tot een instroom van calcium, waarschijnlijk als gevolg van resterende CPZ-actie, terwijl dit uit-effect afwezig was in het geval van A-967079, die langzamer kan losmaken (Fig. 2D). Vervolgens analyseerden we de concentratie-afhankelijkheid van CPZ-effecten. Toenemende CPZ concentraties (100 nM, 500 nM, 5 µM en 50 µM) werden toegepast op hTRPA1-HEK293 cellen gedurende 20 s elk met intervallen van 3 minuten. Beginnend met 100 nM, riepen alle concentraties van CPZ calcium transiënten op met steeds grotere amplituden (Fig. 2E). Carvacrol (100 µM) werd aan het eind van het experiment toegepast om functionele TRPA1-expressie te controleren, maar de carvacrolrespons na 50 µM CPZ was opvallend klein, wat kruis-desensibilisatie suggereert. Niet-getransfecteerde HEK293-cellen werden onderworpen aan dezelfde CPZ-toepassingen en alleen de hoogste geteste concentratie (50 µM) veroorzaakte een minimale toename van calcium. We verwachtten dat CPZ de drie kritische cysteïne residuen in het n-terminale domein van het kanaal zou betrekken omdat het een elektrofiele verbinding is. HEK293-cellen die WT hTRPA1 tot expressie brengen en cellen die de triple cysteine mutant hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) tot expressie brengen, werden onderworpen aan CPZ-toepassing (1 µM, 20 s), gevolgd door de niet-elektrofiele agonist carvacrol (100 µM, 20 s) en de hoogelektrofiele AITC (50 µM, 30 s). Ionomycine werd aan het einde van het experiment als positieve controle toegepast. De amplitude van de calcium transiënte opgeroepen door 1 µM CPZ was aanzienlijk verminderd (>80%) in cellen die hTRPA1-3C uitdrukken in vergelijking met cellen die WT hTRPA1 uitdrukken (Fig. 2F), terwijl het verschil in CPZ gevoeligheid tussen de genotypes werd afgeschaft bij 100 µM CPZ concentratie (Fig. 2G). De aitc-respons was afgenomen in de mutantcellen, terwijl carvacrol grote calciumion-transiënten opriep in zowel WT-als 3C-mutanten. Samen geven deze celreacties aan dat de relatief hoge potentie van CPZ afhangt van de drie kritische cysteines. Echter, wanneer de concentratie van CPZ 100 keer hoger is, nemen andere bindingsplaatsen de activering van hTRPA1 over. Deze hoge concentratie van lipofiele CPZ kon ook met het cellulaire lipidemembraan, indirect activerend TRPA1, zoals eerder getoond voor lipide een component van lipopolysaccharides16 in wisselwerking staan. Bovendien, in de aanwezigheid van de elektrofile scavenger N-acetyl cysteïne (NAC) bij een verzadigende concentratie (15 mM) 50 µM CPZ was niet in staat om enige reactie uit te lokken. Bij verwijdering van NAC, riep CPZ grote calcium transiënten op in de htrpa1-getransfecteerde HEK293t cellen (Fig. 2H) die bevestigt dat CPZ als elektrofiele agonist voor hTRPA1 dienst doet.

CPZ activeert een subpopulatie van aitc-gevoelige dorsale wortelganglion (DRG) neuronen

DRG-neuronen werden gehandhaafd in de primaire cultuur en onderzocht met calcium microfluorimetrie. Cellen werden gestimuleerd door CPZ (50 µM, 20 s), gevolgd door AITC (100 µM, 30 s), capsaïcine (CAP, 1 µM, 10 s) en KCl (60 mM, 30 s). Figuur 3A illustreert voorbeelden van DRG-neuronen die op al deze vier stimuli reageren. Een typische fractie van DRG-neuronen werd geactiveerd door AITC (301 van 906 neuronen, 33%, n = 8 muizen) wat wijst op functionele expressie van TRPA1. Een subpopulatie van deze aitc-gevoelige neuronen werd ook geactiveerd door CPZ (185 van 301 neuronen, 61%). De gevoeligheid voor CPZ was bijna volledig beperkt tot aitc-responsieve neuronen. Van in totaal 200 CPZ-gevoelige neuronen werden 185 (93%) ook geactiveerd door AITC, wat wijst op een sterke concordantie van gevoeligheden voor CPZ en AITC (Fig. 3). Zoals in het geval van HTRPA1-expressie hek293 cellen, de calcium transiënten opgeroepen door CPZ in DRG neuronen waren concentratie-afhankelijk met een EC50 waarde geschat op 30 µM CPZ en de kleine aitc respons na 100 µM CPZ suggereerde opnieuw kruis-desensibilisatie (Fig. 3B, C). Figuur 3D toont de overlapping van CPZ, CAP en AITC-responsiviteit in WT DRG neuronen bij bepaalde concentraties: 14% van de DRG neuronen reageerde op AITC maar niet op CAP (125/906), 16% reageerde op CAP maar niet op AITC, terwijl CPZ calcium transiënten induceerde in 78% van de neuronen die reageerden op zowel AITC als CAP (137 van 176). Om de specificiteit van de waargenomen effecten aan te tonen, werden TRPV1−/− en TRPA1−/− DRG neuronen blootgesteld aan het bovenstaande protocol. Ongeveer 90% van de TRPV1-deficiënte DRG-neuronen die aitc-gevoelig waren reageerden ook op CPZ( 509/572 cellen), terwijl geen van de 448 TRPA1-deficiënte DRG-neuronen getest calciuminvloed in reactie op CPZ (100 µM) toonde zoals geïllustreerd door representatieve voorbeelden in Fig. 3E, F.

systemische desensibilisatie door TRPA1 vermindert pijn

nadat we hadden ontdekt dat CPZ een krachtige TRPA1-agonist is, begrepen we waarom de eerste CPZ-klysma ‘ s (tweemaal daags) duidelijk pijnlijk waren bij de WT-muizen. Vervolgens kwantificeerden we het CPZ (531 µM) klysma-geïnduceerde nocifensieve gedrag bij gezonde dieren (elk n = 6) door het tellen van de kronkelende reacties en het registreren van visceromotorische reflexreacties (VMRs) via de geïntegreerde elektromyografie (EMG) van de buikspierwand (Fig. 4A, B). Tijdens het herhalen van de tweemaal daagse CPZ-behandelingen, merkten we op dat de TRPA1 knockouts op geen enkel moment pijngerelateerd gedrag vertoonden. Bovendien vertoonden de WT-muizen een progressieve afname van aanvankelijk sterke pijnreacties met een steile afname rond dag 3, wat leidde tot een uiteindelijk volledige desensibilisatie in beide nocifensieve parameters. Dit verlies van de waarneming van colonpijn bij normaal gesproken normale muizen verhoogde de verwachting dat de klysma ‘ s CPZ een farmacodynamische hoeveelheid zouden kunnen hebben geleverd die voldoende is om systemische hypoalgesie te induceren. Om deze hypothese te testen, gebruikten we de oog-veeg test met behulp van AITC (100 µM) en CAP (1 mM) (Fig. 4C, D) (n = 6). Beide tests toonden een duidelijke verzwakking van oog-veegtellingen in de WT muizen die waren behandeld met CPZ klysma ‘ s (tot 12-16 uur voor de test). Deze effecten werden hoogstwaarschijnlijk gemedieerd door TRPA1 desensibilisatie in plaats van TRPV1 blok, aangezien TRPV1-deficiënte muizen ongevoelig waren voor mosterdolie (aitc, 100 µM) instillatie in het oog in dezelfde mate als WT muizen (Fig. 4C). Vice versa, CPZ klysma ‘ s waren ineffectief in TRPA1−/− muizen, toen deze muizen werden uitgedaagd door CAP instillaties in het oog (Fig. 4D).

omdat herhaalde klysma ‘ s een onaangename toedieningsweg zijn, hebben we getest op een mogelijk anti-nociceptief effect van perorale CPZ (531 µM) in het drinkwater. Het drinken regime gedurende 10 dagen werd goed verdragen zonder duidelijke bijwerkingen optreden. In de loop van continue orale CPZ-toediening nam de latentie van paw-terugtrekking aan stralingswarmtestimulatie (Hargreaves-methode) geleidelijk toe in beide hindpaws (Fig. 4E). De tolerantietijd was ongeveer verdubbeld op dag 7 en bleef significant verhoogd van dag 2 tot 10. Na 2 weken herstel met zuiver drinkwater waren de onttrekkingslatenties weer terug op het basisniveau. De mechanische respons op stimulatie met de lineair toenemende kracht van een elektrodynamisch von Frey filament werd niet significant beïnvloed tijdens de tien dagen van CPZ drinken (Fig. 4F). De vraag rijst of de hitte en de chemische hypoalgesie een klasse-effect van het desensibiliseren van TRPA1-agonisten vertegenwoordigen of dat het specifiek voor CPZ was. Zo hebben we AITC toegediend in een vergelijkbare en goed verdragen concentratie (500 µM) via het drinkwater. Hetzelfde doseringsschema voor AITC zoals beschreven voor CPZ resulteerde in een progressieve toename van de pootonttrekkingslatentie voor stralingswarmtestimulatie die significant kleiner was dan degene die door CPZ werd geïnduceerd (Fig. 4E). De mechanische respons was niet veranderd onder het aitc-drinkregime (Fig. 4F).

CPZ veroorzaakt aanhoudende desensibilisatie van TRPA1/TRPV1 tot expressie brengende peptidergische sensorische neuronen

toen stelden we de vraag of de desensibilisatie van hele dieren door CPZ kon worden gereproduceerd op cellulair niveau. Daartoe voerden we calcium-imaging experimenten uit met geïsoleerde DRG neuronen die verkregen waren van controle muizen en van dieren die gedurende 7 dagen tweemaal daags behandeld werden met CPZ klysma ‘ s. Deze neuronen werden noodzakelijkerwijs gehouden in cultuur voor 16 tot 24 h, in aanwezigheid van NGF. Een totaal van 399 neuronen van controle muizen en 584 neuronen van klysma-behandelde muizen werden geladen met Fura-2 en calcium transiënten opgeroepen door AITC, carvacrol, CAP en een KCl-rijke oplossing werden geregistreerd. De reacties op deze TRPA1 (AITC en carvacrol) en TRPV1 (CAP)-agonisten verschilden niet significant bij DRG-neuronen van controledieren en met klysma behandelde dieren (Fig. S1). Echter, TRPA1 mRNA expressie (qPCR) was ongeveer twee vouwen upregulated in lumbosacrale DRG bereid onmiddellijk na de uiteindelijke CPZ klysma (Fig. S2) terwijl geen verandering in TRPA1-expressie werd gedetecteerd wanneer 24 uur in vivo was verstreken na de laatste klysma. TRPV1 mRNA veranderde niet onder beide omstandigheden. Aldus, had transcriptional upregulation van de TRPA1 genuitdrukking plaatsgevonden, wegens de veelvoudige klysma ‘ s CPZ, maar werd snel omgekeerd toen de CPZ-levering werd beëindigd. Onder DRG kweekomstandigheden, dezelfde epigenetische omkering had waarschijnlijk plaatsgevonden en alle resterende CPZ was waarschijnlijk uitgewassen, zodat er geen resterende desensibilisatie daadwerkelijk kon worden verwacht. Aangezien de cellulaire modellen niet de langdurige CPZ-geïnduceerde desensibilisatie van de gehele dieren in vivo weerspiegelden, zochten we naar een andere sterke indicator van het verrassende systemische effect. De meerderheid van de nociceptieve neuronen is peptidergisch, waarbij voornamelijk calcitonine-gengerelateerde peptide (CGRP) en substantie P (SP)15,17 tot expressie worden gebracht. Na depolarisatie, zoals door KCL en calcium influx, als gevolg van activering van voltage-gated calciumkanalen, worden deze neuropeptiden vrijgegeven van de zenuwvezels in een quasi-efferente functie (neurogene ontsteking). Aan de andere kant zijn geactiveerde TRP-kanalen op zichzelf zeer goede calciumgeleiders en hebben ze geen ondersteuning nodig door spanningsgesloten natrium-of calciumkanalen om vesiculaire exocytose van CGRP op te roepen 18. Aldus, kan de gestimuleerde versie van CGRP als index van (peptidergic) nociceptoractivering dienen. Op dezelfde manier hebben vasoactieve neuropeptiden verschillende effecten op het ontstekingsproces per se en de uitputting of desensibilisatie van de peptidergische sensorische neuronenpopulatie is aangetoond colitis19,20,21 te verzwakken. Om te bepalen of CPZ (531 µM) klysma ‘ s ongevoelig maken via TRPA1, lokaal en systemisch, gebruikten we geïsoleerde muisklieren en huidpreparaten. Colons van gezonde c57bl / 6 muizen (n = 8) werden blootgesteld aan CPZ (100 µM) die massale CGRP-afgifte induceerde (Fig. 5); latere toepassingen van AITC (100 µM) 5 min of 15 min na CPZ (Fig. 5A, B) kon niet meer CGRP-versie veroorzaken, die een diepgaande scherpe functionele kruis-desensibilisatie aan TRPA1-agonist suggereren. Dit effect kan niet te wijten zijn aan depletie, aangezien de daaropvolgende KCL (60 mM) respons normaal was. Dubbele punten van muizen die herhaaldelijk in vivo behandeld waren met CPZ (531 µM) klysma ‘ s, tweemaal daags gedurende 7 d, werden geïsoleerd en getest 12-16 uur na de laatste klysma. Noch CPZ (100 µM) noch AITC (100 µM) veroorzaakte CGRP-afgifte in deze toestand (Fig. 5C, D); met name CAP (30 nM)-geïnduceerde CGRP-vrijgave werd sterk verminderd, maar niet afgeschaft (Fig. 5E). In tegenstelling, KCL (60 mM)-geïnduceerde CGRP versie door niet-specifieke depolarisatie was niet alleen niet verminderd maar zelfs verbeterd na de CPZ klysma ‘ s. Dit wees erop dat de zenuwvezels van de dikke darm niet uitgeput waren van CGRP maar eerder overvol waren, maar in wezen op een duurzame manier ongevoelig waren voor chemische activatie door TRPA1 en TRPV1 (n = 6). Tenslotte toonde ook de huidvoorbereiding, geïsoleerd 12-16 h na de laatste CPZ klysma, dat AITC (100 µM) en CAP (1 µM)-geïnduceerde CGRP versie sterk verminderd in overeenstemming met de lichaamsbrede desensibilisatie waargenomen in de gedragstests (Fig. 5F, G, zie Fig. 4A-F) (n = 6).